石見穿誘導(dǎo)鐵死亡抑制小鼠食管癌發(fā)生發(fā)展的研究

林鑫榮 賈蕾 李麗峰 黃鳴 吳忠冰 李晶

【摘要】 背景 食管癌是一種在中國乃至全球范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤，具有很高的發(fā)病率和致死率。石見穿（SJC）作為傳統(tǒng)中藥，其清熱解毒、活血鎮(zhèn)痛之功常用于食管癌的治療中。藥理實驗研究證明，SJC具有抗癌性，可有效治療多種惡性腫瘤。目的 基于鐵死亡探討SJC抑制C57小鼠食管原位癌發(fā)生發(fā)展的作用和機制。方法 2022年2月—2023年2月選取SPF級C57BL/6雌鼠90只，隨機分為對照組（Control組，n=15）、單純4NQO誘癌組（4NQO組，n=25）、4-硝基喹啉 N-氧化物（4NQO）+SJC低劑量組［4NQO/SJC（91 mg）組，n=25］和4NQO+SJC高劑量組［4NQO/SJC（182 mg）組，n=25］。采用4NQO誘導(dǎo)的方式進行C57小鼠食管癌原位模型的制備。觀察小鼠活動情況，記錄其精神狀況和進食飲水情況，每隔8周分組測量小鼠體質(zhì)量并進行記錄。32周后進行食管組織蘇木素-伊紅（HE）染色和病理學(xué)分析。測定食管組織Fe2+、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠食管組織中核受體共激活因子4（NCOA4），谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）蛋白質(zhì)的表達水平。采用Kaplan-Meier法繪制小鼠的生存曲線，生存曲線的比較采用Breslow檢驗。結(jié)果 造模8、16、24、32周4NQO組、4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組小鼠體質(zhì)量低于Control組，32周4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組小鼠體質(zhì)量高于4NQO組（P<0.05）。Breslow檢驗結(jié)果顯示，4組小鼠生存曲線比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.907，P=0.019）。HE染色結(jié)果可見，4NQO組小鼠食管上皮組織呈現(xiàn)異常增生，細胞排列紊亂，出現(xiàn)角化珠等異常病理改變；與4NQO組比較，4NQO/SJC（91 mg）組和4NQO/SJC（182 mg）組食管上皮組織病理學(xué)改變明顯改善。4NQO組、4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組Fe2+、MDA均低于Control組，GSH均高于Control組（P<0.05）；4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組Fe2+、MDA均高于4NQO組，GSH均低于4NQO組（P<0.05）；4NQO/SJC（182 mg）組Fe2+、MDA均高于4NQO/SJC（91 mg）組，GSH均低于4NQO/SJC（91 mg）組（P<0.05）。4NQO組NCOA4低于Control組、4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組，GPX4高于Control組、4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組（P<0.05）；4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組GPX4高于Control組（P<0.05）。結(jié)論 SJC可干預(yù)食管癌的發(fā)生發(fā)展，其機制可能與NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白吞噬作用相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 食管癌；鐵死亡；石見穿；原位癌誘導(dǎo)模型；谷胱甘肽過氧化物酶4；核受體共激活因子4

【中圖分類號】 R 735.1 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0342

Study on the Inhibition of Esophageal Carcinoma Development in Mice by Salvia Chinensia Benth Induced Ferroptosis

LIN Xinrong1，JIA Lei1，LI Lifeng1，HUANG Ming1，WU Zhongbing1，LI Jing1，2*

1.College of Integrated Chinese and Western Medicine，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China

2.Department of Traditional Chinese Medicine，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China

*Corresponding author：LI Jing，Chief physician/Professor/Doctoral supervisor；E-mail：lijingtiger@126.com

【Abstract】 Background Esophageal carcinoma is a common malignant tumor of the gastrointestinal tract in China and even globally，with a high incidence and mortality rate. As a traditional Chinese medicine，Salvia chinensia Benth（SJC）has the effects of clearing heat and detoxifying，promoting blood circulation and easing pain in the treatment of esophageal cancer. Pharmacological experimental studies have proved that SJC has anticancer properties and can effectively treat a variety of malignant tumors. Objective To explore the effect and mechanism of SJC in the inhibition of carcinoma in situ esophageal cancer development of C57 mice based on ferroptosis. Methods Ninety SPF grade C57BL/6 female mice were selected from February 2022 to February 2023 and randomly divided into Control group（n=15），simple 4-Nitroquinoline N-oxide（4NQO）-induced cancer group（4NQO group，n=25），4NQO+ low-dose SJC group［4NQO/SJC（91 mg）group，n=25］and 4NQO+high dose SJC group［4NQO/SJC（182 mg）group，n=25］. The preparation of in situ model of esophageal cancer in C57 mice was carried out using 4NQO induction. The activities of the mice were observed，their mental state，food and water intake were recorded，and the body mass of the mice was measured and recorded at 8-week intervals. Hematoxylin-eosin（HE）staining and pathological analysis of esophageal tissue were performed after 32 weeks. The contents of Fe2+，glutathione（GSH）and malondialdehyde（MDA）in esophageal tissues were determined，and the expression levels of nuclear receptor coactivator 4

（NCOA4）and glutathione peroxidase 4（GPX4）in esophageal tissues of mice were detected by western blot. Kaplan-Meier method was used to plot the survival curves of mice，and Breslow test was used to compare the survival curves. Results The body mass of mice in 4NQO group，4NQO/SJC（91 mg）group and 4NQO/SJC（182 mg）group at 8，16，24 and 32 weeks of modeling was lower than that in Control group. The body mass of 4NQO/SJC（91 mg）group and 4NQO/SJC（182 mg）group at 32 weeks was higher than that of 4NQO group（P<0.05）. The results of Breslow test showed that there was significant difference in the survival curves of mice in the four groups（χ2=9.907，P=0.019）. The results of HE staining showed that esophageal epithelial tissue of mice in 4NQO group showed abnormal proliferation，disordered cell arrangement，and abnormal pathological changes such as keratinized beads. Compared with 4NQO group，the esophageal epithelial histopathological changes in 4NQO/SJC（91 mg）and 4NQO/SJC（182 mg）groups were significantly improved. Fe2+ and MDA in 4NQO，4NQO/SJC（91 mg）and 4NQO/SJC（182 mg）groups were lower than those in Control group，and GSH was higher than that in Control group（P<0.05）. Fe2+ and MDA in 4NQO/SJC（91 mg）and 4NQO/SJC（182 mg）groups were higher than those in 4NQO group，and GSH was lower than that in 4NQO group（P<0.05）. Fe2+ and MDA in 4NQO/SJC（182 mg）group were higher than those in 4NQO/SJC

（91 mg）group，and GSH in 4NQO/SJC（91 mg）group was lower than that in 4NQO/SJC（91 mg）group（P<0.05）. NCOA4 in 4NQO group was lower than that in Control group，4NQO/SJC（91 mg）group and 4NQO/SJC（182 mg）group，and GPX4 was higher than that in Control group，4NQO/SJC（91 mg）group and 4NQO/SJC（182 mg）group（P<0.05）. The GPX4 of 4NQO/SJC（91 mg）group and 4NQO/SJC（182 mg）group was higher than that of Control group（P<0.05）. Conclusion It is proved that SJC can interfere with the development of esophageal cancer development by a mechanism that may be related to NCOA4-mediated ferritin phagocytosis.

【Key words】 Esophageal carcinoma；Ferroptosis；Salvia chinensia Benth；Induction of carcinoma in situ；Glutathione peroxidase 4；Nuclear receptor coactivator 4

食管癌是一種發(fā)生于全球范圍內(nèi)的消化道惡性腫瘤，2020年統(tǒng)計結(jié)果顯示，食管癌在癌癥總發(fā)病率中排名第8位，總致死率高居全球第6位［1］。食管癌發(fā)病隱匿，往往初次診斷便已經(jīng)是中晚期水平，因此治療效果欠佳，預(yù)后差。在飲食、情志等因素影響下，食管癌的患病率仍在逐年增高［2］?，F(xiàn)階段臨床上主要治療措施有手術(shù)、化療、分子靶向治療等，皆存在不良反應(yīng)。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療以其能增強療效且降低不良反應(yīng)的優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于臨床當中。

石見穿（SJC），以紫參的全草入藥，其味辛、苦，性微寒，以其清利濕熱，活血化瘀之功，用于噎膈、痰喘、癰腫、瘰疬等多種疾病的治療?！额愖C制裁》中記載，“氣滯成噎者，宣理氣隧，宜用石見穿?！苯陙?，許多藥理實驗證實石見穿及其提取物具有抗癌作用［3］，其具體機制仍需進一步探究。

鐵死亡是近年來被提出的一種程序性細胞死亡形式，以鐵依賴性脂質(zhì)活性氧的積累作為主要特征［4］。諸多證據(jù)表明，鐵死亡作用于癌癥的靶點眾多，可為臨床提供新的診治思路［5-6］。因此，本研究旨在研究石見穿干預(yù)4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠原位食管癌的作用和機制，為石見穿在食管癌治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2022年2月—2023年2月選取SPF級C57BL/6雌鼠90只，體質(zhì)量14～17 g，鼠齡35～41 d。小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，均飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院動物中心，實驗前12 h/12 h光暗循環(huán)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有實驗方法按照河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動物倫理委員會的指導(dǎo)方針進行（審核號：IACUC-4th Hos Hebmu-2022003）。

1.2 藥物與試劑

SJC顆粒劑（江陰藥業(yè)，貨號：19092701），4-硝基喹啉 N-氧化物（4NQO）（sigma，貨號：N8141）；丙二醛（MDA）測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒、組織鐵測定試劑盒（南京建成，貨號：A003-1-1、A006-1-1、A039-2-1）；谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）抗體（Proteintech，貨號：67763-1-Ig），核受體共激活因子4（NCOA4）（abcam，貨號：ab86707）。

1.3 實驗儀器

4 ℃/-20 ℃冰箱（日本Sanyo），-80 ℃低溫冰箱（日本Sanyo），數(shù)字天平TD6001型（美國sigma），正置顯微鏡（BX63，日本Olympus），脫水機、包埋機、凍臺（武漢俊杰），病理切片機（上海徠卡），組織攤片機（金華科迪），微波爐（格蘭仕）。

1.4 實驗方法

1.4.1 誘癌劑制備：參照4NQO誘導(dǎo)小鼠食管原位癌模型法［7］，將誘癌劑4NQO溶解于1，2-丙二醇中，配制濃度為2%的母液，于-20 ℃冰箱中保存，使用時用純凈水稀釋成濃度為0.1 g/L的工作液。

1.4.2 分組與給藥：90只C57BL/6小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（Control組，n=15）、單純4NQO誘癌組（4NQO組，n=25）、4NQO+SJC低劑量組［4NQO/SJC（91 mg）組，n=25］和4NQO+SJC高劑量組［4NQO/SJC（182 mg）組，n=25］。除Control組外，其余各組小鼠均予濃度為0.1 g/L的4NQO溶液自由飲用，16周后均改用普通飲用水；所有小鼠給予普通飼料，4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組小鼠第8周開始給予混入SJC顆粒的飼料，飼料干預(yù)至32周。參考SJC臨床給藥劑量30～60 g（人平均體質(zhì)量60 kg，鼠平均體質(zhì)量20 g，換算系數(shù)9.1∶1［8］），4NQO/SJC（91 mg）組的給藥劑量為91 mg/d，4NQO/SJC（182 mg）組的給藥劑量為182 mg/d。

1.4.3 小鼠一般情況與體質(zhì)量測定：觀察小鼠活動情況，記錄其精神狀況和進食飲水情況，每隔8周分組測量小鼠體質(zhì)量并進行記錄。

1.4.4 組織處理：32周后，0.3%戊巴比妥鈉0.05 mL/g過量麻醉處死小鼠，剝離取出食管組織并肉眼檢查。將食管組織平鋪固定于防靜電橡膠板上，檢查其表面是否光滑或明顯增粗，有無凹凸不平或小結(jié)節(jié)，拍照記錄后將組織固定、脫水、透明、包埋，最終切為厚度4 μm的薄片。

1.4.5 食管組織蘇木素-伊紅（HE）染色和病理學(xué)分析：脫蠟水化后，將切片依次進行蘇木素染色和伊紅染色，脫水透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察食管組織的病理變化，由2位病理學(xué)專業(yè)人員獨立判斷，若2位專家意見不同，由第3位專家進行判斷。可觀察到的病理組織結(jié)構(gòu)有正常上皮、輕度異型增生、重度異型增生與鱗狀細胞癌。

1.4.6 取部分食管組織準確稱量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9加入0.9%氯化鈉溶液，剪碎勻漿，離心10 min（離心半徑8.5 cm，轉(zhuǎn)速2 500 r/min），取上清液待測。檢測時按照試劑盒說明書操作，在520 nm處測定吸光度值，按照說明書公式計算出食管組織中的Fe2+濃度。取上述上清液，按說明書配置不同比例的工作液，按順序依次加入混合，在532 nm處檢測MDA吸光度值，在405 nm處檢測GSH吸光度值，按照說明書公式分別計算待測樣本中MDA和GSH的含量。

1.4.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測食管組織NCOA4、GPX4蛋白表達：取材后分別提取各組小鼠的食管組織蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜后，用一抗及熒光二抗對其進行孵育，Odyssey檢測儀顯影。以β肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用Image J軟件計算NCOA4、GPX4的蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 27.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，等級資料采用秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制小鼠的生存曲線，生存曲線的比較采用Breslow檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠一般情況、體質(zhì)量、生存率比較

實驗開始8周內(nèi)各組小鼠一般情況無明顯差異，16周經(jīng)4NQO處理小鼠較Control組活動減弱，精神萎靡。其中，4NQO/SJC（91 mg）組與4NQO/SJC（182 mg）組小鼠相較于單純4NQO誘癌組更為活躍，精神較好。

4組小鼠造模0周體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），造模8、16、24、32周體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。組間比較結(jié)果顯示，造模8、16、24、32周4NQO組、4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組小鼠體質(zhì)量低于Control組，32周4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組小鼠體質(zhì)量高于4NQO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

Breslow檢驗結(jié)果顯示，4組小鼠生存曲線比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.907，P=0.019），其中Control組生存率為100%，4NQO組生存率為56%，4NQO/SJC（91 mg）組生存率為76%，4NQO/SJC（182 mg）組生存率為80%，見圖1。

2.2 4組小鼠食管大體形態(tài)觀察

Control組小鼠食管管壁平滑，彈性充足，4NQO組小鼠食管管壁有明顯增粗現(xiàn)象，彈性較差，多見大小不等結(jié)節(jié)，尤其在食管中下段最為常見，4NQO/SJC（91 mg）組和4NQO/SJC（182 mg）組小鼠食管變化介于上述兩組之間，較4NQO組食管光滑細潤，結(jié)節(jié)數(shù)量相對較少，見圖2。

2.3 4組小鼠食管組織HE染色及病理學(xué)分析結(jié)果

HE染色可使細胞核與胞質(zhì)內(nèi)核酸染成藍色，細胞質(zhì)與細胞外基質(zhì)染成紅色。染色結(jié)果可見，Control組小鼠食管組織未發(fā)現(xiàn)異常病理改變，上皮組織基底層完整，上皮層薄厚適度，細胞排列整齊；4NQO組小鼠食管上皮組織呈現(xiàn)異常增生，細胞排列紊亂，出現(xiàn)角化珠等異常病理改變；與4NQO組比較，4NQO/SJC（91 mg）組和4NQO/SJC（182 mg）組食管上皮組織病理學(xué)改變明顯改善，其中4NQO/SJC（182 mg）組病變水平較4NQO/SJC（91 mg）低，見圖3。

病理結(jié)果表明，32周后Control組小鼠食管未發(fā)現(xiàn)明顯病理組織改變；4NQO組小鼠（n=14）有14.3%（2/14）組織標本出現(xiàn)輕度異型增生，35.7%（5/14）組織標本出現(xiàn)中度異型增生，50.0%（7/14）樣本出現(xiàn)鱗狀細胞癌；4NQO/SJC（91 mg）組小鼠（n=19）有31.6%（6/19）組織標本出現(xiàn)輕度異型增生，有42.1%（8/19）組織標本出現(xiàn)重度異型增生，有26.3%（5/19）組織標本出現(xiàn)鱗狀細胞癌；4NQO/SJC（182 mg）組小鼠（n=20）有45.0%（9/20）組織標本出現(xiàn)輕度異型增生，40.0%（8/20）組織標本出現(xiàn)重度異型增生，15.0%（3/20）組織標本出現(xiàn)鱗狀細胞癌。3組小鼠病理結(jié)果分型比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。

2.4 4組小鼠食管組織Fe2+、GSH和MDA含量比較

4組小鼠食管組織Fe2+、GSH和MDA含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中4NQO組、4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組Fe2+、MDA均低于Control組（P<0.05），GSH均高于Control組；4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組Fe2+、MDA均高于4NQO組，GSH均低于4NQO組（P<0.05）；4NQO/SJC（182 mg）組Fe2+、MDA均高于4NQO/SJC（91 mg）組，GSH均低于4NQO/SJC（91 mg）組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.5 4組小鼠食管組織NCOA4、GPX4蛋白表達水平

4組小鼠食管組織NCOA4、GPX4蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。組間比較結(jié)果顯示，4NQO組NCOA4低于Control組、4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組，GPX4高于Control組、4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組（P<0.05）；4NQO/SJC（91 mg）組、4NQO/SJC（182 mg）組GPX4高于Control組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3、圖4。

3 討論

食管癌在中醫(yī)上謂之“噎膈”，歷代醫(yī)家各有論述。作為治療噎膈的傳統(tǒng)藥物，SJC以其清熱解毒、消腫散結(jié)之功被沿用至今。研究表明，SJC及其提取物具有顯著的抗癌效果，對乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤均療效顯著［9-11］。本團隊前期研究已經(jīng)證實SJC通過腺苷酸活化蛋白激酶/Unc-51樣激酶1（AMPK/ULK1）信號通路誘導(dǎo)食管癌細胞發(fā)生自噬［12］。本研究發(fā)現(xiàn)4NQO組小鼠相較Control組小鼠食管增粗，表面凹凸不平，出現(xiàn)大小不等結(jié)節(jié)，組織惡性病理改變表明小鼠原位食管癌模型誘導(dǎo)成功。而與4NQO組比較，不同劑量SJC干預(yù)后小鼠的食管變細，結(jié)節(jié)減少，病理改變程度減輕，并且生存率明顯提高。這表明SJC的干預(yù)可以顯著抑制小鼠食管原位癌的進展。

鐵死亡的過程始于游離Fe2+的累積［13］。Fe2+激活芬頓反應(yīng)釋放自由基，驅(qū)動脂質(zhì)過氧化，破壞細胞結(jié)構(gòu)并循環(huán)激活芬頓反應(yīng)，釋放出大量的活性氧，引起細胞死亡［14-15］。隨著鐵死亡的進展，過氧化脂質(zhì)逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物，如MDA。而在此過程中，GSH發(fā)揮抗氧化作用，可中和過氧化脂質(zhì)并保護膜的流動性，從而保護細胞和膜免受過氧化，常作為抗氧化指標被檢測［16］?？傊現(xiàn)e2+、MDA、GSH是鐵死亡的重要標志物。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠食管組織中，相較于4NQO組，SJC干預(yù)的小鼠食管組織中Fe2+和MDA含量明顯升高，GSH含量明顯降低。提示SJC可通過促進Fe2+堆積和降低過氧化水平發(fā)揮誘導(dǎo)食管癌鐵死亡發(fā)生的作用。

作為一種新型死亡方式，鐵死亡的發(fā)生與多個細胞代謝調(diào)控系統(tǒng)密切相關(guān)，其中涉及鐵代謝紊亂、氨基酸抗氧化失衡和脂質(zhì)過氧化物累積等［17］。其中，NCOA4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要通過介導(dǎo)鐵蛋白吞噬發(fā)揮作用。鐵蛋白被降解，釋放出游離Fe2+，引起大量Fe2+蓄積最終導(dǎo)致鐵死亡［18］。而GPX4協(xié)同GSH發(fā)揮抗氧化作用，阻礙細胞內(nèi)活性氧的生成，抑制腫瘤細胞鐵死亡的發(fā)生［19］。本實驗中選擇NCOA4和GPX4兩個蛋白作為參考指標，與4NQO組相比，SJC干預(yù)的小鼠食管組織內(nèi)NCOA4蛋白表達量增加，GPX4蛋白表達量降低，說明SJC促進了小鼠食管腫瘤細胞鐵死亡的發(fā)生，其機制可能與NCOA4、GPX4有關(guān)。

目前，食管癌發(fā)病機制尚未完全明確。因此，中藥以其多成分、多靶點的特征在食管癌防治過程中作用巨大，但同時也導(dǎo)致了相關(guān)作用機制不明等問題。本研究為SJC治療食管癌提供了理論依據(jù)，為其作用機制的探究提供了新的思路。

作者貢獻：李晶提出研究思路、負責(zé)文章的質(zhì)量控制，對論文負責(zé)；林鑫榮設(shè)計研究方案，進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，論文撰寫；林鑫榮、賈蕾、李麗峰負責(zé)實驗實施、樣本收集及檢測；黃鳴、吳忠冰收集整理數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

本文無利益沖突。

參考文獻

LIU C Q，MA Y L，QIN Q，et al. Epidemiology of esophageal cancer in 2020 and projections to 2030 and 2040［J］. Thorac Cancer，2022，14：3-11. DOI：10.1111/1759-7714.14745.

UHLENHOPP D J，THEN E O，SUNKARA T，et al. Epidemiology of esophageal cancer：update in global trends，etiology and risk factors［J］. Clin J Gastroenterol，2020，13（6）：1010-1021. DOI：10.1007/s12328-020-01237-x.

劉媛，錢榮康，錢榮華. 石見穿及其提取物抗腫瘤的研究進展［J］. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，27（30）：3417-3420. DOI：10.3969/j.issn.1008-8849.2018.30.034.

SHI L，LIU Y Q，LI M H，et al. Emerging roles of ferroptosis in the tumor immune landscape：from danger signals to anti-tumor immunity［J］. Febs J，2022，289（13）：3655-3665. DOI：10.1111/febs.16034.

HASSANNIA B，VANDENABEELE P，VANDEN BERGHE T. Targeting ferroptosis to iron out cancer［J］. Cancer Cell，2019，35（6）：830-849. DOI：10.1016/j.ccell.2019.04.002.

XU G X，WANG H，LI X L，et al. Recent progress on targeting ferroptosis for cancer therapy［J］. Biochem Pharmacol，2021，190：114584. DOI：10.1016/j.bcp.2021.114584.

吳忠冰. 基于“甘潤濡養(yǎng)”法探討啟膈方在食管癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用［D］. 石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2022.

李麥嘉. 酸棗仁湯對間氯苯哌嗪誘導(dǎo)焦慮模型小鼠的干預(yù)作用及機制研究［D］. 濟南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2022.

WANG K N，HU Y，HAN L L，et al. Salvia chinensis benth inhibits triple-negative breast cancer progression by inducing the DNA damage pathway［J］. Front Oncol，2022，12：882784. DOI：10.3389/fonc.2022.882784.

WANG N，TAN H Y，CHAN Y T，et al. Identification of WT1 as determinant of heptatocellular carcinoma and its inhibition by Chinese herbal medicine Salvia chinensis Benth and its active ingredient protocatechualdehyde［J］. Oncotarget，2017，8（62）：105848-105859. DOI：10.18632/oncotarget.22406.

梁偉，王松坡. 石見穿的藥用成份及在抗腫瘤方面的研究［J］. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22（10）：2492-2494. DOI：10.3969/j.issn.1672-4992.2014.10.74.

JIA L，LIN X R，GUO W Y，et al. Salvia chinensia Benth induces autophagy in esophageal cancer cells via AMPK/ULK1 signaling pathway［J］. Front Pharmacol，2022，13：995344. DOI：10.3389/fphar.2022.995344.

ZHANG J J，DU J，KONG N，et al. Mechanisms and pharmacological applications of ferroptosis：a narrative review［J］. Ann Transl Med，2021，9（19）：1503. DOI：10.21037/atm-21-1595.

JIANG X J，STOCKWELL B R，CONRAD M. Ferroptosis：mechanisms，biology and role in disease［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2021，22（4）：266-282. DOI：10.1038/s41580-020-00324-8.

WANG D. Progress in the study of ferroptosis in cancer treatment：state-of-the-Art［J］. Chem Biol Interact，2023，371：110348. DOI：10.1016/j.cbi.2023.110348.

LI D X，ZHANG M L，CHAO H T. Significance of glutathione peroxidase 4 and intracellular iron level in ovarian cancer cells-utilization of ferroptosis mechanism［J］. Inflamm Res，2021，70（10/11/12）：1177-1189. DOI：10.1007/s00011-021-01495-6.

CHEN X，KANG R，KROEMER G，et al. Ferroptosis in infection，inflammation，and immunity［J］. J Exp Med，2021，218（6）：e20210518. DOI：10.1084/jem.20210518.

GAO M H，MONIAN P，PAN Q H，et al. Ferroptosis is an autophagic cell death process［J］. Cell Res，2016，26（9）：1021-1032. DOI：10.1038/cr.2016.95.

XIA X J，F(xiàn)AN X P，ZHAO M Y，et al. The relationship between ferroptosis and tumors：a novel landscape for therapeutic approach［J］. Curr Gene Ther，2019，19（2）：117-124. DOI：10.2174/1566523219666190628152137.

（收稿日期：2023-04-03；修回日期：2023-07-21）

（本文編輯：鄒琳）