基于線粒體D-loop序列的江蘇克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析

魯蘇皖 徐宇 李佳佳 高志寶 嚴維輝 許志強 王興強 李旭光

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.026

摘要：江蘇是我國克氏原螯蝦的主產(chǎn)區(qū)，近年來繁養(yǎng)模式不斷變化，多代繁養(yǎng)后的遺傳多樣性變化情況尚未可知，以及江蘇地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖種群的群體遺傳學(xué)特征數(shù)據(jù)尚不清楚。為研究當(dāng)前江蘇主產(chǎn)區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性特征，對來自江蘇南京、徐州、連云港、揚州、淮安、無錫、泰州興化和宿遷泗洪的8個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體樣本的線粒體控制區(qū)D-loop基因片段進行PCR擴增和測序分析，分析了不同養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)特點。共測序獲得了8個群體223個樣本的線粒體D-loop序列，比對長度包括863個位點，其中，變異位點95個，簡約信息位點25個。基因序列中AT含量（80.01%）高于CG含量（19.99%），表現(xiàn)出較為明顯的堿基組成偏倚性。223個樣本共定義了37種單倍型，其中，單倍型Hap 1為8個群體的共有單倍型。泗洪群體獨有的單倍型最多，泰州興化群體獨有的單倍型最少。本研究所涉及的養(yǎng)殖群體總體單倍型多樣性指數(shù)（Hd）為0.39，總體核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）為0.003 37，遺傳多樣性處于較低水平。其中，宿遷泗洪群體的遺傳多樣性指數(shù)最高（Hd為0.632），興化群體的遺傳多樣性指數(shù)最低（Hd為0.228）。不同群體間的遺傳距離總體較小，其中，南京群體與其他群體間的遺傳距離相對較大（0.005），提示南京群體與其他群體間的基因交流較少。8個養(yǎng)殖群體間的遺傳分化系數(shù)為-0.219 6～0.317 33，徐州、揚州、無錫及連云港群體間的遺傳分化系數(shù)為負值，表明這些群體間存在較為頻繁的基因交流。分子方差分析（A-MOVA）結(jié)果顯示，95.35%的遺傳變異來自于群體內(nèi)，群體間的遺傳變異較少（4.65%）。最小跨度網(wǎng)絡(luò)圖和系統(tǒng)發(fā)育分析均未顯示出單倍型與不同群體的對應(yīng)關(guān)系，提示當(dāng)前江蘇克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體間的基因交流較為頻繁。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）；江蘇地區(qū)；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S968.22? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0192-05

收稿日期：2023-07-21

基金項目：江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項目（編號：JBGS［2021］032）；江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（克氏原螯蝦）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（編號：JATS［2022］411）；江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項目（編號：PZCZ201746）。

作者簡介：魯蘇皖（1997— ），男，江蘇宿遷人，碩士研究生，主要從事甲殼動物增養(yǎng)殖研究。E-mail：136502596@qq.com。

通信作者：李旭光，博士，研究員，主要從事水生甲殼類繁育和生態(tài)養(yǎng)殖研究。E-mail：xuguangli1981@163.com。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，屬于節(jié)肢動物門甲殼亞目軟甲綱十足目螯蝦科，原產(chǎn)于美洲，20世紀30年代從日本引入我國南京，2021年，我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積173萬hm2、產(chǎn)量263.36萬t，現(xiàn)已成為我國最重要的水產(chǎn)經(jīng)濟物種之一［1］。長期以來，國內(nèi)克氏原螯蝦養(yǎng)殖過程中普遍采用繁養(yǎng)一體的繁育方式、捕大留小的捕撈手段，捕撈剩下的小個體成蝦留塘自繁自養(yǎng)，繁養(yǎng)過程中的“逆向選擇”問題較為嚴重。水產(chǎn)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性評估對良種選育和資源保護等方面具有重要意義。王長忠等對長江中下游地區(qū)野生的克氏原螯蝦的遺傳多樣性進行了本底調(diào)查，研究表明4個克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性處于中等水平［2］。曹玲亮使用了微衛(wèi)星標記分析了安徽3個水系中野生克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)調(diào)查水域中克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性處于較高水平，但多個群體存在瓶頸效應(yīng)［3］。彭剛對安徽地區(qū)的克氏原螯蝦養(yǎng)殖和野生群體進行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)安徽地區(qū)克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖群體具有較高的遺傳多樣性［4］。邢智珺對江蘇地區(qū)克氏原螯蝦野生群體進行了群體遺傳學(xué)特征研究，發(fā)現(xiàn)江蘇克氏原螯蝦野生群體遺傳多樣性較高，不同群體間存在中度遺傳分化［5］。而有關(guān)江蘇地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性鮮有報道。

線粒體D-loop區(qū)缺乏編碼的壓力，是線粒體基因中變異速率最快的區(qū)域，常被用來研究種群間及種群內(nèi)的遺傳分化。江蘇是我國克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)源地，養(yǎng)殖時間長，養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展規(guī)模大，同樣存在繁養(yǎng)過程中“逆向選擇”的問題，目前產(chǎn)生的種質(zhì)資源退化問題與遺傳多樣性之間的關(guān)系尚不明確。本研究以江蘇克氏原螯蝦主要養(yǎng)殖地區(qū)群體作為研究對象，基于線粒體D-loop區(qū)序列變異分析研究了多個養(yǎng)殖群體的群體遺傳學(xué)特征，以期為克氏原螯蝦良種選育及合理選擇繁養(yǎng)模式提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 樣本采集

克氏原螯蝦樣本于2021年5—9月收集于無錫、南京、揚州、淮安、泰州興化、宿遷泗洪、連云港、徐州8個地區(qū)的養(yǎng)殖群體（表1），采樣地為江蘇地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖主要產(chǎn)區(qū)。每個地區(qū)樣品采集量30尾以上，共計260尾，所有樣品均活體運輸至實驗室后，取尾部肌肉保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 基因組DNA提取

采用TIANGEN公司的基因組DNA提取試劑盒（DP304）提取不同樣本的基因組DNA，使用核酸蛋白儀（TGem Pro 分光光度計）測定DNA濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.3? PCR擴增、測序

參照克氏原螯蝦線粒體序列信息（JAIWQB 000000000.1）設(shè)計引物用于擴增D-loop區(qū)序列，引物序列為：Crayfish DLOOP-F（5′-TCGCTGTAAAGTTGAAGAAGTT-3′）和Crayfish DLOOP-R（5′-TTAATCTCTTCATATCTTTAATTAC-3′）引物由上海生工生物公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中DNA模版6 μL，正反引物（10 μmoL/L）各2 μL，mix 25 μL（諾唯贊，南京），ddH2O 15 μL。PCR反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，48.5 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一且明亮，送南京生工生物有限公司進行Sanger雙向測序。

1.4? 數(shù)據(jù)分析

測序所得線粒體D-loop區(qū)序列，使用SeqMan軟件進行手動拼接。匯總后使用MEGA 7軟件對齊后手動校對。計算序列堿基組成，變異點位數(shù)及群體間遺傳距離等信息，并基于Neis遺傳距離構(gòu)建UPGMA進化樹。使用DnaSP軟件計算序列的單倍型數(shù)（H）、群體的單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（K）、中性測試Tajimas D。使用Arlequin 3.5軟件計算群體間遺傳分化指數(shù)（Fst），并進行分子方差分析（AMOVA）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 序列特征與遺傳多樣性

由表2可知，8個群體共260尾的克氏原螯蝦經(jīng)過基因組DNA提取、PCR擴增、測序后共獲得223條線粒體D-loop基因序列，經(jīng)過拼接、排序、校對后，獲得全長為863 bp的序列片段，CG含量20.1%。863個核苷酸位點中共有保守位點763個（占88.41%）、突變位點95個、簡約信息位點25個、自裔位點70個。

223條序列中共檢出37種單倍型。其中，Hap 1為8個群體共有單倍型。宿遷泗洪群體獨有的單倍型最多，徐州群體其次，泰州興化獨有的單倍型最少。單倍型Hap 1被173個個體共享，包含個體最多；其次Hap 12，被11個個體共享。

基于克氏原螯蝦線粒體D-loop區(qū)序列，在8個養(yǎng)殖群體中共定義了37個單倍型。由表3可知，單倍型Hap1分布最廣，在8個地區(qū)中均有分布，宿遷泗洪地區(qū)存在的單倍型數(shù)最多，單倍型多樣性最高（Hd=0.632），核苷酸多樣性也最高（Pi=0.00 684）。泰州興化地區(qū)存在的單倍型數(shù)最少（H=3），單倍型多樣性（Hd=0.228）最低。本研究中涉及到的8個養(yǎng)殖群體的總體單倍型多樣性指數(shù)為0.39，江蘇克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性整體處于較低水平。

2.2? 種群遺傳結(jié)果

由表4可知，江蘇地區(qū)8個克氏原螯蝦群體間的遺傳分化系數(shù)Fst為-0.219 60～0.317 33，其中，在無錫地區(qū)與連云港地區(qū)和宿遷泗洪地區(qū)、揚州地區(qū)與徐州地區(qū)和泰州興化地區(qū)、泰州興化地區(qū)和淮安地區(qū)、徐州地區(qū)和揚州地區(qū)這幾個地區(qū)間遺傳分化系數(shù)為負值，表明這幾個地區(qū)間并未出現(xiàn)顯著的遺傳分化。南京地區(qū)的遺傳分化系數(shù)顯著高于其他地區(qū)。揚州地區(qū)的遺傳分化系數(shù)相對低于其他地區(qū)。不同群體間的遺傳距離總體較小，其中，南京群體與其他群體間的遺傳距離相對較大（DA=0.005），表明南京群體與其他群體間的基因交流較少。

由AMOVA分析結(jié)果（表5）可知，總Fst為0.043 09，變異不顯著，其中，95.35%遺傳變異來自于群體內(nèi)，僅有4.65%來自于群體間。

2.3? 單倍型系統(tǒng)進化樹與網(wǎng)絡(luò)圖

由圖1可知，基于Neis遺傳距離對江蘇地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體構(gòu)建UPGMA進化樹，8個群體可分為4組，分別為：淮安地區(qū)、泰州興化地區(qū)和無錫地區(qū)為一組，連云港地區(qū)、徐州地區(qū)和揚州地區(qū)為一組；宿遷泗洪地區(qū)和南京地區(qū)各為一組。

由使用Network軟件生成的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）可知，37種單倍型間關(guān)系中，Hap1單倍型位于網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的中心位置，為8個地區(qū)共有的單倍型，可預(yù)測這一單倍型相對較為原始，周圍的單倍型由其衍生而來。不同的單倍型在各地區(qū)中均有分布，無明顯的譜系分化。

3? 討論

遺傳多樣性是物種對變化的環(huán)境不斷適應(yīng)的結(jié)果，物種為適應(yīng)環(huán)境變化會不斷進化自身，從而產(chǎn)生豐富的基因型［6-7］。本研究中江蘇地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的單倍型多樣性平均值為0.396，核苷酸多樣性平均值為0.003 37。與同樣基于線粒體D-loop區(qū)序列分析的其他甲殼類動物相比，江蘇克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性低于三疣梭子蟹種群（Hd=0.927，Pi=0.024 3），低于日本沼蝦種群（Hd=0.816，Pi=0.019 15）［8-9］，研究發(fā)現(xiàn)，江蘇各克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性無明顯差異，遺傳多樣性整體處于較低水平。與山東克氏原螯蝦野生群體相比（Hd=0.204，Pi=0.003 6），江蘇養(yǎng)殖群體的單倍型多樣性較高［10］。與安徽滁州地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平（Hd=0.373 14，Pi=0.001 72）［11］相近。本研究中，江蘇地區(qū)克氏原螯蝦遺傳多樣性整體不高，造成原因諸多。首先，采樣地區(qū)的克氏原螯蝦苗種多來自池塘自繁，池塘內(nèi)親蝦存在繁殖期內(nèi)1個雌體和多個雄體交配的現(xiàn)象，會導(dǎo)致種質(zhì)資源的退化［12］。其次，江蘇地區(qū)作為克氏原螯蝦的主要養(yǎng)殖地區(qū)，因捕撈壓力逐年增加，導(dǎo)致稀有位點丟失也可能是江蘇地區(qū)的克氏原螯蝦整體遺傳多樣性水平不高的原因之一［13］。泰州興化群體的單倍型多樣性（Hd=0.228）和核苷酸多樣性（Pi=0.000 95）均最低。泰州興化地區(qū)多采用蝦蟹混養(yǎng)模式養(yǎng)殖克氏原螯蝦，在每年4月初向河蟹養(yǎng)殖塘中投放約10尾的抱籽親蝦用于苗種繁殖，5月下旬至6月中旬將蝦蟹混養(yǎng)塘中的克氏原螯蝦盡可能捕盡，盡量減少對河蟹生長影響［14］，這種繁養(yǎng)模式可能導(dǎo)致了興化群體較低的遺傳多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，宿遷泗洪地區(qū)的單倍型多樣性水平和核苷酸多樣性水平最高。宿遷泗洪地區(qū)臨近洪澤湖，可能由于養(yǎng)殖群體與洪澤湖內(nèi)野生群體交流頻繁，從而導(dǎo)致了宿遷泗洪群體較高的遺傳多樣性。本研究中宿遷泗洪地區(qū)遺傳多樣性較高與高揚等的研究結(jié)果［15］相一致。遺傳距離是判斷群體之間親緣關(guān)系的關(guān)鍵指標，遺傳距離越大表明群體間親緣關(guān)系越遠［16］。遺傳距離較近和遺傳分化系數(shù)的負值，表明江蘇地區(qū)的克氏原螯蝦存在近親繁殖、群體間的分化程度較低等問題。江蘇省不同地區(qū)間盲目引種，是導(dǎo)致遺傳距離較近的原因之一。遺傳結(jié)構(gòu)是判斷新物種適應(yīng)棲息地能力的主要判斷標準［17］。本研究克氏原螯蝦8個群體中共發(fā)現(xiàn)37種單倍型，其中，單倍型Hap1在各群體中占比最高，在網(wǎng)絡(luò)圖中也處于中心位置。從而推斷單倍型Hap1是克氏原螯蝦群體中穩(wěn)定的優(yōu)勢單倍型。從單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)現(xiàn)，以單倍型Hap1為中心呈放射狀散開，各群體間并未產(chǎn)生明顯遺傳分化，各群體間的遺傳分化水平整體較低。本研究AMOVA結(jié)果顯示，有95.35%的變異發(fā)生在群體內(nèi)，僅有4.65%的變異發(fā)生在群體間，這與刑智珺等研究中克氏原螯蝦的變異多發(fā)生在群體內(nèi)，僅有極少數(shù)發(fā)生在群體間的結(jié)果［5，18-19］相一致。

江蘇地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性整體處于較低水平，建議及時對江蘇克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體進行遺傳改良，以提高克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，同時盡快改變自繁自育的苗種繁育和養(yǎng)殖模式。

參考文獻：

［1］王亞民，曹文宣. 中國水生外來入侵物種對策研究［J］. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2006，25（1）：7-13.

［2］王長忠，李? 忠，梁宏偉，等. 長江下游地區(qū)4個克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性分析［J］. 生物多樣性，2009，17（5）：518-523.

［3］曹玲亮，周立志，張保衛(wèi). 安徽三大水系入侵物種克氏原螯蝦的種群遺傳格局［J］. 生物多樣性，2010，18（4）：398-407.

［4］彭? 剛，劉偉杰，李佳佳，等. 長江流域3個克氏原螯蝦野生群體遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，26（5）：1115-1117.

［5］邢智珺，姜虎成，陸? 偉，等. 江蘇8個克氏原螯蝦群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分析［J］. 上海海洋大學(xué)學(xué)報，2014，23（5）：656-662.

［6］Vrijenhoek R C. Genetic diversity and fitness in small populations［M］//Conservation genetics. Basel：Birkhuser，1994：37-53.

［7］李大命，李? 康，張彤晴，等. 洪澤湖大銀魚（Protosalanx hyalocranius）cytb和COⅠ基因序列多態(tài)性分析［J］. 漁業(yè)科學(xué)進展，2017，38（6）：25-31.

［8］董志國，李曉英，王普力，等. 基于線粒體D-loop基因的中國海三疣梭子蟹遺傳多樣性與遺傳分化研究［J］. 水產(chǎn)學(xué)報，2013，37（9）：1304-1312.

［9］董新培，武小斌，萬海付，等. 河北3個日本沼蝦野生群體線粒體DNA D-Loop基因序列變異及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］. 水產(chǎn)學(xué)報，2017，41（2）：182-188.

［10］楊? 玲，李? 寧，朱樹人，等. 山東省3個克氏原螯蝦地理群體線粒體COⅠ基因的序列差異分析［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（20）：41-44.

［11］余紅喜，劉? 帆，朱國美，等. 基于線粒體COⅠ基因滁州地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（21）：111-113，125.

［12］Villanelli F，Gherardi F. Breeding in the crayfish，Austropotamobius pallipes：mating patterns，mate choice and intermale competition［J］. Freshwater Biology，1998，40（2）：305-315.

［13］夏愛軍，唐建清. 克氏原螯蝦現(xiàn)狀分析與研究思路［J］. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，2006，27（6）：9-11.

［14］張鳳翔，陳? 杰，徐美香，等. 蝦蟹混養(yǎng)模式的創(chuàng)新試驗與思考［J］. 科學(xué)養(yǎng)魚，2020（2）：32-34.

［15］高? 楊，田? 燦，姜京京，等. 基于微衛(wèi)星標記的克氏原螯蝦種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（5）：191-199.

［16］張鶴千，楊子拓，李桂峰，等. 珠江流域野生黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco的Cytb基因序列分析［J］. 中山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，54（5）：102-108.

［17］Bazin E，Glémin S，Galtier N. Population size does not influence mitochondrial genetic diversity in animals［J］. Science，2006，312（5773）：570-572.

［18］崔文濤，鄒宇凡，白志毅，等. 安徽地區(qū)克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］. 水產(chǎn)學(xué)報，2022，10（28）：1-10.

［19］Yi S K，Li Y H，Shi L L，et al. Characterization of population genetic structure of red swamp crayfish，Procambarus clarkii，in China［J］. Scientific Reports，2018，8：5586.