SPE凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中四環(huán)素類抗生素殘留量

四環(huán)素類抗生素（Tetracyclines）主要指土霉素（oxytetracycline）、四環(huán)素（tetracycline）、金霉素（chlortetracycline）、強(qiáng)力霉素（doxycycline）4種，是一類廣譜抗生素，能有效抑制蛋白質(zhì)的合成，對(duì)于治療動(dòng)物細(xì)菌傳染病效果顯著，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、禽畜養(yǎng)殖等行業(yè)有著廣泛應(yīng)用，但卻極易造成動(dòng)物體內(nèi)藥物嚴(yán)重過剩，并隨食物鏈富集，直接或間接對(duì)人體造成毒性危害、致畸致癌及其他嚴(yán)重性疾病。因此，四環(huán)素類抗生素的用量和用藥期應(yīng)受到嚴(yán)格管控。我國(guó)對(duì)于四環(huán)素類抗生素允許殘留在豬肉中的濃度標(biāo)準(zhǔn)有著明確規(guī)定，其中，土霉素、四環(huán)素、金霉素均為200μg/kg，強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）為100μg/kg。

四環(huán)素類抗生素樣品檢測(cè)的前處理過程常采用固相萃取、液液萃取、固相微萃取等前處理方式。其中，固相萃取的應(yīng)用最為廣泛，但傳統(tǒng)固相萃取柱常采用“等密度法”來填裝，選用聚乙烯材質(zhì)的注射針筒裝置為骨架，在裝置內(nèi)上下裝有兩片聚乙烯或玻璃纖維材質(zhì)的塞片，并在塞片中間裝填一定量的色譜吸附劑（填料），填料要求準(zhǔn)確且混合均勻，對(duì)填料密度的要求也較高。因此，傳統(tǒng)固相萃取柱填料法操作繁瑣，對(duì)人員的技術(shù)能力要求較高，且填完的固相萃取柱重復(fù)性較低。本文選擇市售成品凈化柱，采用SPE凈化、液相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)，建立了簡(jiǎn)單、快捷地檢測(cè)4種四環(huán)素類抗生素的分析方法。

1. 材料與方法

1.1 材料與試劑

土霉素（CAS：6153-64-6，GSB05-3333-2016）、四環(huán)素（CAS：60-54-8，GSB05-3334-2016）、金霉素（CAS：57-62-5，GSB05-3332-2016）、強(qiáng)力霉素（CAS：564-25-0，GSB05-3335-2016），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度均為100μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所；甲醇，色譜純，科密歐；甲酸，色譜純，科密歐；乙酸乙酯，色譜純，科密歐；乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）、檸檬酸（C5H8O7·H2O）/磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），優(yōu)級(jí)純，科密歐；實(shí)驗(yàn)用水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；SelectCore HLB凈化柱，60mg/3mL，蘇州納譜；豬肉粉中四環(huán)素、土霉素、金霉素分析質(zhì)控樣MCS-80165。

1.2 儀器與設(shè)備

賽默飛液相色譜質(zhì)譜儀，TSQ Fortis；pH計(jì)，上海雷磁儀器；TGL-16高速冷凍離心機(jī)，盧湘儀；ME204E/JY20002天子天平，梅特勒托利多集團(tuán)；HY-2渦旋混勻儀，上海雷磁儀器；SK7200HP超聲清洗機(jī)，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；移液器（1mL/200μL），Eppendorf；自動(dòng)進(jìn)樣小瓶，棕色2mL，艾杰爾科技有限公司；自動(dòng)氮吹濃縮儀，M10，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。用移液器準(zhǔn)確移取四種標(biāo)液各10μL于進(jìn)樣小瓶中，再加入960μL的0.1%甲酸水溶液定容至1mL，配置成1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照需求配置成2、5、10、20、40μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 試劑的配制。0.1%甲酸水：量取100μL甲酸與100mL水混合；20%甲醇水：量取20mL甲醇與80mL水混合；5%甲醇水：量取5mL甲醇與95mL水混合；甲醇+乙酸乙酯（1+9）：量取10mL甲醇與90mL乙酸乙酯混合；Na2EDTA-Mellvaine緩沖液為1625mL Mellvaine，在緩沖液中加入60.5g的Na2EDTA，混勻溶解。

備注：Mellvaine緩沖液配制方法為先稱取21.02g檸檬酸（C5H8O7·H2O）溶于1000mL水中，另稱取28.41g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）溶于1000mL水中，將1000mL檸檬酸溶液與625mL磷酸氫二鈉溶液混合，用氫氧化鈉或者鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0±0.05。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件。納譜分析，ChromCore C18（2.1×100mm，3.0μm）色譜柱；柱溫為30℃；流動(dòng)相A為添加0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫：0-1.0min，20%B；1.0-4.8min，20%B-95%B；4.8-5.7min，95%B；5.7-6.0min，95%B-20%B。流速為0.35mL/min，進(jìn)樣量為5μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件。電噴霧電離源為電離模式ESI+；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；鞘氣壓力Sheath Gas Flow Rate 35units；輔助氣壓力Aux Gas Flow Rate 15units；噴霧電壓Spray Voltage 4500V；離子傳輸管溫度Capillary Temp 350℃；加熱器溫度Heater Temp 0℃；碰撞氣Collision gas pressure（Ar）1.5mTorr。4種四環(huán)素類化合物SRM模式質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)如表1所示。

1.5 樣品前處理

在50mL離心管（聚丙烯材質(zhì)）中稱取均勻樣品5g（精確至0.01g），分別用冰水浴超聲提取兩次，且每次提取液（1.3.2）用量為20mL，提取完成后渦混1min，超聲提取10min，在溫度低于5℃下時(shí)以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，合并上清液，并用提取液（1.3.2）定容至50mL，收集經(jīng)快速濾紙過濾的濾液。

自然流速下，依次用甲醇活化HLB柱、實(shí)驗(yàn)用水平衡凈化柱；取10mL樣液過柱后，依次用實(shí)驗(yàn)用水（5mL）、5%甲醇水溶液（5mL）淋洗凈化柱，減壓（2.0KPa以下）抽干5min；用10mL甲醇+乙酸乙酯（1+9）溶液洗脫凈化柱，收集洗脫液，在40℃下氮?dú)獯抵两?。?mL的20%甲醇水定容，過0.22μm針孔混合纖維素濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.6 結(jié)果計(jì)算

具體的計(jì)算公式如下：

在上式中，w為樣品含量，μg/kg；c為待測(cè)組分溶液的質(zhì)量濃度，μg/L；V1為樣品定容體積，mL；V2為凈化樣品溶液體積，mL；m為試樣稱樣量，g。

2. 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的優(yōu)化

四環(huán)素類藥物分子中含有許多羥基、烯醇羥基及羰基，在近中性條件下能與多種金屬離子形成不溶性螯合物，例如與鈣或鎂離子形成不溶性的鈣鹽或鎂鹽、與鐵離子形成紅色絡(luò)合物、與鋁離子形成黃色絡(luò)合物等，導(dǎo)致提取不徹底，需采用Na2EDTA-Mellvaine緩沖液進(jìn)行提取，并將乙二胺四乙酸二鈉作為氨基羧酸類螯合劑。乙二胺四乙酸二鈉含有兩個(gè)氮原子和四個(gè)氧原子，可提供形成配位鍵的電子對(duì)，并與鈣離子形成六個(gè)配位鍵組成的K元環(huán)，極大增強(qiáng)螯合劑分子與金屬離子的強(qiáng)結(jié)合作用，從而將金屬離子包合到螯合劑內(nèi)部，形成穩(wěn)定且分子量更大的化合物，阻止金屬離子與四環(huán)素類藥物的螯合，提高準(zhǔn)確率。

此外，豬肉樣品基質(zhì)含有大量脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及鈣、鐵、磷等微量元素，樣品中目標(biāo)物殘留濃度也較低，不宜采用常規(guī)的快速篩查方法。HLB固相萃取柱能夠去除95%的常見基質(zhì)干擾物（如磷脂、脂肪、鹽和蛋白質(zhì)等），使目標(biāo)物得到濃縮富集，提高檢測(cè)的靈敏度。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系及檢出限。按1.3.1配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在相應(yīng)色譜（1.4.1）和質(zhì)譜條件（1.4.2）下進(jìn)行檢測(cè)，以溶液質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表示，在2-40μg/L范圍內(nèi)，各物質(zhì)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9991-0.9996。以3倍信噪比時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法檢出限（LOD），10倍信噪比時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量下限（LOQ），結(jié)果如表2所示。

2.2.2 方法回收率及精密度。以陰性豬肉樣品為基質(zhì)，進(jìn)行三個(gè)水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（添加濃度為5、10、20μg/kg），計(jì)算n=6時(shí)的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3所示。在質(zhì)量濃度為5、10、20μg/kg的添加水平下，加標(biāo)回收率分別為四環(huán)素116%-123%、土霉素115%-119%、金霉素92.4%-98.9%、強(qiáng)力霉素80.2%-104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為四環(huán)素1.8%-4.6%、土霉素1.1%-6.3%、金霉素2.2%-5.6%、強(qiáng)力霉素1.6%-4.5%。

2.2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)。為更好驗(yàn)證方法的適用性，隨機(jī)從市場(chǎng)選取10批豬肉及購(gòu)買質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測(cè)。其中，市場(chǎng)樣品均未檢出，質(zhì)控樣品檢出，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

3. 結(jié)論

本文采用固相萃取-液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中四環(huán)素類抗生素殘留量，實(shí)現(xiàn)了4種常規(guī)四環(huán)素類抗生素藥物的同時(shí)分析。前處理采用HLB凈化、濃縮去除豬肉大部分的脂肪和蛋白物質(zhì)，提高了檢測(cè)的靈敏度，在篩查和定量檢測(cè)四環(huán)素類抗生素方面具有一定的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

作者簡(jiǎn)介：鄭連港（1989-），男，漢族，山東濰坊人，中級(jí)工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)橘|(zhì)量工程。