化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病菌的抑制作用及機(jī)理

詹鑫婕 陳乾平 蔣妮 宋利沙 丘卓秋 黃琦 潘麗梅 馮世鑫 白丹宇 蔣水元

摘要：采用平板抑菌法結(jié)合盆栽防治試驗(yàn)測(cè)定化橘紅（Citri grandis Exocarpium）揮發(fā)油對(duì)羅漢果（Siraitia grosvenorii）斑枯病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum）的抑制活性。通過(guò)顯微觀察病原菌菌絲體的形態(tài)及測(cè)定揮發(fā)油處理病原菌菌絲體后處理液的電導(dǎo)率及可溶性蛋白質(zhì)含量變化情況，探究化橘紅揮發(fā)油的抑菌機(jī)理。平板抑菌結(jié)果表明，化橘紅揮發(fā)油稀釋≤1 000倍對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率均達(dá)100.0%，顯著高于80%多菌靈可濕性粉劑稀釋1 000倍的抑制率（88.7%）。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，化橘紅揮發(fā)油稀釋1 000倍，45%戊唑·咪鮮胺乳油和10%苯醚甲環(huán)唑乳油對(duì)羅漢果斑枯病病斑擴(kuò)展的抑制率均在80.0%以上，且均顯著高于80%多菌靈可濕性粉劑的抑制率（70.68%）。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)化橘紅揮發(fā)油處理7 d的病原菌菌絲呈念珠狀膨大并有斷裂現(xiàn)象。菌絲體與化橘紅揮發(fā)油共培養(yǎng)結(jié)果表明，混合液的電導(dǎo)率及可溶性蛋白質(zhì)含量均隨著化橘紅揮發(fā)油處理濃度的加大、互作時(shí)間的延長(zhǎng)而提高；濃度為2.0 g/L的化橘紅揮發(fā)油與病原菌菌絲共培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率為279.208 μS/cm，為各處理最大值；揮發(fā)油終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、作用60 h后，培養(yǎng)液中的可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)90.6 μg/mL，為各處理的最大值。

關(guān)鍵詞：羅漢果（Siraitia grosvenorii）； 斑枯病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum）； 化橘紅（Citri grandis Exocarpium）； 揮發(fā)油； 抑制作用及機(jī)理

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.67? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）06-0094-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.014 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Inhibition and mechanism of volatile oil of Citri grandis against the

Stagonosporopsis cucurbitacearum of Siraitia grosvenorii

ZHAN Xin-jie1a，1b， CHEN Qian-ping1a，1b， JIANG Ni1a，1b， SONG Li-sha1a，1b， QIU Zhuo-qiu1a，1b，

HUANG Qi1a，1b， PAN Li-mei1a，1b， FENG Shi-xin1a，1b， BAI Dan-yu1a， JIANG Shui-yuan2

（1a.Guangxi Key Laboratory for High Quality Formation and Utilization of Dao-Di Herbs/Guangxi Traditional Chinese Medicine Breeding Technology Innovation Center；1b.National Center for Traditional Chinese Medicine Inheritance and Innovation， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning? 530023，China；2. Guangxi Institute of Botany， The Chinese Academy of Sciences， Guilin? 541006，Guangxi，China）

Abstract： The inhibitory activity of Citri grandis oil on Stagonosporopsis cucurbitacearum of Siraitia grosvenorii was determined by the plate bacteriostatic method combined with pot experiment. The antifungal mechanism of the volatile oil of Citri grandis was investigated by observing the morphology of pathogenic mycelia and measuring the change of conductivity and soluble protein content in the treatment solution of pathogenic mycelia treated by volatile oil. The results of the plate antibacterial test indicated that the inhibition rate of bacterial filamentum growth was 100.0% when the volatile oil was diluted less than 1 000 times， which was significantly higher than the inhibition rate of 80% carbendazim wettable powder diluted 1 000 times （88.7%）. The results of pot experiment showed that when the volatile oil was diluted 1 000 times， the inhibition rates of 45% pentazole-imimidazole emulsion and 10% difenoconazole emulsion were both above 80.0%， and significantly higher than that of 80% carbendazim wettable powder （70.68%）. Under the microscope， it was found that the pathogenic mycelia treated with Citri grandis volatile oil for 7 days showed a moniliform expansion and fracture phenomenon. The results of co-culture of mycelium with volatile oil showed that the conductivity and soluble protein content of the mixture increased with the increase of volatile oil concentration and the prolongation of interaction time. The conductivity of the culture medium was 279.208 μS/cm， which was the maximum value of each treatment， when volatile oil with the concentration of 2.0 g/L was co-cultured with pathogenic mycelia for 48 h. When the final mass fraction of volatile oil was 0.2%， the soluble protein content in culture medium reached 90.6 μg/mL after 60 h of treatment， which was the maximum value of each treatment.

Key words： Siraitia grosvenorii； Stagonosporopsis cucurbitacearum； Citri grandis Exocarpium； essential oil； inhibition and mechanism

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為葫蘆科多年生植物，其干燥果實(shí)是中國(guó)特有的藥食兩用中藥材，具有清熱潤(rùn)肺、利咽開(kāi)音及生津止渴等功效，是歷版《中國(guó)藥典》收錄品種［1］。羅漢果果實(shí)中含有豐富的高甜度低熱量羅漢果甜苷，作為低熱量甜味劑大量出口到歐美和日本等地［2，3］。廣西是羅漢果的主產(chǎn)區(qū)及道地產(chǎn)區(qū)，全國(guó)80%以上的羅漢果產(chǎn)自廣西桂林［4-6］。但栽培歷史悠久導(dǎo)致的病害種類(lèi)多，尤其是近年來(lái)桂林等主產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)的羅漢果新病害——羅漢果斑枯病，對(duì)羅漢果生長(zhǎng)為害更嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，惡霉靈、戊唑醇和咪鮮胺等化學(xué)農(nóng)藥能在一定程度上抑制羅漢果斑枯病發(fā)生，但是隨著化學(xué)農(nóng)藥的逐年使用，部分果園已開(kāi)始出現(xiàn)抗（耐）藥性，同時(shí)也帶來(lái)了農(nóng)殘積累等系列問(wèn)題［7，8］。中國(guó)傳統(tǒng)中藥材化橘紅（Citri grandis Exocarpium）中含有檸檬烯、月桂烯、萜品烯和石竹烯等大量揮發(fā)油成分，這些成分均具有祛痰、止咳、鎮(zhèn)痛和殺菌消炎等作用［9］，但目前鮮見(jiàn)化橘紅揮發(fā)油抑殺植物病原微生物的報(bào)道。因此，探究化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum）的抑制作用及機(jī)理，對(duì)該病的生物防治、植物源農(nóng)藥開(kāi)發(fā)及促進(jìn)廣西羅漢果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。在有害生物的可持續(xù)控制中，植物源農(nóng)藥對(duì)環(huán)境友好、安全有效，是保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段，也是今后農(nóng)藥工業(yè)發(fā)展的方向［10］。揮發(fā)油又稱(chēng)芳香油或植物精油，是一類(lèi)揮發(fā)性高、滲透性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗藥性的植物次生代謝產(chǎn)物，不僅是醫(yī)藥及食品行業(yè)開(kāi)發(fā)為天然抗菌防腐藥劑的熱點(diǎn)，且在防治植物病害上也具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值［11，12］。目前已有植物揮發(fā)油具有抑菌活性的報(bào)道。王宏年等［13］研究發(fā)現(xiàn)，香茅精油處理番茄灰霉病菌72 h對(duì)菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出強(qiáng)抑制活性；劉耀華等［14］報(bào)道香茅精油對(duì)番茄早疫病菌也表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌活性?？梢?jiàn)，香茅揮發(fā)油對(duì)番茄發(fā)生的多種病害均表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性。植物揮發(fā)油不僅對(duì)某種植物的多種病害表現(xiàn)抗性，對(duì)不同植物的不同病原菌也表現(xiàn)出抗性，即具廣譜特性，如肉桂揮發(fā)油是具有廣譜殺菌活性的植物提取物，對(duì)番茄灰霉病菌和莖枯病菌、蘋(píng)果青霉病菌、黃瓜鐮刀菌及禾谷鐮孢菌等多種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性［15，16］；紫蘇、八角和天竺葵3種植物揮發(fā)油對(duì)不同植物病原菌也表現(xiàn)出抑制活性［17-19］。此外，植物揮發(fā)油在農(nóng)藥領(lǐng)域獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值還表現(xiàn)在病原菌不易產(chǎn)生抗藥性方面。已有研究認(rèn)為，揮發(fā)油是一類(lèi)混合物，其抑菌活性物質(zhì)可能不是單一化合物，而是發(fā)揮聯(lián)合作用的多種抑菌物質(zhì)，且多種揮發(fā)油混合能顯著提高抑菌活性［12，20］。此外，目前揮發(fā)油抑菌機(jī)理研究多集中在對(duì)病原菌細(xì)胞膜的破壞方面，但不只是由單個(gè)特定的機(jī)制引起，而是復(fù)雜的一連串細(xì)胞反應(yīng)［12，20］。植物揮發(fā)油抑菌機(jī)理的復(fù)雜性、抑菌活性物質(zhì)的多元化降低了病原菌產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于羅漢果斑枯病病原菌的研究主要集中在分類(lèi)鑒定、殺菌劑的室內(nèi)篩選方面，尚未見(jiàn)生物防治方面的研究報(bào)道。評(píng)價(jià)揮發(fā)油抑殺微生物的生物效果，掌握其作用機(jī)理是更好利用這類(lèi)天然產(chǎn)物的基礎(chǔ)，但迄今關(guān)于化橘紅揮發(fā)油防治羅漢果斑枯病及其抑菌作用機(jī)理的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究在室內(nèi)試驗(yàn)條件下測(cè)定化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病的抑菌效果，初步探討其抑菌機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)植物源殺菌劑防治羅漢果斑枯病及促進(jìn)廣西羅漢果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 化橘紅采集于廣西河池市天峨縣化橘紅生態(tài)種植基地。化學(xué)農(nóng)藥為10%苯醚·甲環(huán)唑水分散劑（北京綠色農(nóng)華植?？萍加邢薰荆?5%戊唑·咪鮮胺乳油（美國(guó)喬貝爾作物保護(hù)有限公司）、80%多菌靈可濕性粉劑（安徽華星化工有限公司）。羅漢果斑枯病菌（病原真菌）由廣西藥用植物園植物病理研究室提供。羅漢果植株為廣西植物研究所提供的羅漢果1號(hào)一年生扦插苗。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，去離子水1 L，用于植物病原真菌培養(yǎng)及室內(nèi)抑菌試驗(yàn)。PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，去離子水1 L，用于電導(dǎo)率及蛋白質(zhì)含量測(cè)定試驗(yàn)。

1.2 方法

試驗(yàn)于2021年5—8月在廣西藥用植物園植保研究室進(jìn)行。

1.2.1 化橘紅揮發(fā)油提取 將未成熟的化橘紅外層果皮干燥后，粉碎過(guò)二號(hào)至三號(hào)篩，混合均勻，稱(chēng)重0.5 kg，加10倍量水，按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部2204揮發(fā)油測(cè)定法（甲法）提取揮發(fā)油。

1.2.2 化橘紅揮發(fā)油對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定化橘紅揮發(fā)油對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。取一定量的揮發(fā)油，用毛細(xì)管滴入8～10滴吐溫-80，無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻，用未冷卻（45 ℃）的PDA培養(yǎng)基將揮發(fā)油依次稀釋500、? ? 1 000、2 000、4 000、8 000倍，每個(gè)濃度重復(fù)3次，以加等量吐溫-80的無(wú)菌水為陰性對(duì)照。3種供試殺菌藥劑（陽(yáng)性對(duì)照）的濃度參考其商品使用說(shuō)明（表1），用未冷卻的PDA培養(yǎng)基稀釋?zhuān)刻幚碇貜?fù)3次。待平板冷卻凝固后移入直徑為6 mm的羅漢果斑枯病病原菌菌餅，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d（此時(shí)對(duì)照病原菌菌絲已長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿），用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑（mm），計(jì)算抑制率。

菌落擴(kuò)展直徑=實(shí)測(cè)菌落直徑-6 mm

抑制率=（對(duì)照菌落擴(kuò)展直徑-處理菌落擴(kuò)展直徑）/對(duì)照菌落擴(kuò)展直徑×100%

1.2.3 盆栽防治試驗(yàn) 盆栽防治試驗(yàn)在廣西藥用植物園植物培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。取一定量的揮發(fā)油，用毛細(xì)管滴入8～10滴吐溫-80，用無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻，用滅菌水將其稀釋1 000倍，使得揮發(fā)油終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.100 0%，以加等量吐溫-80無(wú)菌水為對(duì)照（CK）。3種供試殺菌劑按照其商品包裝的使用說(shuō)明，用滅菌水稀釋相應(yīng)倍數(shù)備用。每處理3盆，每盆1株羅漢果，每株羅漢果接種病原菌10張葉片，每張葉片2個(gè)接種點(diǎn)（菌餅有傷接種），分別在接種后2、5、10 d噴施稀釋好的揮發(fā)油及殺菌劑。在接種后17 d，用十字交叉法測(cè)量各病斑直徑（cm），分別計(jì)算處理組和對(duì)照組的平均病斑直徑，計(jì)算抑制率。

發(fā)病率=接種后發(fā)病接種點(diǎn)數(shù)/接種點(diǎn)數(shù)×100%

防治效果=（對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率） /對(duì)照發(fā)病率×100%

病斑平均直徑=各病斑直徑之和/測(cè)量的病斑數(shù)

病斑擴(kuò)展抑制率=（對(duì)照平均病斑直徑-處理平均病斑直徑） /對(duì)照平均病斑直徑×100%

1.2.4 揮發(fā)油對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響 分別挑取在PDA和含揮發(fā)油（1 000.0 mg/L）PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的病原菌菌絲，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.2.5 揮發(fā)油對(duì)病原菌菌絲細(xì)胞膜的影響 用打孔器分別在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的病原菌菌落邊緣打取直徑為6 mm的3塊菌餅，接入PDB培養(yǎng)基中，在150 r/min、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)5 d，取出菌絲團(tuán)用去離子水沖洗過(guò)濾3次后真空抽濾備用。用滅菌水配制濃度為2.0、1.0、0.5 g/L的化橘紅揮發(fā)油藥液，稱(chēng)取1.0 g備用菌絲加入到20 mL揮發(fā)油藥液中，于150 r/min、28 ℃條件下振蕩5、12、24、48 h，用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率，扣除背景電導(dǎo)率。以滅菌水作對(duì)照，各處理重復(fù)3次。

1.2.6 揮發(fā)油對(duì)病原菌菌絲體孢外蛋白質(zhì)含量的影響 取直徑為6 mm的菌餅接種到100 mL PDB培養(yǎng)液中，再在培養(yǎng)液中分別加入不同體積的揮發(fā)油，使得揮發(fā)油終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05%（揮發(fā)油稀釋? ? ?2 000倍，處理1）、 0.10%（揮發(fā)油稀釋1 000倍，處理2）和0.20%（揮發(fā)油稀釋500倍，處理3），于150 r/min、28 ℃的恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，混合培養(yǎng) 5、12、24、48、36、60 h后，分別將菌絲體和培養(yǎng)液分離，同時(shí)將回收的培養(yǎng)液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液待測(cè)。培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），以Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，以O(shè)rigin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲的抑制作用

由表1可知，化橘紅揮發(fā)油稀釋500、1 000、? ? ? 2 000、4 000、8 000倍對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲的抑制率分別為100.0%、100.0%、70.8%、29.5%、6.5%。此外，化橘紅揮發(fā)油稀釋1 000倍對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率與10%苯醚·甲環(huán)唑水分散劑和45%戊唑·咪鮮胺乳油相同，均為100.0%，且均顯著高于稀釋1 000倍的80%多菌靈可濕性粉劑對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲的抑制率（88.7%）（P<0.05，下同）?？梢?jiàn)，化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)具有強(qiáng)抑制作用，在稀釋1 000倍以?xún)?nèi)，能達(dá)到與化學(xué)農(nóng)藥相同的抑制效果，但會(huì)隨著揮發(fā)油濃度的降低而減弱，稀釋至8 000倍基本不能抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)。

2.2 化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病的防治效果

由表2可知，對(duì)照羅漢果斑枯病的發(fā)病率為100.0%，而化橘紅揮發(fā)油稀釋1 000倍處理后，羅漢果斑枯病的發(fā)病率為23.3%，防治效果為76.7%，可見(jiàn)化橘紅揮發(fā)油能減少病害的發(fā)生率，且防治效果顯著高于化學(xué)藥劑多菌靈（68.3%）。供試的化學(xué)殺菌劑45%戊唑·咪鮮胺乳油和10%苯醚·甲環(huán)唑水分散劑對(duì)羅漢果斑枯病的防治效果分別為83.3%、80.0%。化橘紅揮發(fā)油、45%戊唑·咪鮮胺乳油、10%苯醚·甲環(huán)唑水分散劑對(duì)病斑擴(kuò)展的抑制率均大于80.0%，且均顯著高于80%多菌靈可濕性粉劑對(duì)病斑擴(kuò)展的抑制率（70.7%）?？梢?jiàn)，化橘紅揮發(fā)油不僅可以降低病害的發(fā)生率，同時(shí)還可抑制病斑的擴(kuò)大，有效減輕羅漢果斑枯病的危害。

2.3 化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲形態(tài)的影響

從圖1可以看出，CK菌落生長(zhǎng)旺盛，菌絲濃密，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲粗細(xì)均勻、纖細(xì)直長(zhǎng)，胞外無(wú)外滲物，分枝正常（圖1A）；揮發(fā)油處理組的菌落生長(zhǎng)緩慢，菌絲稀疏，光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲呈念珠狀膨大，一些還出現(xiàn)溶解斷裂現(xiàn)象（圖1B和圖1C）。此外，當(dāng)揮發(fā)油稀釋≤1 000倍時(shí)，菌落幾乎不生長(zhǎng)。說(shuō)明化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)及形態(tài)均有不同程度的影響。

2.4 化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲細(xì)胞膜的影響

由表3可知，化橘紅揮發(fā)油處理后，羅漢果斑枯病病原菌菌絲體的細(xì)胞膜透性（菌絲體電導(dǎo)率）發(fā)生了變化。其中，CK菌絲體的電導(dǎo)率整體變化不明顯，而化橘紅揮發(fā)油處理組菌絲體的電導(dǎo)率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和處理濃度的增大均相應(yīng)增大，揮發(fā)油濃度2.0 g/L、處理48 h時(shí)，菌絲體的電導(dǎo)率為279.208 μS/cm，顯著高于其他處理，此時(shí)CK菌絲體的電導(dǎo)率僅為1.781 μS/cm，顯著低于其他處理?？梢?jiàn)，經(jīng)揮發(fā)油處理后，羅漢果斑枯病病原菌菌絲體的細(xì)胞膜透性增大，電導(dǎo)率升高，且與揮發(fā)油的濃度和處理時(shí)間成正比。

2.5 化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲體胞外蛋白質(zhì)的影響

由圖2可以看出，化橘紅揮發(fā)油處理菌絲體后，培養(yǎng)液的可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著高于CK，說(shuō)明化橘紅揮發(fā)油處理導(dǎo)致羅漢果斑枯病病原菌菌絲體內(nèi)原生質(zhì)外滲；隨著揮發(fā)油濃度的增加及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液的可溶性蛋白質(zhì)含量均隨之逐漸增加，其中處理3（揮發(fā)油終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%）與病原菌菌絲體共培養(yǎng)60 h后，培養(yǎng)液中的可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)90.6 μg/mL，為各處理的最大值。方差分析結(jié)果表明，相同作用時(shí)間不同培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為處理3>處理2>處理1，且差異顯著。說(shuō)明化橘紅處理濃度的增加能增強(qiáng)其對(duì)羅漢果斑枯病病原菌菌絲體細(xì)胞壁的破壞作用。

3 討論

揮發(fā)油是一類(lèi)揮發(fā)性高、滲透性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗藥性的植物次生代謝產(chǎn)物［21］。揮發(fā)油是中國(guó)傳統(tǒng)芳香中藥材中具有代表性的有效組分，其顯著的抗細(xì)菌及抗真菌活性在解決耐藥性細(xì)菌和真菌引發(fā)的人體疾病問(wèn)題方面具有重要意義［15，22］。利用揮發(fā)油防治植物病原微生物逐漸引起了人們的關(guān)注，目前已有植物精油防治植物重要病害的相關(guān)報(bào)道，國(guó)外已開(kāi)發(fā)出一些精油類(lèi)農(nóng)藥，中國(guó)也開(kāi)始重視對(duì)植物精油殺菌劑的研發(fā)［23］。已有研究表明，中藥材遼細(xì)辛、土荊芥、茅蒼術(shù)、香茅等揮發(fā)油（精油）對(duì)黃瓜灰霉病菌、灰葡萄孢菌、交鏈孢菌、番茄早疫病菌、瓜果腐酶和尖鐮孢菌等植物病原真菌均有良好的抑制活性作用［14，24-26］。本研究以羅漢果斑枯病菌為靶標(biāo)，利用化橘紅揮發(fā)油對(duì)該病原真菌開(kāi)展抑菌活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化橘紅揮發(fā)油稀釋≤1 000倍時(shí)能完全抑制菌絲的生長(zhǎng)，其抑制率與化學(xué)殺菌劑10%苯醚·甲環(huán)唑水分散劑稀釋2 000倍、45%戊唑·咪鮮胺乳油稀釋2 000倍的抑制率相當(dāng)，均為100.0%；盆栽防治試驗(yàn)結(jié)果顯示，化橘紅揮發(fā)油稀釋1 000倍、10%苯醚·甲環(huán)唑水分散劑稀釋2 000倍和45%戊唑·咪鮮胺乳油稀釋2 000倍對(duì)病斑擴(kuò)展的抑制率均達(dá)80.0%以上，抑制效果均顯著優(yōu)于稀釋1 000倍的80%多菌靈可濕性粉劑。可見(jiàn)，化橘紅揮發(fā)油在羅漢果斑枯病害的生物防治領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。但化橘紅揮發(fā)油對(duì)其他病原真菌的抑制效果還有待進(jìn)一步探討。

植物揮發(fā)油對(duì)有害微生物具有抗菌活性的研究較多，但對(duì)其抗菌機(jī)理的研究尚少，且多集中在破壞微生物的細(xì)胞膜引起細(xì)胞器損傷進(jìn)而影響細(xì)胞生理功能方面。細(xì)胞膜是保護(hù)微生物正常生理代謝的生物屏障，細(xì)胞膜受損后細(xì)胞內(nèi)部的K+和Na+電解質(zhì)會(huì)大量滲出，導(dǎo)致培養(yǎng)液電導(dǎo)率上升；同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì)外滲［12］。羅曼等［21］的報(bào)道證實(shí)山蒼子香精油中的檸檬醛能改變黃曲霉質(zhì)膜的選擇通透性，使其核 DNA 產(chǎn)生不可逆損傷，從而抑制菌絲體生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)。陳利軍等［25］的研究發(fā)現(xiàn)，土荊芥揮發(fā)油熏蒸處理灰葡萄孢能使菌體死亡，主要機(jī)理是菌絲體的細(xì)胞膜通透性受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物和蛋白質(zhì)外滲。劉耀華等［14］的研究表明香茅精油處理番茄早疫病菌12 h后，菌絲體的電導(dǎo)率及可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著提高。本研究的羅漢果斑枯病菌與化橘紅揮發(fā)油共培養(yǎng)結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，菌液的電導(dǎo)率及可溶性蛋白質(zhì)含量均隨著揮發(fā)油處理濃度的加大、互作時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，由此初步認(rèn)為化橘紅揮發(fā)油可破壞菌絲體細(xì)胞膜的通透性，從而導(dǎo)致病原菌細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)滲漏，故電導(dǎo)率及可溶性蛋白質(zhì)含量隨之相應(yīng)增加。本研究?jī)H從光學(xué)顯微鏡中看到病原菌菌絲體膨大畸形并有部分?jǐn)嗔?，在今后的研究中將通過(guò)掃描電鏡或透視電鏡等進(jìn)一步觀察、驗(yàn)證揮發(fā)油對(duì)菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組織結(jié)構(gòu)完整性的影響。此外，還可通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從分子水平上研究揮發(fā)油對(duì)菌絲體DNA和RNA生物合成和代謝的影響。同時(shí)，化橘紅揮發(fā)油中是某種活性成分發(fā)揮了誘導(dǎo)效應(yīng)，還是多種成分共同作用破壞羅漢果斑枯病菌細(xì)胞膜的完整性，有待進(jìn)一步深入探究。

4 小結(jié)

化橘紅揮發(fā)油對(duì)羅漢果斑枯病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，能導(dǎo)致病原菌菌絲體膨大畸形，溶解斷裂；可破壞病原菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)外漏，菌體死亡；稀釋≤1 000倍對(duì)羅漢果斑枯病病原菌絲生長(zhǎng)的抑制率均達(dá)100.0%，對(duì)羅漢果斑枯病病斑擴(kuò)展的抑制率達(dá)80.4%。因此，化橘紅揮發(fā)油具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用為植物源農(nóng)藥防治羅漢果斑枯病的潛力。

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