生物技術(shù)在小麥抗銹育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展

摘要：條銹病是小麥生產(chǎn)上最主要的病害之一，培育抗銹新品種是提高產(chǎn)量和保障糧食安全的關(guān)鍵，生物技術(shù)的快速發(fā)展有效促進(jìn)了小麥重要性狀相關(guān)基因的挖掘與利用。通過闡述了細(xì)胞工程、染色體工程、分子標(biāo)記、基因編輯、全基因組關(guān)聯(lián)分析等技術(shù)在小麥抗銹相關(guān)性狀改良和應(yīng)用中的研究現(xiàn)狀，分析了小麥抗銹育種中尚需解決的問題，旨在為生物技術(shù)在甘肅小麥抗銹育種中的應(yīng)用及其發(fā)展提供支持。

關(guān)鍵詞：生物技術(shù)；小麥；抗銹育種；基因編輯

中圖分類號(hào)：TS255.9；S633.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2097-2172（2024）06-0510-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.06.004

Research Progress on the Application of Biotechnology in

Wheat Breeding against Stripe Rust

LI Ling 1， HU Mengxia 2， ZHANG Wentao 2， WANG Wanjun 3， CAO Shiqin 4， 5， 6， HUANG Jin 4， 5， 6，

ZHANG Bo 4， 5， 6， SUN Zhenyu 4， 5， 6， JIA Qiuzhen 4， 5， 6

（1. Lanzhou Agricultural Research & Technology Promotion Centre， Lanzhou Gansu 730030， China; 2. Wheat Research Institute，Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 3. Green Agronomic Centre， Tianshui Academy of Agricultural Sciences， Gangu Gansu 741200， China; 4. Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou Gansu 730070， China; 5. Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Tianshui， the Ministry of

Agriculture and Rural Affairs， P. R. China， Gangu Gansu 741200， China; 6. National Agricultural Experimental Station for

Plant Protection at Gangu， the Ministry of Agriculture and Rural Affairs， P. R. China， Gangu Gansu 741200， China）

Abstract： Stripe rust is the most important diseases in wheat production， breeding the new wheat varieties which have resistant characteristics to stripe rust is an essential method to improve yield and safeguard food security. The rapid development of biotechnology has effectively promoted the mining and utilization of genes related to important wheat traits. In this paper， the current situation and application of cell engineering， chromosome engineering， molecular markers， gene editing， genome-wide association analysis and other technologies to improve wheat rust resistance related traits were described， and the issues to be solved in wheat stripe rust resistance breeding were analyzed， in order to provide support for the application and development of biotechnology in wheat rust resistance breeding in Gansu Province.

Key words： Biotechnology; Wheat; Breeding for rust resistance; Gene editing

小麥作為中國(guó)北方居民的基本口糧，其產(chǎn)量的變化在保障國(guó)家糧食安全中起著舉足輕重的作用。育種技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了小麥產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性的不斷提升［1 ］。條銹病是發(fā)生于甘肅省及中國(guó)小麥生產(chǎn)上最主要的病害，條銹菌生理小種的不斷變異造成抗病品種的持續(xù)喪失，引致條銹病在甘肅省及中國(guó)的發(fā)生與流行，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失［2 - 3 ］。持續(xù)不斷進(jìn)行抗銹新種質(zhì)的創(chuàng)制與應(yīng)用是防治小麥條銹病的關(guān)鍵措施。以常規(guī)雜交、回交等技術(shù)手段為主的育種方法（2.0時(shí)代）為小麥種質(zhì)資源創(chuàng)新、新品種選育及產(chǎn)量的大幅度提升做出了重要貢獻(xiàn)，但育種效率偏低、選擇精度不夠等問題仍制約著小麥抗條銹育種的發(fā)展［4 - 5 ］。

生物技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，不僅助推了全球小麥育種技術(shù)的革命性進(jìn)步，也為甘肅省小麥抗銹育種帶來了新曙光。本文通過總結(jié)細(xì)胞工程、染色體工程、分子標(biāo)記、基因編輯及全基因組關(guān)聯(lián)分析等方面的研究進(jìn)展，分析存在的問題，旨在為甘肅省小麥抗條銹育種工作更好地開展提供理論支持。

1 研究進(jìn)展

1.1 細(xì)胞工程與染色體工程

近年來，基于雙單倍體（DH）群體構(gòu)建，建立了花粉小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系，使得優(yōu)異種質(zhì)的純合時(shí)間大大縮短，育種效率得到顯著提升［6 - 7 ］。通過體細(xì)胞不對(duì)稱融合技術(shù)，將長(zhǎng)穗偃麥草（Thinopyrum ponticum）的染色體片段導(dǎo)入受體小麥品種，創(chuàng)制出了一批具有優(yōu)異特質(zhì)的目標(biāo)新種質(zhì)［8 ］；將小麥與長(zhǎng)穗冰草體細(xì)胞雜交，創(chuàng)制出高分子量麥谷蛋白亞基新種質(zhì)［9 ］；利用小麥與玉米雜交產(chǎn)生單倍體，克服了花藥培養(yǎng)時(shí)受基因型控制和白化苗制約等限制因素［10 ］。胡道芬等［11 ］通過花培育種技術(shù)培育出加倍單倍體小麥新品種京花1號(hào)；楊隨莊等［12 ］利用雜交誘導(dǎo)單性生殖技術(shù)培育出優(yōu)異種質(zhì)WS4-8等小麥新品種（系）；基于遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程相結(jié)合的方法，已經(jīng)創(chuàng)制出長(zhǎng)穗偃麥草及華山新麥草和濱麥、粗山羊草與普通小麥、小麥與黑麥、小麥與冰草屬雜交的抗病優(yōu)異新資源，如小偃系列品種、中科166、西農(nóng)511、南農(nóng)92R等［13 - 17 ］；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院也已經(jīng)利用花粉管通道法育成抗銹冬小麥品種隴鑒9821等［18 ］。以上育種工作的開展，不僅使得目標(biāo)優(yōu)異種質(zhì)的純合時(shí)間顯著縮短，而且育種精準(zhǔn)性和效率也得到較好的提升。

1.2 分子標(biāo)記技術(shù)

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是提高育種效率、實(shí)現(xiàn)生物育種的主要技術(shù)措施，更是小麥抗條銹病育種的關(guān)鍵技術(shù)［7 ］。近年來，國(guó)內(nèi)外在小麥優(yōu)異種質(zhì)資源苗期和成株期表型鑒定、抗條銹基因挖掘與標(biāo)記以及重要基因克隆等方面均取得了諸多成果，定位了一批抗條銹病基因/QTL，克隆了Yr5、Yr7、Yr10、Yr15、Yr36、YrAS2388R和YrU1等抗條銹病基因，建立了相應(yīng)的分子標(biāo)記育種體系，并在抗銹育種中得到廣泛應(yīng)用［16 - 17 ］。甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所利用攜帶抗葉銹病基因Yr30、Yr18、Yr29的載體品種，以及來自河南周口農(nóng)業(yè)科學(xué)院的優(yōu)異種質(zhì)資源周8425B，基于分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)（MAS）進(jìn)行抗條銹病基因聚合育種，先后培育出聚合了3～4個(gè)抗條銹病基因的蘭天132（Yr9+Yr17+Yr30+YrZH84）、蘭天196（Yr9+Yr17+ Yr30）等抗性優(yōu)異新品系，為甘肅隴南抗條銹基因分子育種打下了良好基礎(chǔ)［19 - 20 ］。

1.3 基因編輯

基因編輯技術(shù)可對(duì)植物基因組進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，從而達(dá)到定向改變育種目標(biāo)性狀的目的。目前常用的基因編輯系統(tǒng)有鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas系統(tǒng)等［21 ］，其中CRISPR/Cas系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、高效、低成本等優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)基因的精準(zhǔn)敲除、編輯、定點(diǎn)替換、插入和引導(dǎo)等，是作物性狀改良的重要工具，將成為小麥抗銹育種的重要技術(shù)手段［22 ］。

1.3.1 基因敲除 CRISPR/Cas系統(tǒng)主要引起基因組DNA雙鏈斷裂，隨后通過非同源末端修復(fù)（NHEJ）或同源重組修復(fù)（HDR）措施對(duì)基因組進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而達(dá)到預(yù)期目的［23 ］?；蚯贸蓪?duì)控制植物重要性狀的負(fù)向調(diào)控基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，使目標(biāo)基因產(chǎn)生隨機(jī)插入、缺失或堿基替換，進(jìn)而創(chuàng)制出目標(biāo)性狀改良的突變體，該技術(shù)已成為目前植物遺傳改良的重要措施［24 ］。研究發(fā)現(xiàn)，TaWRKY19、TaCIPK14、TaPsIPK1等基因的敲除可以提高小麥對(duì)條銹病的抗性［25 - 27 ］。

1.3.2 單堿基編輯 單核苷酸多態(tài)性（SNP）是最常見的遺傳變異來源。堿基編輯技術(shù)可以在精確的基因組位置上產(chǎn)生單堿基突變，而不會(huì)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)重要目標(biāo)基因定向進(jìn)化［28 ］。近年來廣泛應(yīng)用的單堿基編輯系統(tǒng)主要有3種，為A∶T到G∶C轉(zhuǎn)換的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）、C∶G到T∶A轉(zhuǎn)換的堿基編輯器（CBE）和C∶G到G∶C轉(zhuǎn)換的堿基編輯器（CGBE）［29 ］。堿基編輯器已應(yīng)用于多種植物的改良中，如利用CBE堿基編輯器，已將除草劑抗性突變成功引入到擬南芥、西瓜、小麥、馬鈴薯和番茄等物種［30 - 33 ］。Zhang 等［34 ］利用CBE系統(tǒng)，成功編輯了小麥抗除草劑基因TaALS和TaACC，并產(chǎn)生了對(duì)多種除草劑具有耐受性的突變，為麥田雜草防治提供了新材料。由于多倍體物種基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要同時(shí)對(duì)所有等位基因進(jìn)行編輯才能獲得所需的表型性狀，因此堿基編輯系統(tǒng)在六倍體小麥育種中的應(yīng)用仍然非常有限［35 ］。

1.3.3 精準(zhǔn)編輯 精準(zhǔn)編輯是由同源定向修復(fù)（Homology directed repair， HDR）介導(dǎo)的基因插入或替換，該技術(shù)可用于等位基因替換、基因整合或外源目標(biāo)基因座的標(biāo)記等［22 ］。利用RNA轉(zhuǎn)錄本為修復(fù)模板，可實(shí)現(xiàn)HDR介導(dǎo)的OsALS等位基因替換［36 - 37 ］。Luo等［38 ］報(bào)道了一種通過將Cas9 RNP和dsDNA供體遞送到小麥莖端分生組織中來實(shí)現(xiàn)基于HDR的基因組編輯的新方法，在快速改善經(jīng)濟(jì)作物重要農(nóng)藝性狀中具有巨大潛力。

1.3.4 引導(dǎo)編輯 引導(dǎo)編輯是對(duì)任意數(shù)個(gè)到幾十個(gè)核苷酸進(jìn)行突變、插入或替換，并且不需要產(chǎn)生雙鏈斷裂和引入外源供體DNA的編輯技術(shù)［39 ］。該系統(tǒng)由nSpCas9（H840A）蛋白經(jīng)過工程化改造的M-MLV RT逆轉(zhuǎn)錄酶及先導(dǎo)編輯引導(dǎo)RNA（peRNA）組成［40 ］。其中先導(dǎo)編輯引導(dǎo)RNA（pegRNA）中的向?qū)NA（guide RNA）在基因組靶點(diǎn)位置附近形成編輯鏈上的單鏈切口，進(jìn)而通過pegRNA中的PBS（Primer binding site）序列引導(dǎo)含有目標(biāo)編輯序列的逆轉(zhuǎn)錄模板（RTtemplate），將突變精確導(dǎo)入基因組中［41 ］。Lin等［42 ］建立的PPE系統(tǒng)在水稻和小麥原生質(zhì)體中實(shí)現(xiàn)了多個(gè)內(nèi)源基因的精準(zhǔn)編輯，產(chǎn)生了單堿基置換、多堿基置換、插入及缺失等，并以21.8%的編輯頻率獲得再生的引導(dǎo)編輯水稻植株。植物引導(dǎo)編輯的多功能性具有推動(dòng)植物育種的潛力。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study， GWAS）是基于連鎖不平衡（Linkage disequilibrium， LD），通過群體分析，在全基因組水平上檢測(cè)與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記或基因的研究方法［43 ］，作為數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait locus， QTL）挖掘的有力工具，GWAS已被廣泛用于小麥多種性狀的基因發(fā)掘。Jia等［44 ］為揭示中國(guó)小麥抗條銹性的遺傳結(jié)構(gòu)，利用90 K SNP基因芯片對(duì)240份中國(guó)小麥品種（系）進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，首次篩選出QYr.hbaas-1BS、QYr.hbaas-2BL、QYr.hbaas-3AL、 QYr.hbaas-4BL.3、 QYr.hbaas-4DL、QYr.hbaas-6DS等6個(gè)抗條銹病QTL；Cheng等［45 ］對(duì)120份來自貴州、四川等地的冬小麥材料進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，在田間和溫室試驗(yàn)中共發(fā)現(xiàn)16個(gè)與小麥條銹病顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，其中3個(gè)SNP與抗條銹菌V26小種的QTL連鎖。

2 存在的問題

盡管生物育種技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，但在小麥生物育種中尚有諸多亟待解決的問題。一是克隆的小麥抗條銹病基因數(shù)量仍相對(duì)偏少，目前僅有Yr5、Yr7、Yr10、Yr15、Yr36、YrAS2388R、YrU1等極少數(shù)，絕大多數(shù)基因尚未得到克?。欢巧镉N成本相對(duì)偏高，目前單基因育種的成本仍相對(duì)較高，而無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用于實(shí)踐；三是轉(zhuǎn)錄組、代謝組、環(huán)境組等多維數(shù)據(jù)尚未應(yīng)用于基因組選擇育種［7 ］；四是抗銹數(shù)據(jù)資料尚不能完全共享，使得各團(tuán)隊(duì)得到的相關(guān)數(shù)據(jù)和結(jié)果難以相互利用。

3 展望

傳統(tǒng)小麥育種通過自然變異、人工雜交等方法系統(tǒng)選育抗銹良種。生物育種主要以轉(zhuǎn)基因、基因編輯等技術(shù)，高效創(chuàng)制目標(biāo)變異群體。下一步育種的方式向多學(xué)科合作、大規(guī)?；蛐瓦x擇的方向發(fā)展［16， 22 ］。針對(duì)甘肅省小麥抗銹生物育種，尚需做好以下幾個(gè)方面的工作。一是加快功能基因克隆的數(shù)量，挖掘針對(duì)條銹菌主要流行小種的主要功能基因。加快克隆優(yōu)異抗銹功能基因的數(shù)量和質(zhì)量，針對(duì)當(dāng)前主要流行小種CYR34、CYR32及新菌系ZS進(jìn)行選擇，才能使抗銹育種成效更有針對(duì)性和實(shí)效性；二是大幅度降低生物育種成本，有針對(duì)性地開展育種芯片開發(fā)，降低單個(gè)基因分型成本，盡快實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生物育種；三是加強(qiáng)高效表型精準(zhǔn)鑒定技術(shù)研究與應(yīng)用，進(jìn)一步強(qiáng)化多學(xué)科的交叉應(yīng)用，創(chuàng)新發(fā)展適用于高效精準(zhǔn)鑒定的技術(shù)模型［10， 21 ］；四是強(qiáng)化基因組選擇育種平臺(tái)建設(shè)，建立通用的抗銹育種大數(shù)據(jù)平臺(tái)，在數(shù)據(jù)采集、分析、存儲(chǔ)與管理方面實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化個(gè)規(guī)范化，數(shù)據(jù)融合共通，助力實(shí)現(xiàn)大數(shù)據(jù)育種。

雖然傳統(tǒng)育種方法具有費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且目標(biāo)性不高的缺點(diǎn)，但在小麥新品種培育過程中具有不可替代的作用。甘肅省未來小麥抗銹育種，唯有將生物育種技術(shù)、高通量自動(dòng)化表型評(píng)價(jià)技術(shù)等與傳統(tǒng)育種技術(shù)有機(jī)結(jié)合，充分發(fā)揮各種育種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合自身實(shí)際揚(yáng)長(zhǎng)避短，才能更好地實(shí)現(xiàn)甘肅小麥抗銹育種的精準(zhǔn)化、高效化和規(guī)?；?，助推甘肅小麥抗銹育種技術(shù)盡快從當(dāng)前的2.0水平上升到3.0、4.0水平。

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