高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸含量的方法優(yōu)化

脫氫乙酸是一種呈白色或略微淡黃色的結(jié)晶性顆粒狀粉末，是一種低毒、高效的防腐和防霉劑，在酸、堿等環(huán)境下具有一定的抗菌功能，尤其對(duì)霉菌的抑制效果最為顯著，但過(guò)量攝入可能對(duì)身體造成一定危害，所以我國(guó)僅允許在部分食品中使用。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121-2016），液相色譜法的前處理過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，不同基質(zhì)需要不同的處理方法，且在進(jìn)樣后可能出現(xiàn)色譜峰拖尾的問(wèn)題。為了簡(jiǎn)化操作流程并優(yōu)化峰型對(duì)稱性，本研究在GB 5009.121-2016標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，通過(guò)簡(jiǎn)化流動(dòng)相比例和調(diào)整不同基質(zhì)的前處理方法，可以使實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)單，峰型也更加對(duì)稱。

在實(shí)驗(yàn)中，樣品溶解均勻后，通過(guò)氫氧化鈉提取脫氫乙酸；經(jīng)過(guò)前處理，通過(guò)水相濾膜，使用高效液相色譜儀（同時(shí)配備紫外檢測(cè)器）進(jìn)行測(cè)定。在優(yōu)化的條件下，該方法的檢出限為0.002g/kg，定量限為0.005g/kg；在1.00-200μg/mL范圍內(nèi)，脫氫乙酸質(zhì)量濃度的響應(yīng)值和峰面積之間存在良好的線性關(guān)系，R2為0.9998；0.015、0.025、0.050g/kg三個(gè)水平的加標(biāo)回收率為98.3%-103.2%。另外，對(duì)于具有不同基質(zhì)的樣本，可以使用統(tǒng)一的預(yù)處理技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)各種基質(zhì)樣本的同步處理，從而提升檢測(cè)效率。

1. 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器。Ultimate3000液相色譜儀，賽默飛世爾科技術(shù)有限公司；BSA 423S電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；FXP 20M超聲波清洗器，Unisonics Australia；BE-2600渦旋震蕩混合器，林貝爾儀器制造有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.1.2 試劑。乙酸銨，默克化工技術(shù)（上海）有限公司；高品質(zhì)純氫氧化鈉，國(guó)藥集團(tuán)；硫酸鋅，默克化工技術(shù)（上海）有限公司；色譜純甲醇，美國(guó)默克公司；氨水，永華化學(xué)股份有限公司；超純水，上海和泰儀器有限公司；0.45μm水相濾膜，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；脫氫乙酸（Dehydroacetic acid）標(biāo)準(zhǔn)品，BePure公司。以上這些試劑的純度都超過(guò)99.9%。

為制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，準(zhǔn)確稱取0.050g脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于20g/L的氫氧化鈉溶液中，然后用水定容至50mL，最終得到質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)工作液則通過(guò)逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液得到，質(zhì)量濃度分別為1、10.0、50.0、100、200μg/mL。

1.2 儀器工作條件

使用DikMA Silversil 5μm C18色譜柱，尺寸為250mm×4.6mm，柱溫設(shè)定在35℃。實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)樣量為10μL，流速為1.0mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為293nm，進(jìn)樣時(shí)間為22min。流動(dòng)相是由乙酸銨溶液（濃度為0.02mol/L）和甲醇混合而成。

1.3 樣品處理方法

將2g試樣放入50mL玻璃比色管中，加入25mL超純水，渦旋混合1min，超聲提取30min以上，然后再次渦旋混合1min。加入5mL濃度為120g/L的ZnSO4溶液，用濃度為20g/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，再用水定容至50mL，然后搖勻。通過(guò)濾紙過(guò)濾，取得澄清的濾液，通過(guò)0.45μm的水相濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

2. 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。通過(guò)使用UVD紫外檢測(cè)器和3D光譜圖，確定脫氫乙酸吸收峰的最大波長(zhǎng)分別是230nm和293nm，但在230nm的位置，雜質(zhì)干擾較為明顯，而在293nm的位置，雜質(zhì)干擾則相對(duì)較少。為了確保測(cè)量的準(zhǔn)確性，選擇293nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，這與GB 5009.121-2016所規(guī)定的波長(zhǎng)是一致的。

2.1.2 流動(dòng)相梯度洗脫比例的選擇。脫氫乙酸對(duì)抗酵母菌和霉菌的功能卓越，在面包、糕點(diǎn)以及發(fā)酵食品等多個(gè)行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用?？紤]到這類食品通常會(huì)混合多種食品添加劑，為了確保樣本中那些性質(zhì)差異較大的成分能夠有效分離并達(dá)到洗脫后的清潔效果，實(shí)驗(yàn)中選擇了梯度洗脫技術(shù)，梯度洗脫的比例詳見(jiàn)表1。

表1：梯度洗脫比例

2.1.3 流動(dòng)相pH的選擇。在一致的實(shí)驗(yàn)設(shè)備環(huán)境中，對(duì)質(zhì)量濃度達(dá)到50.0μg/mL的脫氫乙酸樣本進(jìn)行取樣，并據(jù)此繪制相應(yīng)的對(duì)照?qǐng)D表。在具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用氨水將0.02mol/mL的乙酸銨調(diào)整pH至9.0，設(shè)定初始流動(dòng)相比例為：甲醇-0.02mol/mL乙酸銨（體積比為1：49）。接著，采用表1中的梯度洗脫技術(shù)，得到流動(dòng)相進(jìn)樣圖譜，如圖1所示。

圖1：初始的流動(dòng)相比例為甲醇-0.02mol/mL

乙酸銨（體積比為1：49）的流動(dòng)相進(jìn)樣圖譜

2.2 線性關(guān)系

當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度處于1.0-200.0mg/mL時(shí)，其響應(yīng)值表現(xiàn)出色，峰面積之間也展現(xiàn)出明顯的線性關(guān)聯(lián)。線性方程的公式是y=0.4839x，其相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.9998。另外，檢測(cè)的下限是0.002mg/kg，定量的下限則是0.005mg/kg。

2.3 不同方法的回收率

依據(jù)GB 5009.121-2016的第二種方法，也就是液相色譜法中的樣品制備和提取過(guò)程，我們可以觀察到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于不同的基質(zhì)都有不同的預(yù)處理策略。為了使操作更為簡(jiǎn)潔，我們簡(jiǎn)化了前處理流程，以便對(duì)各種基質(zhì)的樣本進(jìn)行統(tǒng)一處理。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選擇果蔬汁、豆制品和糕點(diǎn)作為主要的試驗(yàn)材料，并加入脫氫乙酸作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，接著根據(jù)國(guó)標(biāo)方法和優(yōu)化后的試驗(yàn)方法進(jìn)行前期處理，然后進(jìn)行樣品進(jìn)樣。不同基質(zhì)不同方法的加標(biāo)回收率如表2所示。

2.3.1 果蔬汁處理方法。在國(guó)標(biāo)法中，樣本先被稱重到離心管中，接著需要調(diào)整pH，再將其轉(zhuǎn)移到容量瓶中進(jìn)行定容，然后置入離心管中進(jìn)行離心操作，在取得上清液之后，再次調(diào)整pH并進(jìn)行定容。接下來(lái)，取5mL樣本，并通過(guò)固相萃取柱收集洗脫液，然后進(jìn)行上機(jī)測(cè)試。在這個(gè)預(yù)處理步驟中，多次的轉(zhuǎn)移和固相萃取柱的應(yīng)用都有可能引發(fā)損失。與此相對(duì)照，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)前處理進(jìn)行了優(yōu)化，只需在比色管中直接稱量樣本，并在加入沉淀劑后使用比色管進(jìn)行定容。這種方法減少了多次轉(zhuǎn)移和固相萃取柱的凈化過(guò)程，從而有效地提升了回收效率。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，與優(yōu)化后的方法相比，國(guó)標(biāo)法的回收效率明顯較低。

2.3.2 豆制品處理方法。按照國(guó)標(biāo)法，先在離心管里取樣，再將其轉(zhuǎn)移到容量瓶中進(jìn)行容量測(cè)定，接著進(jìn)行超聲波提取和過(guò)濾，然后進(jìn)行機(jī)器測(cè)試，其回收效率高達(dá)99%。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們優(yōu)化了前處理步驟，并成功實(shí)現(xiàn)了100%的回收率。當(dāng)回收率的差異不顯著時(shí)，實(shí)驗(yàn)的預(yù)處理步驟變得更加簡(jiǎn)單和便捷。

2.3.3 糕點(diǎn)處理方法。按照國(guó)標(biāo)法，先將樣本溶解，再加入沉淀劑并進(jìn)行定容處理，接著必須把溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗里，用正己烷多次抽提之后，取水相層進(jìn)行離心，然后用過(guò)濾膜對(duì)上清液進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)高效液相色譜的分離效果不盡如人意時(shí)，需要調(diào)整上清液的pH，再利用固相萃取柱進(jìn)行進(jìn)一步處理，并在洗脫后進(jìn)行機(jī)器測(cè)試。從表2中可以觀察到，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的萃取方法后，回收效率已經(jīng)降低，但經(jīng)過(guò)固相萃取柱的處理，損失變得更加明顯；與此相對(duì)照，使用經(jīng)過(guò)優(yōu)化的前處理技術(shù)，其回收效果更為出色。

2.4 方法優(yōu)化后的精密度與回收率

經(jīng)過(guò)對(duì)蔬菜汁、腐乳和糕點(diǎn)樣本的篩選，我們?cè)?、5和10倍的定量限制內(nèi)完成了加標(biāo)回收操作，在0.015、0.025、0.050g/kg這三個(gè)濃度加入了脫氫乙酸，并采用了優(yōu)化過(guò)的預(yù)處理技術(shù)進(jìn)行提取和測(cè)量。在每一種添加水平下進(jìn)行6輪的平行測(cè)量，并據(jù)此估算其回收效率和精確性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，平均回收率為98.3%-103.2%，標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為0.35%-2.35%。

2.5 質(zhì)控樣檢測(cè)

在執(zhí)行質(zhì)量控制過(guò)程中，我們選擇了糕點(diǎn)里的脫氫乙酸作為質(zhì)控樣本。如表3所示，在經(jīng)歷了試驗(yàn)中的預(yù)處理階段之后，測(cè)定的上機(jī)值達(dá)到0.261g/kg。當(dāng)將其轉(zhuǎn)化為質(zhì)量控制的參考值時(shí)，得到的結(jié)果是0.265g/kg，且回收效率高達(dá)98.49%?；谠囼?yàn)方法的檢測(cè)數(shù)據(jù)，我們可以得到令人滿意的結(jié)論，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的高度準(zhǔn)確性。

3. 結(jié)論

為了更有效地提取和分析食品中的脫氫乙酸，本實(shí)驗(yàn)基于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化工作，利用高效液相色譜技術(shù)成功分離和測(cè)定了脫氫乙酸。該方法不僅展示了出色的精確性和回收效率，還具有出色的線性關(guān)聯(lián)。令人驚喜的是，在處理不同基質(zhì)的樣本時(shí)，我們使用了一致的預(yù)處理技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)各種基質(zhì)樣本的同步處理。這種方法不僅提高了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)效率，對(duì)于那些需要完成繁重檢測(cè)任務(wù)的第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)而言，更是能夠節(jié)約大量時(shí)間和人力成本。

作者簡(jiǎn)介：周全（1996-），男，漢族，湖南人，初級(jí)工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称钒踩砘瘷z測(cè)方法優(yōu)化。