?山蒼子油對獼猴桃潰瘍病菌的抑菌活性及應(yīng)用研究?

顏志豪　董衛(wèi)國　左仁芳　楊欣朋　李曉剛

摘要：采用室內(nèi)平板抑制試驗評價抑菌效果的方法，檢測出山蒼子油對獼猴桃潰瘍病菌表現(xiàn)明顯的抑制作用；對分離純化的湘西地區(qū)獼猴桃潰瘍病病原菌分子生物學(xué)鑒定為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種；通過乳化劑篩選，找到最佳復(fù)配乳化劑組合SK-33SC：YUS-D935=1∶1（質(zhì)量比），并配制出25%山蒼子油EW；采用比濁法測定25%山蒼子油EW對獼猴桃潰瘍病菌的EC50值為8.581mg/L，回歸方程為y=-2.21+2.38x，相關(guān)系數(shù)為0.965；田間試驗結(jié)果表明，25%山蒼子油EW 200倍稀釋液對獼猴桃潰瘍病秋季防效達(dá)到82.69%、春季防效達(dá)到78.92%，且較2%春雷霉素水劑（加收米）以400倍液噴霧的秋季防效高60.91%、春季防效高38.30%。

關(guān)鍵詞：獼猴桃；潰瘍?。簧缴n子油；乳化劑

中圖分類號：S436.634文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-060X（2024）05-0072-07

Inhibitory Activity and Field Control Effect of Litsea cubeba Oil on

Pseudomonas syringae pv. actinidiae

YAN Zhi-hao1，2，DONG Wei-guo3，ZUO Ren-fang4，YANG Xin-peng1，2，LI Xiao-gang1，2

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Provincial Engineering Research Center of Pest Early Warning and Control， Changsha 410128， PRC; 3. Plant Protection and Inspection Station of Luxi?County Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Luxi 416100， PRC; 4. Plant Protection and Inspection?Station of Fenghuang County Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Fenghuang 416200， PRC）

Abstract： The indoor plate inhibition test confirmed the inhibitory effect of Litsea cubeba oil on Pseudomonas syringae pv. actinidiae. The pathogen causing kiwifruit canker in western Hunan was isolated and identified as P. syringae pv. actinidiae based on the molecular evidence. The composition of the emulsifier combination was optimized as SK-33SC∶YUS-D935=1∶1 （mass ratio）， and L. cubeba oil 25% EW was prepared. The median effective concentration （EC50） of L. cubeba oil 25% EW against P. syringae pv. actinidiae was determined as 8.581 mg/L by turbidimetry， with the regression equation of y=-2.21+2.38x （r=0.965）. The field experiment results showed that the control effect of the 200× diluent of L. cubeba oil 25% EW on kiwifruit canker reached 82.69% in autumn and 78.92% in spring， which were 60.91% and 38.30% higher than those of 400× diluent of 2% kasugamycin aqueous solution in autumn and in spring， respectively.

Key words： kiwifruit; canker; Litsea cubeba oil; emulsifier

獼猴桃屬獼猴桃科獼猴桃屬多年生藤本植物[1]，因其果實富含維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等多種人體必須營養(yǎng)物質(zhì)，被稱為水果之王，備受消費(fèi)者青睞[2]。

獼猴桃潰瘍病是一種嚴(yán)重威脅獼猴桃生產(chǎn)的毀滅性細(xì)菌性病害，主要危害獼猴桃的新梢、枝蔓、葉片和花蕾，以危害1～2 a樹齡枝梢為主，降低座果率，形成的果實較小或畸形，該病菌傳播快，病害來勢兇猛，發(fā)病嚴(yán)重時導(dǎo)致樹體死亡，流行年份致使全園瀕于毀滅，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，此病菌被列為全國植物檢疫對象。關(guān)于獼猴桃潰瘍病的病原菌，存在一些不同的觀點和理論，美國學(xué)者Opgenorth等[3]

在1983年將該病原菌定為丁香假單胞菌李致病變種（P. syringae. pv. morsprunorum），后來日本學(xué)者Takikawa等[4]將獼猴桃潰瘍病的病原菌鑒定為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae），此外，也有其他學(xué)者報道稱獼猴桃潰瘍病的病原菌為丁香假單胞菌丁香致病變種（P. syringae pv. syingae）[5， 6]。世界上主要商業(yè)種植獼猴桃的國家都不同程度的受到了獼猴桃潰瘍病的危害，國內(nèi)四川、陜西、湖南、貴州等地獼猴桃種植區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，極大地影響了獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展[7-9]。獼猴桃潰瘍病的發(fā)病原因比較復(fù)雜，匡美美等[10]認(rèn)為湘西州獼猴桃潰瘍病的發(fā)病率和病情指數(shù)與栽培品種、海拔高度、果園管理水平等因素有關(guān)。目前防治獼猴桃潰瘍病的主要有春雷霉素、噻唑鋅、王銅、噻霉酮等藥劑。李黎等[11]通過室內(nèi)抑菌率實驗研究發(fā)現(xiàn)2%春雷霉素水劑500倍液的平均抑菌率為69.34%，具有明顯的抑菌效果。楊貴琴等[12]發(fā)現(xiàn)通過農(nóng)藥復(fù)配對獼猴桃潰瘍病進(jìn)行防治效果較好，其中四霉素與噻霉酮按照一定比例復(fù)配后其EC50值能達(dá)到1.14 mg/L，共毒系數(shù)為124.96，田間防效為68.12%；四霉素與戊唑醇按照一定比例復(fù)配后EC50值能達(dá)到1.46 mg/L，共毒系數(shù)為123.73，田間防效為66.83%。這些化學(xué)農(nóng)藥在實驗室內(nèi)對獼猴桃潰瘍病的病原菌具有明顯的抑制作用，但田間防治效果卻未達(dá)預(yù)期。對現(xiàn)有登記的農(nóng)藥田間表現(xiàn)不佳的分析，主要原因在于獼猴桃潰瘍病病原菌對現(xiàn)有化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生高抗性，且這些農(nóng)藥對獼猴桃植株的滲透性和內(nèi)吸能力較差，不能傳導(dǎo)到致病菌所作用的韌皮層。特別是在南方地區(qū)，春季雨期持續(xù)時間長、施藥窗口期短、空氣濕度大等不利防治條件導(dǎo)致一些獼猴桃種植園的潰瘍病不能得到有效控制。

山蒼子（Litsea cubeba essential）是一種屬于樟科木姜子屬的植物，它是我國特有的香料植物資源之一，從山蒼子的花、果實和枝葉中可提取天然香精油——山蒼子油[13]。已有研究報告指出，山蒼子油在實驗室條件下對多種細(xì)菌和真菌具有良好的抑制效果，具有廣譜抗菌特性[14-15]。山蒼子油中的主要化學(xué)成分為檸檬醛，其在一定濃度下能夠破壞真菌與細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而表現(xiàn)廣譜抑菌活性[16-18]。Hu 等[19]研究了山蒼子油對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌作用，研究表明，山蒼子油破壞了MRSA細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致其細(xì)胞生物大分子泄露從而達(dá)到抑菌效果。Wang 等[20]研究了山蒼子油對灰霉病的抑制作用，也發(fā)現(xiàn)山蒼子油能破壞灰霉菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致其細(xì)胞膜通透性受損從而達(dá)到抑菌效果。陳梓云等[21]關(guān)于山蒼子油對用于小麥粉和玉米粉的防霉研究中發(fā)現(xiàn)，山蒼子油具有很好的防霉效果。迄今尚未有山蒼子油對獼猴桃潰瘍病菌的抑菌作用的報道。

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院在前期篩選獼猴桃潰瘍病生防材料時，發(fā)現(xiàn)山蒼子油對獼猴桃潰瘍病具有較好的抑制作用，在此基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步評價山蒼子油的生物活性，結(jié)合制劑開發(fā)評估其在田間應(yīng)用中的防效，以期探究山蒼子油及其制劑在獼猴桃潰瘍病防治中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 H2050R高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），SW-CJ-2F超凈工作臺（江蘇凈化），6321PCR儀（Eppendorf AG），DYY-6C電泳儀（北京六一生物科技有限公司），765/06413凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD），mLS-3750滅菌鍋（SANYO），TU-1810PLUS紫外分光光度器（上海精密儀器儀表有限公司），Dura12/24超純水機(jī)[澤拉布儀器科技（上海）有限公司]，T25數(shù)顯分散器（德國IKA）。

1.1.2 試劑 GelGreen染料（北京擎科生物技術(shù)有限公司），2000 dp DNA marker（北京擎科生物技術(shù)有限公司），2xTSINGKER Master Mix（北京擎科生物技術(shù)有限公司），TE緩沖液（博邁德生物有限公司），無水乙醇（阿拉丁試劑有限公司），山蒼子油（江西省吉水縣天成香料油廠），YUS-D935、YUS-D3020[竹本油脂（蘇州）有限公司]，SK-33SC、SK-34SC、SK-935[星飛化工（上海）有限公司]，OP-4、EL-40（邢臺市燕誠化學(xué)助劑有限公司），2%春雷霉素水劑（加收米）（日本北興化學(xué)工業(yè)株式會社）。

1.1.3 供試病原菌 2021年3月15日于湖南省古丈縣天橋村“紅陽”獼猴桃種植基地采集具有獼猴桃潰瘍病典型發(fā)病癥狀的流膿枝條，回實驗室進(jìn)分離純化。

1.1.4 供試引物 參考J.Rees-George等[22]的文獻(xiàn)合成兩對特異性檢測引物，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。PsaF1：5'-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3'，PsaR2：5'-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3'。擴(kuò)增目的片段為細(xì)菌16S-23S rDNA ITS部分區(qū)域，目標(biāo)片段大小為80 bp。Psa KN-F：5'-CACGATACATGGGCTTATGC-3'，Psa KN-R：5'-CTTTTCATCCACACACTCCG-3'。擴(kuò)增片段位于外膜蛋白（omp P1）基因部分區(qū)域，目標(biāo)片段大小為492 bp。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水定容至1 000 mL，NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，然后分裝到10個三角瓶中，用耐高溫組培封口膜封口后高壓滅菌鍋滅菌30 min，冷卻后貯藏備用。配制固體LB培養(yǎng)基，在以上配方中再加入18 g瓊脂粉。

1.2.2 獼猴桃潰瘍病病原菌的分離與純化 將采集回來的帶病枝條用無菌水沖洗后，用滅菌過的枝剪將枝條剪成2 mm×2 mm的方形組織小塊，隨后在超凈工作臺上將組織小塊用75%酒精浸漬10 s后用無菌水清洗3次。將處理好的樣品放入LB液體培養(yǎng)基中，封口后放入恒溫振蕩器中以18 ℃、180 r/min

的條件培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，在無菌操作臺上，使用接種環(huán)取已培養(yǎng)好的菌液，通過平板劃線法分離和純化菌落。挑選具有典型獼猴桃潰瘍病菌菌落特征的單株菌落進(jìn)行2～3次純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 獼猴桃潰瘍病病原菌的分子生物學(xué)鑒定 （1）DNA模板的制備。挑取已經(jīng)純化和培養(yǎng)好的單個菌落，并將其接種到LB液體培養(yǎng)基中。在恒溫振蕩器中以18 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，以此做為PCR反應(yīng)的DNA模板。

（2）基因序列的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2xTSING

KER Master Mix 12.5 μL，Primer F 0.5 μL，Primer R 0.5 μL，Template DNA 1.5 μL，雙蒸H2O 10 μL。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，72℃延伸6 min，35個循環(huán)，反應(yīng)完成后4 ℃保存。

配制完成反應(yīng)體系后將其震蕩混勻并離心，放入PCR儀后，按照反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。

（3）電泳檢測。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。將目標(biāo)條帶純化并回收后，送往北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

（4）序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。使用DNAStar分析軟件對原始序列進(jìn)行處理后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中運(yùn)用Blast工具軟件進(jìn)行比對分析，并從GenBank下載相似性較高的基因序列，利用MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以此鑒定病原菌的種類。

1.2.4 山蒼子油對獼猴桃潰瘍病菌的抑菌作用初篩 采用平板抑制試驗，先將分離出來的獼猴桃潰瘍病菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，之后用無菌水將菌液稀釋成在紫外分光光度計600 nm下吸光值0.1的菌懸液（當(dāng)OD600=0.1時，獼猴桃潰瘍病菌的濃度約為1×108 CFU/mL）[23]，即OD600=0.1的獼猴桃潰瘍病菌菌液。將LB固體培養(yǎng)基加熱融化后加入山蒼子油（1.8 mg/L），充分?jǐn)嚢瑁谷肫桨灏?，風(fēng)干備用。將獼猴桃潰瘍病菌菌液10 μL進(jìn)行涂布，密封后放入生化培養(yǎng)箱中以18 ℃的條件培養(yǎng)96 h后觀察，以不添加山蒼子油用相同方法培養(yǎng)的獼猴桃潰瘍病菌為對照。

1.2.5 山蒼子油EW（水乳劑）的制備與乳化劑篩選 （1）山蒼子油EW的制備。采用轉(zhuǎn)相法[24， 25]，按照配制山蒼子油EW的濃度要求，先稱取一定量的山蒼子油，再加入總質(zhì)量8%的乳化劑（油相），用去離子水（水相）定容到設(shè)定體積，于高速剪切乳化機(jī)上以16 000 r/min轉(zhuǎn)速剪切乳化3 min，得到相應(yīng)山蒼子濃度的水乳劑成品。

（2）乳化劑的篩選。根據(jù)馮建國等[26]、Liu J?等[27]對農(nóng)藥水乳劑用乳化劑的應(yīng)用研究，選用YUS-D935、SK-33SC、OP-4、YUS-D3020、EL-40、SK-34SC乳化單劑配制4%山蒼子油EW，依次進(jìn)行乳液穩(wěn)定性、熱貯穩(wěn)定性、低溫穩(wěn)定性和分散性測試，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗，對當(dāng)次項目測定合格的乳化劑再進(jìn)行下一步測定，不合格的淘汰。篩選出合格的乳化劑后，再按質(zhì)量比為1∶1復(fù)配組合乳化劑（組合乳化劑的加入量為總質(zhì)量的8%），再按單劑篩選方法篩選出最佳的組合乳化劑復(fù)配方。各項性能測定的方法及標(biāo)準(zhǔn)如下：

乳液穩(wěn)定性測定：按照《GB/T 1603—2001農(nóng)藥乳液穩(wěn)定性測定方法》將待測樣品以標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋200倍，靜置1 h后進(jìn)行觀察，測試樣品達(dá)到上無浮油，下無沉淀，乳液無分層則判定為合格。

熱貯穩(wěn)定性測定：按照《GB/T 19136—2003 農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測定方法》將待測樣品密封后放入（54±2）℃恒溫箱中，存放14 d后若無析水、析油或只有少量物質(zhì)析出輕搖后可混合均勻，則判定為合格。

低溫穩(wěn)定性測定：按照《GB/T 19137—2003 農(nóng)藥低溫穩(wěn)定性測定方法》將待測樣品密封后放入（0±2）℃冰箱中，7 d后觀察，若無析水、析油則判定為合格。

分散性測定：將待測樣品加入到標(biāo)準(zhǔn)硬水中，觀察其在硬水中的分散情況，根據(jù)分散情況可分為以下四個等級：①樣品加入后立即呈云霧狀則為優(yōu)；②樣品加入后有顆粒下沉，但在下沉后能基本分散則為良；③樣品加入后有顆粒下沉，在下沉后需要輕微搖晃才能分散則為一般；④樣品加入后呈絮狀或顆粒狀下沉，需要強(qiáng)烈搖晃才能分散則為差[28]。待測樣品達(dá)到良以上判定為合格。

選用乳化劑最優(yōu)復(fù)配方配制25%山蒼子油EW。

1.2.6 山蒼子油EW對獼猴桃潰瘍病菌毒力的室內(nèi)測定 采用比濁法室內(nèi)測定山蒼子油EW對獼猴桃潰瘍病菌的毒力。將25%山蒼子油EW分別稀釋125 000 倍、41 667 倍、25 000倍、17 857倍、13 889倍，配制5個濃度梯度山蒼子油EW。每個梯度100 mL，然后加入OD600=0.1的獼猴桃潰瘍病菌菌液100 μL，放入恒溫振蕩器中以18 ℃、180 r/min的條件培養(yǎng)24 h，以不添加山蒼子油EW的獼猴桃潰瘍病菌菌液培養(yǎng)為對照，每個處理做3個重復(fù)。然后使用紫外分光光度計在600 nm下測定菌液溶度，通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算毒力回歸方程、EC50值及相關(guān)系數(shù)，按公式（1）計算抑制生長率。

1.2.7 田間防效試驗 選取湖南省古丈縣古陽鎮(zhèn)天橋山村獼猴桃種植基地為試驗地點。該種植基地海拔為500 m左右，獼猴桃種植面積為6.67 hm2，種植品種為“紅陽”，樹齡4 a，獼猴桃潰瘍病的發(fā)病率為90%，因獼猴桃潰瘍病死亡的植株率約50%，田間防治獼猴桃潰瘍病的藥劑主要有噻菌銅、氫氧化銅、四霉素。

試驗設(shè)3個處理：處理Ⅰ，25%山蒼子油EW的200倍液噴霧；處理Ⅱ，2%春雷霉素水劑（加收米）400倍液噴霧；CK，噴清水作為空白對照。每處理60株，每次噴藥400 mL，樹體均勻受藥，共進(jìn)行3次噴藥，2021年10月26日第1次噴藥，2021年11月18日第2次噴藥，2022年3月2日第3次噴藥。分別于2021年12月7日和2022年3月19日調(diào)查噴藥后獼猴桃潰瘍病新發(fā)生的情況，按照表1進(jìn)行病情分級，按公式（2）計算發(fā)病率、公式（3）計算防治效果、公式（4）計算病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃潰瘍病菌的分離與純化結(jié)果

從感染獼猴桃潰瘍病的枝條中分離出HG1、HG2、HG3、HG4、HG5、HG6和HG7共7株菌株（圖1），呈現(xiàn)圓形、乳白色、全緣、微凸、表面光滑等特征，與王星[28]等在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)的獼猴桃潰瘍病菌的菌落形態(tài)特征一致。

2.2 獼猴桃潰瘍病菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將分離出的7株菌株編號后使用特異性引物PsaF1、PsaR2與Psa KN-F、Psa KN-R分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)其中HG6沒有擴(kuò)增出目的條帶，HG1、HG2、HG3、HG4、HG5和HG7菌均得到一條約252 bp的片段和約500 bp左右片段（圖2）。將出現(xiàn)目標(biāo)條帶的6份菌株送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序，菌株的序列基本相同，通過NCIB的BLAST比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），與獼猴桃潰瘍病菌MT46321 9.1高度同源，確認(rèn)為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syingae pv. actinidiae）。將分離純化得到的病原菌的序列上傳至NCBI上，得到菌株登錄號為：MW829404.1

2.3 山蒼子油對獼猴桃潰瘍病菌的抑菌作用初篩結(jié)果

圖4表明，對照組獼猴桃潰瘍病菌長滿培養(yǎng)皿，含有山蒼子油的沒有觀察到獼猴桃潰瘍病菌的菌落，表明山蒼子油對獼猴桃潰瘍病菌有明顯抑制作用。

2.4山蒼子油乳化劑的選擇及復(fù)配方確定

如表2所示，篩選得到最佳的乳化劑組合為SK-33SC：YUS-D935=1∶1（質(zhì)量比），該乳化劑組合所有測定指標(biāo)均達(dá)到了合格的標(biāo)準(zhǔn)，在熱貯穩(wěn)定性測定中比其他單劑和組合穩(wěn)定性更好，無析出物，在分散性測定中，樣品滴入水中后立即呈云霧狀分散，達(dá)到了優(yōu)級標(biāo)準(zhǔn)。用該乳化劑配制25%山蒼子油EW的具體配方中各成分的質(zhì)量百分比為：山蒼子油 25%、 溶劑乙酸仲丁酯 15%、乳化劑 SK-33SC?4%、乳化劑YUS-D935 4%、去離子水補(bǔ)足至 100%。

2.5 25%山蒼子油EW的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

如表3所示，25%山蒼子油EW的EC50值為8.581 mg/L，回歸方程為y=-2.21+2.38x，相關(guān)系數(shù)為0.965；抑菌率隨稀釋倍數(shù)的降低而增加，以稀釋13889倍的最高，為81.26%。

2.6 25%山蒼子油EW對獼猴桃潰瘍病的田間防效

2021年秋季防治效果如圖5、表5所示，CK的植株葉面病斑較為明顯，病情指數(shù)19.47，發(fā)病率高達(dá)96.33%；處理Ⅰ的植株葉面無病斑，病情指數(shù)3.37，發(fā)病率16.33%，防治效果高達(dá)82.69%；處理Ⅱ的植株葉面有少量的病斑，病情指數(shù)15.23，發(fā)病率75.17%，防治效果21.78%。秋季病斑主要發(fā)生在葉面，只有極少數(shù)枝干出現(xiàn)流膿現(xiàn)象，各處理未出現(xiàn)死樹現(xiàn)象。2022年春季防效如表6所示，春季CK雖然發(fā)病率較秋季低21.5%，但潰瘍病膿包較為明顯，且植株死亡率達(dá)15%；處理Ⅰ的病情指數(shù)和發(fā)病率較CK、處理Ⅱ分別低49.54%、24.27%和58.28%、30.00%，防效較處理Ⅱ高38.66%，植株枝干無獼猴桃潰瘍病膿包，且未死樹，但較秋季仿效要低；處理Ⅱ的春季防效較秋季仿效高18.48%，但植株枝干帶有獼猴桃潰瘍病膿包，且出現(xiàn)植株死亡。

3 結(jié)論與討論

采用平板劃線分離法，對湘西地區(qū)的獼猴桃潰瘍病菌進(jìn)行分離與純化，確定湘西地區(qū)的獼猴桃潰瘍病菌的病原菌為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種；首次報告山蒼子油對獼猴桃潰瘍病菌的抑制作用，并通過篩選山蒼子油乳化劑，制備了25%山蒼子油EW，測定出制劑對獼猴桃潰瘍病菌室內(nèi)毒力；通過田間藥效試驗測試山蒼子油EW的田間防效。田間試驗結(jié)果表明，25%山蒼子油EW 200倍稀釋液對獼猴桃潰瘍病有很好的防治效果，秋季防效達(dá)到82.69%，春季防效達(dá)到78.92%，且較2%春雷霉素水劑（加收米）以400倍液噴霧的秋季防效高60.91%、春季防效高38.30%，在防治獼猴桃潰瘍病方面具有良好的應(yīng)用潛力；至于春季發(fā)病率及嚴(yán)重程度的提高是因為春季雨水較多，病情比秋季嚴(yán)重[29]；春雷霉素水劑（加收米）春季防效的提高，是否與藥效的持效性有關(guān)，尚有待研究。

到目前為止，銅制劑在控制獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病中被認(rèn)為是最經(jīng)典的方法，但高濃度的銅制劑不僅抑制植物發(fā)育，而且干擾光合作用等細(xì)胞活動，長期使用還會影響環(huán)境生態(tài)，如土壤污染、飲用水污染等問題。挖掘高抑菌活性生物源活性成分并開發(fā)環(huán)境友好的農(nóng)用殺菌劑極具前景。但是，目前微生物農(nóng)藥如枯草芽孢桿菌等防治獼猴桃潰瘍病的防效極不穩(wěn)定，速效性差；抗生素類藥劑如四霉素、春雷霉素、中生菌素等耐雨水沖刷能力不佳，且不能與堿性農(nóng)藥混用。因此，開發(fā)作用機(jī)制獨特、生物活性強(qiáng)的生物來源藥物應(yīng)用于獼猴桃潰瘍病防治值得研究者和產(chǎn)業(yè)界關(guān)注。

參考文獻(xiàn)：

[1] 姜轉(zhuǎn)宏. 獼猴桃產(chǎn)業(yè)演化發(fā)展探析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（社會科學(xué)版），2007，7（2）： 109-112.

[2] HEMALATHA C N，MEHURNISHA K，PREETHI B，et al.Antioxidant Activity of Kiwi Fruit （Actindia Chinensis）[J]. International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences，2020，11（4）：6810-6817.

[3] OPGENORTH D C. Pseudomonas canker of kiwifruit[J]. Plant Disease，1983，67（11）： 1283-1283.

[4] YUICHI T，SETSUO S，TAKESHI I，et al. Pseudomonas syringae pv. actinidae pv. nov.： The causal bacterium of canker of kiwifruit in Japan[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan，1989，55（4）：437-444.

[5] 李黎，鐘彩虹，李大衛(wèi)，等. 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的研究進(jìn)展[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，32（5）：124-133.

[6] SCORTICHINI M. Aspects still to solve for the management of kiwifruit bacterial canker caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae biovar 3[J]. European Journal of Horticultural Science，2018，83（4）：205-211.

[7] SUN Q，XIE Y J，CHEN T M，et al. First report of Fusarium avenaceum causing canker disease on kiwi tree in China[J]. Plant Disease，2022：PDIS11212459PDN.

[8] VANNESTE J L，POLIAKOFF F，AUDUSSEAU C，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae， the causal agent of bacterial canker of kiwifruit in France[J]. Plant Disease，2011，95（10）：1311.

[9] 張晉龍，趙志博，劉巍，等. 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌T3SS關(guān)鍵效應(yīng)蛋白基因致病功能[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，55（3）：503-513.

[10] 匡美美，高建有，羅慶，等. 湘西州獼猴桃潰瘍病發(fā)病情況及其影響因素分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022（1）：56-59.

[11] 李黎，潘慧，李文藝，等. 13種殺菌劑對獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi)抑菌及混配效果測定[J].中國果樹，2022（7）：57-61.

[12] 楊貴琴，莫飛旭，陳聽聽，等. 防治獼猴桃潰瘍病藥劑組合的篩選與應(yīng)用[J]. 中國植保導(dǎo)刊，2020，40（11）：73-76.

[13] 彭湘蓮，付紅軍. 山蒼子精油的提取及其抑菌研究現(xiàn)狀[J]. 林產(chǎn)工業(yè)，2018，45（11）：51-54.

[14] 吳均，楊欽滟，趙曉娟，等. 山蒼子油的抑菌活性及機(jī)理研究[J]. 食品工業(yè)科技，2013，? 34（17）：119-121，125.

[15] YU-JING YANG，MENG‐YI LIN，SHU-YI FENG，et al. Chemical composition， antibacterial activity， and mechanism of action of essential oil from Litsea cubeba against foodborne bacteria[J]. Journal of Food Processing and Preservation，2020，44.

[16] 李欣越，茍玉虹，申瀚君，等. 山蒼子精油抑制沙門菌作用機(jī)制研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2021，39（3）：385-390.

[17] 柏梅. 山蒼子精油對金黃色葡萄球菌及其生物膜的抑制機(jī)制研究[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2019.

[18] 孫暢，李湘，王銀紅，等. 山蒼子精油對柑橘意大利青霉的抑菌活性及作用機(jī)制[J]. 食品科學(xué)，2023，44（11）：17-25.

[19] B，WEI HU A，et al. "Antibacterial activity and mechanism of Litsea cubeba essential oil against methicillin-resistant Staphylococcus aureus （ MRSA ）." Industrial Crops and Products 130（2019）：34-41.

[20] LIQUNWANG，WEIHU，JIAODENG，et al. Antibacterial activity of Litsea cubeba essential oil and its mechanism against Botrytis cinerea[J]. RSC Advances，2019，9（50）：28987-28995.

[21] 陳梓云，黃曉霞，姚婉清，等. 山蒼子油微膠囊用于玉米粉、小麥粉的防霉研究[J]. 化工技術(shù)與開發(fā)，2021，50（S1）：5-7.

[22] REES-GEORGE J， VANNESTE J L， CORNISH D A，et al. Detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae using polymerase chain reaction （PCR） primers based on the 16S–23S rDNA intertranscribed spacer region and comparison with PCR primers based on other gene regions[J]. Plant Pathology，2010，59（3）：453-464.

[23] 陳霽暉. 氨基寡糖素誘導(dǎo)獼猴桃抗?jié)儾〉男Ч皺C(jī)理研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2021.

[24] 張星，陳偉，李超楠，等. 10%香芹酚·霜霉威水乳劑的研制及其性能[J]. 農(nóng)藥，2021， 60（2）：101-106.

[25] 米雙，遇璐，丑靖宇. 12%噻唑膦·阿維菌素水乳劑配方篩選[J]. 農(nóng)藥，2018，57（12）：884-886.

[26] 馮建國，張小軍，趙哲偉，等. 農(nóng)藥水乳劑用乳化劑的應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J]. 農(nóng)藥，2012， 51（10）：706-709，723.

[27] LIU J X，QIAN C H，ZHANG X G. Stability of pesticide in water emulsion induced by mixed surfactants[J]. Tenside Surfactants Detergents， 2022， 59（2）： 182-191.

[28] 劉步林. 農(nóng)藥劑型加工技術(shù)[M]. 2版. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998：1-42.

[29] 王星，楊俊，汪婭婷，等. 云南獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌鑒定[J]. 植物檢疫，2019， 33（1）：1-34.

（責(zé)任編輯：謝培庚）

收稿日期：2024-03-21

作者簡介：顏志豪（1998—），男， 湖南永州市人，碩士研究生，主要從事農(nóng)藥制劑與加工研究。

通信作者：李曉剛