四逆湯對(duì)A549肺癌干細(xì)胞增殖及凋亡的影響

摘要：目的 研究經(jīng)方四逆湯對(duì)A549肺癌干細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法 利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)A549肺癌干細(xì)胞，檢測(cè)標(biāo)志物CD133陽(yáng)性率，驗(yàn)證細(xì)胞干性。分別用不同劑量四逆湯含藥血清（10%、20%）干預(yù)A549肺癌干細(xì)胞。CCK-8、流式細(xì)胞檢測(cè)四逆湯干預(yù)后對(duì)A549肺癌干細(xì)胞增殖及凋亡能力的影響。通過(guò)qPCR檢測(cè)四逆湯干預(yù)后對(duì)A549肺癌干細(xì)胞增殖及凋亡能力的影響。結(jié)果 經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞球CD133陽(yáng)性率為（82.3667±0.47258）%，明顯高于肺癌細(xì)胞組（P<0.05）；經(jīng)CCK-8檢測(cè)四逆湯干預(yù)的肺癌干細(xì)胞組在48、72h時(shí)吸光值較對(duì)照組均顯著降低（P<0.05），四逆湯干預(yù)的肺癌干細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著升高（P<0.05）；四逆湯含藥血清可顯著降低A549肺癌干細(xì)胞PCNA、Ki67和Bcl-2 mRNA水平（P<0.05），顯著升高肺癌干細(xì)胞Bax mRNA水平（P<0.05）。結(jié)論 四逆湯能抑制A549肺癌干細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

關(guān)鍵詞：四逆湯；肺癌干細(xì)胞；增殖；凋亡

中圖分類號(hào)：R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2024）07-0062-06

肺癌作為惡性腫瘤之首，其發(fā)病率、死亡率居高不下，針對(duì)肺癌的研究任重而道遠(yuǎn)。肺癌干細(xì)胞（lung cancer stem cells，LCSCs）的提出是肺癌研究的一個(gè)新突破口。肺癌干細(xì)胞是肺癌組織內(nèi)未分化的細(xì)胞亞群，具有自我更新、分化的能力，被認(rèn)為是肺癌母細(xì)胞，是肺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥的源頭，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［1-2］。從肺癌干細(xì)胞入手，從根本治療肺癌，是肺癌治療的方向。中醫(yī)藥在腫瘤干細(xì)胞領(lǐng)域的研究也取得了一定的成績(jī)，多項(xiàng)研究表面，中醫(yī)藥能有效抑制腫瘤干細(xì)胞的分化增殖，是肺癌干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)［3-4］。張仲景《傷寒論》所載四逆湯，是扶陽(yáng)代表方，有回陽(yáng)救逆之效。陽(yáng)虛寒凝是肺癌產(chǎn)生的重要病機(jī)之一，臨床以四逆湯治療中晚期肺癌取得了良好療效；多項(xiàng)研究表明，四逆湯能減輕患者癌痛、抑制癌癥轉(zhuǎn)移、減低化療耐藥性、提高肺癌晚期患者的生存質(zhì)量等作用［5-9］。本研究以四逆湯含藥血清干預(yù)肺癌干細(xì)胞，觀察其對(duì)肺癌干細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為肺癌以陽(yáng)虛論治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及耗材 四逆湯由附子、干姜、甘草組成，昆明市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供；實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物家兔購(gòu)買于湖南太平洋生物有限公司；細(xì)胞系A(chǔ)549人肺癌細(xì)胞、胎牛血清、F-12K培養(yǎng)基購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，重組人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）購(gòu)自上海生工生物公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司；anti-human CD133購(gòu)自Biolegend生物公司。

1.2 四逆湯含藥血清制備 四逆湯組將熬好的中藥，按照1.5 g/kg灌胃兔子，每天2次，連續(xù)3 d，末次給藥一小時(shí)后處死取血。空白組灌胃兔子相同體積生理鹽水，每天2次，連續(xù)3 d，末次給藥1 h后處死取血，收集空白組全血和中藥血清組全血，低速離心后分離出上層血清，56℃水浴鍋中滅活30min，0.22um的濾膜過(guò)濾除菌，分裝至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人肺癌 A549 細(xì)胞株的干細(xì)胞誘導(dǎo) 將A549細(xì)胞株培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 A549 細(xì)胞，用無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM 培養(yǎng)基+胰島素（4U/L）+B27（1X）+EGF（20 ng/mL）+bFGF20ng/mL）懸浮培養(yǎng)，以利于干細(xì)胞球的形成。隔 1～2 d更換培養(yǎng)基，2周后可見腫瘤細(xì)胞球形成，傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式檢測(cè) CD133 的表達(dá) 將誘導(dǎo)前后的細(xì)胞離心去上清，PBS清洗，4%PFA 在4℃下固定4～48h，用10%的二抗同源血清（PBS配置）封閉30 min，離心去上清不用清洗；滴加適當(dāng)濃度一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS清洗3×3min；滴加適當(dāng)濃度二抗，37℃孵育30 min；上級(jí)檢測(cè)。

1.5 CCK-8檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分3組（空白組細(xì)胞、空白血清組、中藥血清組），誘導(dǎo)成功后鋪96孔板，按照實(shí)驗(yàn)分組以10%的血清濃度加入空白血清和中藥血清組培養(yǎng)處理24、48、72h后，每孔加入10ul CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2h；酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光值（A）。細(xì)胞活力（%）=［A（實(shí)驗(yàn)組）-A（空白組）］/［A（對(duì)照組）-A（空白組）］×100%；細(xì)胞抑制率（%）=［A（對(duì)照組）-A（實(shí)驗(yàn)組）］/A（對(duì)照組）=1-細(xì)胞活力。

1.6 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)分2組（中藥血清組、空白血清組），誘導(dǎo)成功后按照實(shí)驗(yàn)分組以10%的血清濃度加入空白血清和中藥血清組培養(yǎng)處理1h，收集細(xì)胞，加PBS洗兩遍，取300ul 預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，每管各加入5 ul Annexin V-FITC 和 10ul PI，輕微混勻后，室溫避光孵育10 min，再向每管中加入200ul預(yù)冷的1×Binding Buffer，混勻后上流式儀檢測(cè)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 通過(guò)添加TriQuick Reagent總RNA提取試劑（Solarbio，北京，中國(guó)）從細(xì)胞提取總RNA。用One Step SuperRT-PCR Mix Kit（Solarbio，北京，中國(guó)）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，qPCR使用2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX）（Servicebio，武漢，中國(guó)）在StepOnePlus real-time PCR system（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，Inc.）上進(jìn)行。GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。引物（上海捷瑞生物工程有限公司）序列見表1。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，定量結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。2組之間定量數(shù)值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果 通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)A549細(xì)胞14天，誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞形成。通過(guò)電子顯微鏡觀察細(xì)胞成球情況，經(jīng)流式檢測(cè)CD133的表達(dá)情況。結(jié)果顯示細(xì)胞成球情況良好（圖1A）。此外，如A549細(xì)胞CD133陽(yáng)性率為（0.8467±0.23116）%，A549肺癌干細(xì)胞CD133陽(yáng)性率為（82.3667±0.47258）%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞球CD133陽(yáng)性率明顯高于A549肺癌細(xì)胞，證實(shí)A549肺癌干細(xì)胞誘導(dǎo)成功。

2.2 四逆湯含藥血清對(duì)A549肺癌干細(xì)胞增殖的影響 進(jìn)一步通過(guò)CCK-8檢測(cè)了不同劑量四逆湯含藥血清干預(yù)A549肺癌干細(xì)胞24、48、72h后細(xì)胞增殖活性。如圖2所示，四逆湯作用于肺癌干細(xì)胞48、72h后肺癌干細(xì)胞的吸光度值顯著降低（P<0.05），細(xì)胞存活率降低。其中，10%四逆湯含藥血清組干預(yù)24、48、72h對(duì)肺癌干細(xì)胞的抑制率分別為2.64、22.72、18.06、20%四逆湯含藥血清組干預(yù)24、48、72h對(duì)肺癌干細(xì)胞的抑制率分別為11.18、30.93、26.81%。以上結(jié)果表明，四逆湯能顯著抑制肺癌干細(xì)胞增殖。

2.3 四逆湯含藥血清對(duì)A549肺癌干細(xì)胞凋亡的影響 不同劑量四逆湯含藥血清干預(yù)A549肺癌干細(xì)胞72h后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了細(xì)胞凋亡。結(jié)果見圖3，其中對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.81±2.68）%，10%四逆湯含藥血清組細(xì)胞凋亡率為（14.88±0.37）%，20%四逆湯含藥血清組細(xì)胞凋亡率為（20.46±0.05）%。與對(duì)照組相比，10%四逆湯含藥血清組和20%四逆湯含藥血清組細(xì)胞凋亡率均顯著上升（P<0.05）。以上結(jié)果表明，四逆湯含藥血清明顯促進(jìn)了A549肺癌干細(xì)胞的凋亡。

2.4 四逆湯含藥血清對(duì)A549肺癌干細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、Ki67 mRNA的影響 通過(guò)qPCR檢測(cè)了各組細(xì)胞PCNA、Ki67 mRNA水平，結(jié)果見圖4。與對(duì)照組相比，10%四逆湯含藥血清組和20%四逆湯含藥血清組細(xì)胞PCNA、Ki67 mRNA水平均顯著下降（P<0.05）。

2.5 四逆湯含藥血清對(duì)A549肺癌干細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2 mRNA的影響 通過(guò)qPCR檢測(cè)了各組細(xì)胞Bax、Bcl-2 mRNA水平，結(jié)果見圖5。與對(duì)照組相比，10%四逆湯含藥血清組和20%四逆湯含藥血清組細(xì)胞Bax mRNA水平均顯著上升（P<0.05）而Bcl-2 mRNA水平均顯著下降（P<0.05）。

3 討論

肺癌發(fā)生率逐年上升，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，放化療、手術(shù)切術(shù)、靶向治療等治療技術(shù)也日益成熟，然肺癌的死亡率居高不下，轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)率高仍是肺癌治療的難點(diǎn)。肺癌干細(xì)胞被認(rèn)為是肺癌轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)的元兇，數(shù)量很少的肺癌干細(xì)胞即可分化產(chǎn)生大量特異性的腫瘤細(xì)胞并構(gòu)成高度異質(zhì)性的腫瘤組織［10-14］，即使手術(shù)切除了大部分腫瘤組織，殘留的少量肺癌AD8RFI+T44ECvIxt4wAQR3YVOoSyl8IFFAlM5bS5d4A=干細(xì)胞仍會(huì)繼續(xù)分化。針對(duì)肺癌干細(xì)胞的治療是提高肺癌治療成功率的關(guān)鍵。

中醫(yī)學(xué)對(duì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)主要參雜在精氣學(xué)說(shuō)、五行學(xué)說(shuō)、藏象學(xué)說(shuō)等理論中。精氣作為宇宙萬(wàn)物的本原，是人體化生精氣的基本物質(zhì)與原動(dòng)力，是人體進(jìn)行各項(xiàng)生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，《素問(wèn).金匱真言論》中記載：“夫精者，身之本也”，《靈樞.本神》也認(rèn)為“生之來(lái)者，謂之精”，而《素問(wèn).上古天真論》云：“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之”，《難經(jīng)》述：“十二經(jīng)脈者，皆系于生氣之源，所謂生氣之源者，謂十二經(jīng)脈之根本，謂腎間動(dòng)氣也。此五臟六腑之本，十二經(jīng)脈之根”。干細(xì)胞的特性與先天之精存在一定的相似性，故而認(rèn)為干細(xì)胞是細(xì)胞層次上的先天之精，因此，可將正常人體干細(xì)胞認(rèn)為腎中之精氣。正常狀態(tài)下，腎中精氣維持著人體各項(xiàng)生命活動(dòng)的正常運(yùn)行，而當(dāng)腎中精氣虧虛，陰陽(yáng)失衡，正常干細(xì)胞受到抑制，或突變?yōu)楫惓８杉?xì)胞，而異常細(xì)胞過(guò)度增生，便導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生和演變。因此，我們認(rèn)為腎中精氣虧虛與腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生可能有密切的關(guān)系，尤其是腎陽(yáng)虧虛，是腫瘤晚期的主要病理機(jī)制。扶助腎中陽(yáng)氣可能是通過(guò)抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖、分化從而達(dá)到抗腫瘤的目的［15］。

四逆湯由附子、干姜、甘草組成。方中附子大辛大熱，溫壯元陽(yáng)，破散陰寒，回陽(yáng)救逆，為君藥；干姜，入心、脾、肺經(jīng)，溫中散寒，助陽(yáng)通脈，為臣藥；炙甘草益氣補(bǔ)中，以治虛寒之本，緩和干姜、附子峻烈之性，調(diào)和藥性，使藥力持久，故為佐使藥。臨床上運(yùn)用四逆湯溫補(bǔ)腎陽(yáng)之效，治療晚期肺癌陽(yáng)虛寒凝證效果顯著；大量臨床研究也表明四逆湯能改善肺癌患者臨床癥狀、提高免疫力、降低腫瘤標(biāo)記物水平［16-17］；也有大量學(xué)者研究顯示四逆湯能促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡。

而本研究結(jié)果顯示，普通A549肺癌干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，大部分細(xì)胞凋亡，而只有其中的干細(xì)胞可在無(wú)血清培養(yǎng)條件下成球貼壁生長(zhǎng)，這些存活的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)成球后檢測(cè)CD133標(biāo)記物明顯高于普通A459肺癌細(xì)胞，從而進(jìn)一步確定了成球細(xì)胞的干性。而經(jīng)四逆湯含藥血清干預(yù)的肺癌干細(xì)胞增殖力明顯減弱、凋亡率明顯增加。此外，四逆湯含藥血清可顯著降低A549肺癌干細(xì)胞PCNA、Ki67和Bcl-2 mRNA水平，顯著升高肺癌干細(xì)胞Bax mRNA水平。因此可證實(shí)四逆湯可以抑制A549肺癌干細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡，從而達(dá)到抑癌的目的。此研究結(jié)果為中醫(yī)臨床“扶陽(yáng)抑癌”理論提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］李慧杰，齊元富，李秀榮.肺癌干細(xì)胞與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)腫瘤，2017，26（10）：798-801.

［2］羅詳沖，劉晶晶，朱家宏，等.肺癌干細(xì)胞在肺癌中的研究進(jìn)展［J］.癌癥進(jìn)展，2019，17（4）：387-391.

［3］盧建峰，黃靜，肖樺，等.中藥治療肺癌干細(xì)胞研究進(jìn)［J］.中藥與臨床，2018，9（4）：63-66.

［4］尹悅，李慧杰，李秀榮，等.基于肺癌干細(xì)胞理論探討中醫(yī)藥在肺癌治療中的應(yīng)用［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2018，46（3）：117-120.

［5］榮震，唐農(nóng)，王同彪，等.四逆湯加減治療低卡氏評(píng)分晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床研究［J］.廣西中醫(yī)藥，2015，38（2）：12-15.

［6］高靜東，陳嘉璐，李湧健，等.四逆湯組成藥物不同配伍對(duì)Lewis肺癌小鼠血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（7）：470-474.

［7］李嘉，段宇航，張淑靜，等.四逆湯聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)C57BL/6小鼠Lewis肺癌Caspase-3表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2021，36（1）：456-458.

［8］閆玉蘭，張春艷，劉鳳婷，等.四逆湯協(xié)同壯觀霉素B1誘導(dǎo)PTEN與SUMO1解離治療肺癌的研究［J］.中草藥，2019，50（9）：2127-2132.

［9］盛鳳，閆玉蘭，劉曉智，等.四逆湯在腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.山西中醫(yī)，2019，35（8）：58-60.

［10］馬雪曼，張培彤.CD133腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在肺癌中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)腫瘤，2014，23（3）：224-227.

［11］Miyata T，Yoshimatsu T，So T，et al.Cancer stem cell mark-ers in lung cancer［J］.Personalized Medicine Universe，2015（4）：40-45.

［12］Sarvi S，Mackinnon AC，Avlonitis N，et al.CD133+cancer stem-like cells in small cell lung cancer are highly tumorigenic and che-moresistant but sensitive to a novel neuropeptide antagonist［J］.Cancer Res，2014，74（5）：1554-1565.

［13］Reynolds SD，Zemke AC，Giangreco A，et al.Conditional stabilization of betacatenin expands the pool of lung stem cells［J］.Stem Cells，2008，26（5）：1337-46

［14］王軍，倪殿濤，張鳳春，等.肺癌組織中CD133和CD44的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性分析［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2021，20（21）：2266-2270.

［15］陸程潔.益氣溫陽(yáng)法聯(lián)合化療治療中晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床研究［D］.南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

［16］文志勇，金召英，楊西曉.四逆湯對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（24）：2015-2018.

［17］葛迎春，馬天舒，劉平，等.四逆湯類方提取物對(duì)離體小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006（2）：28-31.