GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合外周血細(xì)胞分析用于肺結(jié)核臨床診斷的效果

【摘要】 目的：觀察結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測（GeneXpert MTB/RIF）聯(lián)合外周血細(xì)胞分析用于痰涂片陰性可疑肺結(jié)核（TB）臨床診斷的效果。方法：選取吉安市第一人民醫(yī)院2022年10月—2023年9月收治的66例痰涂片陰性可疑TB患者。所有患者接受GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細(xì)胞分析檢測，對CD45+CD3+、CD4+CD45+及CD163+進(jìn)行分析，患者均經(jīng)痰培養(yǎng)及菌種鑒定是否為肺結(jié)核。分析GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細(xì)胞分析診斷痰涂片陰性可疑TB的價(jià)值。結(jié)果：66例患者中，36例可疑肺結(jié)核經(jīng)痰培養(yǎng)、菌種鑒定確診為TB患者（TB組），30例患者為非TB者（非TB組）。GeneXpert MTB/RIF檢出30例陽性患者，檢出率為83.33%。TB組CD45+CD3+低于非TB組，CD4+CD45+及CD163+高于非TB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。受試者操作特征（ROC）曲線分析結(jié)果顯示，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+聯(lián)合GeneXpert MTB/RIF診斷痰涂片陰性TB的曲線下面積（AUC）高于單獨(dú)檢測，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合外周血細(xì)胞分析（CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+）的敏感度為92.87%。結(jié)論：GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細(xì)胞分析聯(lián)合診斷痰涂片陰性可疑TB的價(jià)值顯著，檢出率較高。

【關(guān)鍵詞】 核酸擴(kuò)增體系檢測 肺結(jié)核 血細(xì)胞分析 診斷 痰涂片

Effect of GeneXpert MTB/RIF Combined with Peripheral Blood Cell Analysis for the Clinical Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis/GUO Douhua， YIN Yingying， LI Yue. //Medical Innovation of China， 2024， 21（19）： -147

[Abstract] Objective： To observe the effect of Mycobacterium tuberculosis/Rifampicin resistance real-time fluorescence quantitative nucleic acid amplification detection （GeneXpert MTB/RIF） combined with peripheral blood cell analysis for the clinical diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis （TB） with sputum smear negative. Method： A total of 66 sputum smear negative suspected TB patients admitted to Ji’an First People's Hospital from October 2022 to September 2023 were selected. All patients underwent GeneXpert MTB/RIF test and peripheral blood cell analysis for CD45+CD3+， CD4+CD45+ and CD163+， and patients were identified by sputum culture and strain indentification for tuberculosis. The value of GeneXpert MTB/RIF test and peripheral blood cell analysis for diagnosing sputum smear negative suspected TB was analyzed. Result： Among 66 patients， 36 patients with suspected pulmonary tuberculosis were diagnosed as TB patients （TB group） by sputum culture and strain identification， and 30 patients were non-TB patients （non-TB group）. GeneXpert MTB/RIF was detected in 30 positive patients， with a detection rate of 83.33%. The CD45+CD3+ of TB group was lower than that of non-TB group， CD4+CD45+ and CD163+ were higher than those of non-TB group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The results of receiver operating characteristic （ROC） curve analysis showed that the area under the curve （AUC） of the combination of CD4+CD45+， CD45+CD3+， CD163+ and GeneXpert MTB/RIF detection was higher than that of single detection， the difference was statistically significant （P<0.05）. The sensitivity of GeneXpert MTB/RIF combined with peripheral blood cell analysis （CD4+CD45+， CD45+CD3+ and CD163+） was 92.87%. Conclusion： GeneXpert MTB/RIF detection and peripheral blood cell analysis combined with sputum smear negative suspected TB has significant value and high detection rate.

[Key words] Nucleic acid amplification detection Tuberculosis Blood cell analysis Diagnosis Sputum smear

First-author's address： Department of Clinical Laboratory， Ji’an First People's Hospital， Ji’an 343000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.19.033

肺結(jié)核（TB）是結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染所致的慢性傳染性呼吸道疾病。全球結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，2017年全球有1 000萬新發(fā)結(jié)核病患者，其中中國占據(jù)9%，每年死于結(jié)核病的人數(shù)約為其他寄生蟲病及傳染病總和的2倍[1]。傳統(tǒng)的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方式包括痰涂片鏡檢、比例法藥敏試驗(yàn)及羅氏固體培養(yǎng)法等，敏感度較低且需要較長時(shí)間，無法及時(shí)為臨床提供有價(jià)值的參考依據(jù)[2-4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在2010年世界衛(wèi)生組織推薦核酸檢測作為TB診斷的創(chuàng)新技術(shù)，目前已在較多研究中應(yīng)用[5]。美國在熒光定量檢測的基礎(chǔ)上率先開發(fā)了結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測（GeneXpert MTB/RIF），它能在2 h內(nèi)完成檢測，且檢出率高[6]。GeneXpert MTB/RIF操作簡單快速、對實(shí)驗(yàn)條件要求低，世界衛(wèi)生組織于2011年批準(zhǔn)該檢測用于診斷結(jié)核病[7]。但目前對于痰涂片陰性TB，GeneXpert MTB/RIF診斷價(jià)值尚不清楚。近年來，外周血細(xì)胞分析逐漸被用于診斷TB[8]，但臨床報(bào)道比較少，其對于于痰涂片陰性TB診斷價(jià)值不明，本研究主要分析GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合外周血細(xì)胞分析用于痰涂片陰性TB臨床診斷的效果，為臨床診斷TB提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取吉安市第一人民醫(yī)院2022年10月—2023年9月收治的66例痰涂片陰性可疑TB患者。所有患者接受GeneXpert MTB/RIF及外周血細(xì)胞分析檢測；臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有肺結(jié)核可疑癥狀且有密切接觸史；痰涂片陰性[9]。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：痰涂片陰性疑似TB；臨床資料完整；年齡≥18歲；均經(jīng)痰培養(yǎng)及菌種鑒定是否為肺結(jié)核。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期或哺乳期；惡性腫瘤；免疫系統(tǒng)疾??；無法配合完成本研究；合并其他呼吸系統(tǒng)疾病；合并其他可能影響免疫功能的疾病。患者及患者家屬均知情本研究且簽署研究同意書。本研究獲得吉安市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 痰培養(yǎng)及菌種鑒定 所有患者均進(jìn)行痰培養(yǎng)及菌種鑒定確診TB：治療前采集清晨痰、夜間痰和即時(shí)痰標(biāo)本，用無菌生理鹽水反復(fù)漱口2或3次后，取深部痰液咳出液并棄掉第1次痰液，取1或2口，將3次痰標(biāo)本混合后留置無菌盒，30～60 min內(nèi)立即送檢，取2 mL痰標(biāo)本離心，隨后取0.5 mL沉淀物放置于MGIT培養(yǎng)管內(nèi)，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；第2天起觀察MTB的生長情況，采用手工讀數(shù)儀讀取結(jié)果，陰性培養(yǎng)管繼續(xù)培養(yǎng)和讀管6周。菌種鑒定：通過硝基苯甲酸（PNB）生長實(shí)驗(yàn)、耐熱觸酶實(shí)驗(yàn)、28 ℃生長實(shí)驗(yàn)、菌落顏色、細(xì)菌的生長速度等實(shí)驗(yàn)鑒定。若PNB（+）、耐熱觸酶（+）、28 ℃（+）、菌落顏色有或無、生長速度為≤28 d，則為非結(jié)核分枝桿菌；若PNB（-）、耐熱觸酶（-）、28 ℃（-）、菌落顏色無、生長速度為>28 d，則為結(jié)核分枝桿菌。

1.2.2 GeneXpert MTB/RIF檢測 將痰取樣同時(shí)進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF檢測，全自動(dòng)GeneXpert儀器及試劑盒均購自廣州達(dá)安公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，取痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，2 h后讀取結(jié)果。當(dāng)內(nèi)對探針的循環(huán)閾值≤40時(shí)判斷為陽性，若≥3個(gè)探針的循環(huán)閾值≤40為檢測出MTB。結(jié)核分枝桿菌的檢測結(jié)果分為未檢出、極低、低、中、高5個(gè)等級(jí)[10]。

1.2.3 外周血細(xì)胞分析檢測 采集清晨空腹靜脈抗凝血4 mL，加入混合抗體（CD45、CD3、CD163、CD4，購自深圳唯公生物有限公司），加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，離心以2 000 r/min速度，離心5 min，離心半徑15 cm，去上清后加入磷酸鹽緩沖液2 mL，后采用流式細(xì)胞儀（廠家：美國BD公司，型號(hào)，BD-accuri-C6）對CD45+CD3+、CD4+CD45+進(jìn)行分析，采用酶聯(lián)免疫吸附法對CD163+進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；定性資料用率（%）表示，組間比較采用字2檢驗(yàn)；受試者操作特征（ROC）曲線下面積（AUC）之間比較采用Z檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果

66例患者中，36例可疑TB經(jīng)痰培養(yǎng)、菌種鑒定確診為TB患者（TB組），30例患者為非TB患者（非TB組）。

2.2 TB組與非TB組基線資料比較

非TB組30例中男15例，女15例；年齡28～86歲，平均（49.76±8.12）歲；平均體重指數(shù)（22.35±1.02）kg/m2。TB組36例中男17例，女19例；年齡28～85歲，平均（50.23±8.02）歲；平均體重指數(shù)（22.34±1.10）kg/m2。兩組性別、年齡及體重指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.3 GeneXpert MTB/RIF檢出情況

36例痰涂片陰性TB患者，GeneXpert MTB/RIF檢出30例陽性患者，檢出率為83.33%。

2.4 外周血細(xì)胞分析情況

TB組CD45+CD3+低于非TB組，CD4+CD45+及CD163+均高于非TB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.5 GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合外周血細(xì)胞分析結(jié)果診斷TB的效能

ROC分析結(jié)果顯示，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+聯(lián)合GeneXpert MTB/RIF診斷痰涂片陰性TB的AUC高于單獨(dú)檢測，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合外周血細(xì)胞分析（CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+）的敏感度為92.87%。見圖1、表2。

3 討論

TB是由一類獨(dú)立于麻風(fēng)分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌外的MTB復(fù)合群引起，廣泛分布于水源、灰塵等自然環(huán)境中，可誘發(fā)人體肺、中樞神經(jīng)、皮膚等組織或器官感染，尤以肺部感染癥狀顯著，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)胸悶、咯血等嚴(yán)重呼吸道癥狀，危及患者的生命安全[10-12]。隨著醫(yī)療科技的不斷進(jìn)步與完善，TB感染的檢出率逐年升高，但臨床診療中仍存在較高的誤診、漏診率[13]。既往研究證實(shí)，Xpert MTB/RIF檢測法應(yīng)用于痰涂片陰性結(jié)核病的診斷價(jià)值較高[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，36例TB患者中，GeneXpert MTB/RIF檢出30例陽性患者，檢出率為83.33%，提示GeneXpert MTB/RIF檢出TB的價(jià)值較高，符合既往研究[11]。

CD45+CD3+是指在免疫細(xì)胞表面上同時(shí)表達(dá)CD45和CD3的一類淋巴細(xì)胞。CD45是一種常見的白細(xì)胞抗原，CD3則是T細(xì)胞受體復(fù)合物的一部分，主要存在于成熟的T細(xì)胞表面。在肺結(jié)核的情況下，免疫細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生變化，包括T細(xì)胞的活化和增殖[15-16]。CD45+CD3+細(xì)胞的增多可能反映了機(jī)體對MTB的免疫應(yīng)答，在結(jié)核病的發(fā)病過程中，T細(xì)胞參與了由宿主的細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這也是肺結(jié)核病理過程中的一個(gè)重要方面，因此，CD45+CD3+細(xì)胞可以反應(yīng)肺結(jié)核患者免疫狀態(tài)[8]。CD4+CD45+T細(xì)胞屬于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，CD45存在于所有有核造血細(xì)胞中，而CD4是輔助性T細(xì)胞表面的一種共受體蛋白[17]。CD4+T細(xì)胞是一種在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用的免疫細(xì)胞[18]。它們通過分泌細(xì)胞因子和激活其他免疫細(xì)胞來幫助協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，當(dāng)患者被MTB感染后，CD4+CD45+細(xì)胞的數(shù)量和活性也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變[19]。CD163是一種Ⅰ型膜蛋白受體，主要表達(dá)于單核細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞[20]。它參與多種免疫功能，包括調(diào)節(jié)炎癥和清除細(xì)胞碎片，也是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，巨噬細(xì)胞在組織修復(fù)和重塑中起著至關(guān)重要的作用，與多種疾病有關(guān)，包括癌癥、自身免疫性疾病和傳染病[21]。在研究和診斷環(huán)境中，CD163常被用作識(shí)別和研究巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。隨著入侵時(shí)間變長，結(jié)核桿菌會(huì)通過一系列的策略干擾巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)變，以獲得巨噬細(xì)胞的免疫逃逸，肺結(jié)核患者體內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，與此同時(shí)，CD163+的表達(dá)數(shù)量和活性也會(huì)發(fā)生變化，通過外周細(xì)胞血對CD163的檢測結(jié)果，可以判斷患者被MTB的感染狀況。本研究結(jié)果顯示：TB組CD45+CD3+低于非TB組，CD4+CD45+及CD163+均高于非TB組。ROC分析結(jié)果顯示，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+聯(lián)合GeneXpert MTB/RIF診斷痰涂片陰性TB的AUC高于單獨(dú)檢測，提示聯(lián)合檢測檢出痰涂片陰性TB的價(jià)值高，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+單獨(dú)檢測只是免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物的一種表達(dá)情況。

需要注意的是，單憑血細(xì)胞分析的檢測結(jié)果不能作為肺結(jié)核的確診依據(jù)，通過GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合外周血細(xì)胞分析（CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+），對痰涂片陰性TB敏感度為92.87%，提示GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細(xì)胞分析聯(lián)合診斷痰涂片陰性可疑TB的價(jià)值顯著，而綜合上述指標(biāo)可全面評(píng)估感染肺結(jié)核后免疫狀態(tài)的改變，值得在臨床上推廣使用。GeneXpert MTB/RIF法操作快捷簡便，出結(jié)果只需2 h左右，且試劑盒獨(dú)立儲(chǔ)存，受細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)較小[22]。從生物安全角度來看，GeneXpert MTB/RIF是一種基于核酸檢測的方法，使用該法檢測標(biāo)本對于實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)的要求也與其他檢測方法的要求相當(dāng)[20]，該方法的結(jié)核檢出率高，能夠更快地檢測出結(jié)核病原體。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF檢測及外周血細(xì)胞分析聯(lián)合診斷痰涂片陰性可疑TB的價(jià)值顯著，檢出率較高。

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（收稿日期：2024-01-09） （本文編輯：白雅茹）