基于代謝組學(xué)比較分析5個栽培種梨葉片代謝物的差異

焦慧君　冉昆　董冉　董肖昌　關(guān)秋竹　王宏偉　魏樹偉

摘? ? 要：【目的】為加強對梨葉片資源的藥用價值以及農(nóng)副產(chǎn)品的開發(fā)利用，全面分析梨葉片中次生代謝物質(zhì)的種類?！痉椒ā客ㄟ^代謝組學(xué)分析庫爾勒香梨、超紅、南紅、鴨梨、翠冠5個品種與福鼎大白茶的成熟期葉片的代謝物差異?！窘Y(jié)果】PCA分析表明，代謝物種內(nèi)聚類較為集中，種間聚類較遠；5個比較組特異性差異代謝物分別有55、155、54、59和28種；Heatmap分析表明，排名前50的差異代謝物在5個主栽梨葉片中的表達量具有顯著差異；黃酮和黃酮醇生物合成、ABC轉(zhuǎn)運和類黃酮生物合成等途徑是差異代謝物富集的主要通路，其中山梨醇、果糖、甘露醇、檸檬酸、水楊酸、馬來酸等含量顯著上調(diào)。【結(jié)論】不同栽培種梨葉片的代謝物在種類和表達量上均具有顯著差異，研究結(jié)果為開發(fā)利用梨葉片資源提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：梨；葉片；次生代謝物質(zhì)

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）06-1111-14

Comparative analysis of metabolites in leaves of five pear cultivars based on metabonomics

JIAO Huijun， RAN Kun#， DONG Ran， DONG Xiaochang， GUAN Qiuzhu， WANG Hongwei， WEI Shuwei*

（Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， Shandong， China）

Abstract： 【Objective】 Plant leaves are rich in secondary metabolites， mainly including phenols， terpenoids， alkaloids and other secondary substances， which have physiological functions in regulating plant growth， biological defense， anti-abiotic stress and so on. Pear is one of the important economic fruits of Rosaceae， and widespread in the world. China is one of the origins of pears， and has a long history of cultivation and rich variety resources. Pyrus pyrifolia， P. ussuriensis， P. sinkiangensis， P. communis and P. bretschnrideri are the main cultivated species of pear in China. Pears contain a wide variety of phenolic compounds， which would be beneficial for human health. Therefore， there have been many researches on the metabolite content of pear fruit. There are also abundant secondary metabolites in pear leaves， which are very important for the growth and development of fruit trees. However， there is a lack of systematic analysis of the metabolites in pear leaves. 【Methods】 In this study， we collected mature， healthy pear leaves in September， and carried them into lab. The leaves of Fuding Dabai tea rich in secondary metabolites were selected as control， and the differences of metabolites in the mature leaves of five cultivars Kuerle， Chaohong， Nanhong， Yali and Cuiguan were compared and analyzed by metabolomics. PCA analysis， Heatmap analysis， KEGG analysis and K-means analysis were used to analysis differential metabolites. 【Results】 A total of 9011 metabolites were detected under positive and negative ion mode. 11 747 peaks and 4987 metabolites were identified in the positive ion model， and 11 575 peaks and 4024 metabolites were identified in the negative ion model. The principal component analysis （PCA） showed that the detected intra-species clustering of metabolic species was relatively concentrated， while the interspecific clustering was relatively distant. The metabolites of the leaves of Chaohong were clustered far apart from those of the other four kinds of pear， which indicated the difference of metabolites in the leaves of occidental pear and oriental pear. In the oriental pear varieties， the metabolites of Kuerle fragrant pear were far from those of Yali， Cuiguan and Nanhong， and there were some differences. The number of differential metabolites of Kuerle， Chaohong， Nanhong， Yali， Cuiguan and Fuding Dabai was 1194， 1153， 1176， 1153 and 1164， respectively. There were 456， 468， 469， 481 and 446 kinds of significantly up-regulated differential metabolites in Kuerle， Chaohong， Nanhong， Yali and Cuiguan compared with Fuding Dabai， respectively， and 728， 685， 707， 672 and 718 kinds of significantly down-regulated differential metabolites. The number of common differential metabolites was 747， and the specific differential metabolites were 55， 155， 54， 59 and 28， respectively. The heatmap analysis showed that the expression levels of the top 50 differential metabolites were significantly different in the leaves of 5 cultivated pears. Among the top 50 differential metabolites， the number of metabolites in Yali leaves was the largest， with about 24 kinds， mainly including chrysanthemin， genistin， swertiajaponin， quercetin 3-lathyroside， picein， swertiajaponin， 6alpha-Hydroxycastasterone， glycyrrhetinic acid and protobassic acid. The correlation analysis could measure the degree of correlation between different metabolites， and further understand the interrelationship between metabolites in the process of biological state change. Therefore， we used Pearson correlation coefficient to measure the correlation between the top 50 differential metabolites with metabolite expression. It was found that 642 pairs of metabolites were positively correlated， and 633 pairs of metabolites were negatively correlated. We divided all the differential metabolites into 12 subclusters using K-mean analysis， and the results showed that the variation trend of differential metabolites in these 12 subclusters was basically the same. The number of differential metabolites in subclusters 1， 2， 6， 8， 10 and 11 was the most distributed， and the number was 229， 200， 104， 304， 256 and 81， respectively. The variation trend of differential metabolites in cluster 1， 2 and 8 was basically the same. The expression of metabolites in Chaohong leaves was quite different in subgroups 3， 5 and 7， and the contents of metabolites in Nanhong leaves was quite different in subgroup 12. The KEGG analysis were used to analyze the differential enrichment of the metabolic pathways between the leaves of Kuerle， Chaohong， Nanhong， Yali and Cuiguan and the leaves of Fuding Dabai. The 5 comparison groups were enriched in 78 KEGG pathways， there were 76， 71， 73， 70 and 74 KEGG pathways in the 5 cultivars， respectively. The flavone and flavonol biosynthesis （pxb00944）， ABC transport （pxb02010） and flavonoid biosynthesis （pxb00941） were the main pathways for the enrichment of differential metabolite， among them， the contents of sorbitol， fructose， mannitol， citric acid， salicylic acid， maleic acid and methylmalonic acid were significantly up-regulated. Additionally， the zeatin synthesis （pxb00908） and monobacterial biosynthesis （pxb00261） were also metabolic pathways in which metabolites were significantly enriched in the leaves of Chaohong. 【Conclusion】To sum up， there are obvious differences in kinds and expressions of metabolites in the leaves of different pear cultivars， and this study could provide theoretical basis for the development and utilization of the leaf resources of pear.

Key words： Pear; Leaves; Secondary metabolites

植物次生代謝物是由植物次生代謝產(chǎn)生的非必需低分子有機化合物，來源廣泛、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要包括酚類、類萜、生物堿類和其他次生物質(zhì)。酚類是芳香族環(huán)上的氫原子被羥基或功能衍生物取代后生成的化合物，以糖苷或糖脂狀態(tài)積存于液泡中，在植物體內(nèi)廣泛分布，是重要的次生代謝物質(zhì)之一，主要有莽草酸和乙酸-丙二酸等兩條合成途徑；類萜又稱萜烯類化合物，是以異戊二烯為單元組成，由乙酰CoA經(jīng)甲羥戊酸和異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)變而來。生物堿是存在于自然界中的一大類含氮雜環(huán)化合物，通常具有堿性，廣泛存在于植物體內(nèi)，是氮素代謝的中間產(chǎn)物，由不同氨基酸衍生而來[1]。次生代謝產(chǎn)物廣泛參與植物的生長、發(fā)育和防御等生理過程。武予清等[2]報道黃酮類化合物是棉花植株中重要的抗病蟲害的物質(zhì)，陸地棉的黃酮類化合物以異槲皮苷和蕓香苷為主。生物堿是含氮化合物的一種，大多數(shù)生物堿是植物的防御物質(zhì)，對動物具有毒性。另外，許多生物堿具有藥用價值，如嗎啡、奎寧、長春花堿、利血平等。吳雅瓊等[3]采用代謝組學(xué)系統(tǒng)分析了黑莓、黑樹莓成熟果實中主要代謝物的差異，為高效利用果實中黃酮、花色苷等次生代謝物提供理論依據(jù)。張琴等[4]采用UPLC-MS/MS分析不同產(chǎn)地的蜂糖李果實中氨基酸等初生代謝物質(zhì)的差異。魯忠富等[5]采用UPLC-MS/MS分析了瓠瓜果實鮮味的代謝物質(zhì)差異，發(fā)現(xiàn)氨基酸及其衍生物和黃酮類等代謝物可能共同影響?zhàn)巷L(fēng)味。另外，LC-MS技術(shù)在柑橘[6]、李[7]、獼猴桃[8]等果樹，番茄[9]、青花菜[10]和平菇[11]等蔬菜，以及蕎麥[12]、玉米[13]、棉花[14]等作物研究中應(yīng)用廣泛。

梨屬于薔薇科蘋果亞科梨屬多年生落葉果樹，是我國重要的經(jīng)濟水果之一。我國是梨起源中心之一，種質(zhì)資源豐富，在長期的栽培馴化過程中逐漸形成了五大栽培種，分別是白梨（Pyrus bretschneideri）、砂梨（P. pyrifolia）、秋子梨（P. ussuriensis）、新疆梨（P. sinkiangensis）和西洋梨（P. communis）[15]。梨果實富含多種礦質(zhì)元素、維生素、酚類、糖類和有機酸等營養(yǎng)成分。王宏等[16]采用代謝組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析蘇翠1號與其親本翠冠和華酥果實成熟過程中的差異代謝物以及差異基因，發(fā)現(xiàn)調(diào)控糖代謝、山梨醇代謝、氨基酸代謝和脂肪酸代謝的基因在蘇翠1號中高表達，解析了蘇翠1號果實品質(zhì)優(yōu)良的分子基礎(chǔ)。趙芫[17]通過代謝組學(xué)從紅早酥果皮中篩選出211種黃酮類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)乙烯處理后可以抑制異黃酮的積累和提高花青苷的含量，從而誘導(dǎo)果皮變黃。解敏等[18]采用GC-MS技術(shù)測定碭山酥梨成熟期果實品質(zhì)，分析糖、有機酸和芳香物質(zhì)的組分和含量。另外，高靜怡等[19]采用非靶向代謝組學(xué)分析砂梨品系水心病發(fā)病潛在的分子機制。代謝組學(xué)多用于分析果實品質(zhì)和抗病性研究，尚未有系統(tǒng)分析梨葉片代謝物成分及含量的相關(guān)報道。

梨葉片是梨樹重要的組成部分之一，是進行光合作用的場所，輸送營養(yǎng)物質(zhì)支持梨樹的生長發(fā)育過程。梨葉片中含有不同種類的次生代謝物質(zhì)，影響梨樹抗性以及果實品質(zhì)等。梨中關(guān)于次生代謝物質(zhì)的研究大多集中于果實品質(zhì)方面，缺乏系統(tǒng)全面鑒定葉片次生代謝物質(zhì)的研究。為系統(tǒng)分析成熟葉片代謝產(chǎn)物種類和組分含量差異，筆者通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，以茶葉片為對照，比較分析5個主栽品種梨葉片代謝物種類和含量的差異。庫爾勒香梨、超紅、南紅、鴨梨和翠冠5個梨品種，分別屬于新疆梨、西方梨、秋子梨、白梨和砂梨系統(tǒng)。5個主栽品種不論果實品質(zhì)特征還是栽培區(qū)域等方面均存在明顯差異，間接說明在生長發(fā)育過程中葉片合成的次生代謝物在向果實轉(zhuǎn)化時存在差異，最終導(dǎo)致果實品質(zhì)的差異。因此，筆者在本研究中的結(jié)果不僅為合理開發(fā)利用梨葉片資源、加工梨葉農(nóng)副產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)依據(jù)，同時也為探究果實品質(zhì)、抗性調(diào)控研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 梨葉片采集

5個主栽品種（庫爾勒香梨，KEL；超紅，RC；南紅，NH；鴨梨，YL；翠冠，CG）的梨葉片采自山東省果樹研究所大河種質(zhì)資源圃。于9月份采集成熟期的梨葉片，每個品種設(shè)置6組生物學(xué)重復(fù)，將采集的葉片放置于液氮罐中，帶回實驗室后放入-80 ℃冰箱中保存。

1.2 代謝物提取

首先，配置代謝物提取所需的溶液，包括內(nèi)標溶液（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1；Lyso PC17：0，0.01 mg·mL-1，均由甲醇配置），70%和20%的甲醇溶液。提前在-20 ℃預(yù)冷提取液；分別稱取80 mg梨和茶葉片于2 mL的無酶離心管中，然后分別加入20 μL的內(nèi)標溶液和1 mL 70%的甲醇溶液；加入2個小鋼珠，放置于-20 ℃條件下預(yù)冷2 min，然后放入研磨機（60 Hz）研磨2 min；超聲提取30 min后，置于-20 ℃條件下靜置20 min；在4 ℃、13 000 r·min-1條件下離心10 min，取300 μL上清液，揮發(fā)干凈后用400 μL 20%的甲醇復(fù)溶，渦旋30 s，超聲2 min。在相同條件下，離心10 min，然后用注射器吸取150 μL的上清液，使用0.22 μm有機相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到LC進樣小瓶，-80 ℃保存，直到進行LC-MS分析。另外，質(zhì)控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC體積與樣本相同。分析儀器為AB ExionLC超高效液相串聯(lián)AB TripleTOF 6600高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。

1.3 差異代謝物的多元分析

刪除QC樣本中相對標準偏差＞0.4的離子峰，PCA統(tǒng)計分析不同組樣本之間的差異，繪制質(zhì)控樣本的代謝物強度；采用UNIFI 1.8.1 軟件采集原始數(shù)據(jù)，用Progenesis QI v2.3 軟件（Nonlinear Dynamics，Newcastle，UK）處理和鑒定原始數(shù)據(jù)，使用The Human Metabolome Database（HMDB）和Lipidmaps（v2.3）以及METLIN數(shù)據(jù)庫進行定性分析；然后基于有監(jiān)督的降維方法，采用偏最小二乘判別分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）法和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal projection to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA）法來更好地區(qū)分2組樣品的代謝組學(xué)特征和類別。通過OPLS-DA分析得到比較組之間差異代謝物的變量權(quán)重值（variable important in projection，VIP）。

1.4 差異代謝物分析

依據(jù)代謝物的多元分析和單變量分析的結(jié)果，篩選出5個比較組的差異代謝物。在OPLS-DA分析中，VIP值可用來衡量各代謝物的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力。篩選的標準為OPLS-DA模型第一主成分VIP＞1，t檢驗p＜0.05。結(jié)合邁維云平臺（https：//cloud.metware.cn/#/home）在線軟件對篩選出的差異代謝物進行火山圖、韋恩圖、Heatmap分析和相關(guān)性分析。具體參數(shù)為FC篩選閾值為1、p-value篩選閾值是0.05，VIP篩選閾值是1。依據(jù) KEGG 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/）對差異代謝物進行代謝通路富集分析。

1.5 K-means分析

對篩選到的1319種代謝物在6種葉片中的含量趨勢進行聚類分析。使用邁維云平臺（https：//cloud.metware.cn/#/home）在線軟件對篩選出的差異代謝物含量進行K-means聚類分析。由于差異代謝物含量差異范圍較大，因此對代謝物含量的數(shù)值進行數(shù)值轉(zhuǎn)換，對其分別取對數(shù)（log2），選取手動指定聚類方法，分類數(shù)目設(shè)置為12。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝組樣本質(zhì)量控制和定性分析

采用PCA方法對所有質(zhì)控樣本的離散程度進行分析，結(jié)果如圖1-A所示，QC樣本和6種葉片的組內(nèi)樣本分別聚類緊密，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。另外，對每組樣品的6個生物學(xué)重復(fù)進行組內(nèi)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示每組樣品的6組生物學(xué)重復(fù)均高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.8；5組梨葉片的代謝物與茶葉葉片的代謝物的相關(guān)系數(shù)較小，為0.03～0.24（圖1-B）。在PLS-DA分析中，R2X（cum）均大于0.942、R2Y（cum）均是1，Q2（cum）均是1或0.999，說明該方法可以有效地區(qū)分種間和種內(nèi)葉片代謝物的差異，并且可靠性較高。結(jié)果顯示，每組樣品的代謝物組內(nèi)緊密聚集在一起，梨葉片與茶葉片的代謝物聚類相聚較遠，具有明顯差異。其中，超紅葉片的代謝物與其他4種梨葉片的代謝物聚類較遠，說明西洋梨和東方梨兩大種群梨葉片代謝物成分的差異。在東方梨品種中庫爾勒香梨與鴨梨、翠冠、南紅代謝物聚類分布較遠，具有一定的差異（圖1-C）。在正負離子模式下共鑒定出23 322個物質(zhì)峰，相應(yīng)的代謝物總共9011個。在正離子模式下鑒定出11 747個物質(zhì)峰，4987種代謝物；在負離子模式下鑒定出11 575個物質(zhì)峰，4024種代謝物（圖1-D）。

2.2 差異代謝物篩選及火山圖、韋恩圖分析

對檢測出的代謝物進行分析，庫爾勒香梨、超紅、南紅、鴨梨、翠冠分別與福鼎大白茶相比較，每個比較組分別檢測出1194、1153、1176、1153和1164種顯著差異的代謝物。依據(jù)差異代謝物的VIP、FC和p值繪制火山聚類圖。結(jié)果如圖3所示，庫爾勒香梨、超紅、南紅、鴨梨、翠冠與福鼎大白茶相比顯著上調(diào)的差異代謝物分別是466、468、469、481和446種，顯著下調(diào)的差異代謝物有728、685、707、672和718種（圖2-A～E）。韋恩圖結(jié)果表明，庫爾勒香梨、超紅、南紅、鴨梨、翠冠與福鼎大白茶相比，特異性的差異代謝物分別有55、155、54、59和28種，其中5個比較組共有的差異代謝物是747種（圖2-F）。

2.3 差異代謝物的定量Heatmap分析和相關(guān)性分析

為了更直觀地展示樣本之間代謝物的表達差異，對所有顯著差異代謝物表達量進行層次聚類分析，根據(jù)VIP值對top 50差異代謝物表達量進行分析。篩選出的差異代謝物，大多數(shù)屬于脂類和類脂分子、生物堿及其衍生物、苯環(huán)型化合物、木酚素、新木酚素及其相關(guān)化合物、有機氧化合物和糖類多酮類化合物。結(jié)果如圖3所示，6種葉片的代謝物在表達豐度上具有明顯差異，福鼎大白茶葉片中含有的差異代謝物數(shù)目居多，但是在5個栽培種的梨葉片中同時也具有特異性的差異代謝物。相較于其他組代謝物質(zhì)，在鴨梨葉片中，矢車菊苷（chrysanthemin）、三羥異黃酮（genistin）、獐牙菜紅素（swertiajaponin）、日當藥黃素（swertiajaponin）、6α-羥基蓖麻酮（6alpha-hydroxycastasterone ）、甘草次酸（glycyrrhetinic acid）和原堿草酸（protobassic acid）等的含量相對較高；在南紅葉片中含量較高的差異代謝物主要有絲瓜皂苷R（lucyoside R）、3，4，5-三羥基-6-（2-羥基-6-甲氧基苯氧基）惡烷-2-羧酸[3，4，5-trihydroxy-6-（2-hydroxy-6-methoxyphenoxy）oxane-2-carboxylic acid]和原堿草酸（protobassic acid）；在翠冠葉片中含量較高的差異代謝物主要有二氫薔薇苷（dihydroroseoside）；在庫爾勒香梨葉片中含量較高的差異代謝物主要有6-O-b-D-呋喃果糖基-2-脫氧-D-葡萄糖（6-O-b-D-fructofuranosyl-2-deoxy-D-glucose）、5，7-二羥基-3，6，8，4'-四甲氧基黃酮 7-葡萄糖基-（1-＞3）-半乳糖苷[5，7-dihydroxy-3，6，8，4'-tetramethoxyflavone 7-glucosyl-（1-＞3）-galactoside]、二氫薔薇苷（dihydroroseoside）和（6R）-5，10-亞甲基四氫葉酸（6R）-5，10-methenyltetrahydrofolate等；在超紅葉片中含量較高的代謝物主要有3-反式-香豆酰圓環(huán)酸（3-trans-p-coumaroylrotundic acid）、三萜皂苷Ⅰ（pitheduloside Ⅰ）和6S，9R-二羥基-4，7E-大扁豆烯-3-酮9-[芹菜糖基-（1-＞6）-葡萄糖苷]｛6S，9R-dihydroxy-4，7E-megastigmadien-3-one 9-[apiosyl-（1-＞6）-glucoside]｝）等（圖3）。以上結(jié)果表明，5個栽培種梨葉片中的代謝物存在顯著差異，也暗示著葉片的功能存在差異。

采用Pearson相關(guān)系數(shù)來衡量VIP值位于前50的差異代謝物含量的相關(guān)性。結(jié)果表明（圖4），1275對代謝物含量有642對（r＞0）呈正相關(guān)，633對差異代謝物含量呈負相關(guān)（r＜0）。與福鼎大白茶相比，5種梨葉片中排名位于前50的差異代謝物含量呈顯著正相關(guān)，如椴樹甙A（ptelatoside A）與（6R）-5，10-亞甲基四氫葉酸[（6R）-5，10-methenyltetrahydrofolate]、3-O-咖啡酰喹酸丁酯（butyl 3-O-caffeoylquinate）、原堿基酸（protobassic acid）、獐牙菜苷（swertiajaponin）、環(huán)西番蓮苷Ⅵ（cyclopassifloside Ⅵ）和葫蘆巴堿（trigonelline），其多數(shù)屬于脂類和類脂分子。相比其他組，甘草酸（glycyrrhetinic acid）是在鴨梨葉片中含量較高的代謝物，與其正相關(guān)代謝物主要有表沒食子兒茶素7-O-沒食子酸酯（epigallocatechin 7-O-gallate）、東方素7-O-咖啡酸酯（orientin 7-O-caffeate）、矢車菊苷（chrysanthemin）、三羥異黃酮（genistin）、槲皮素3-板藍根苷（quercetin 3-lathyroside）、3-O-咖啡酰喹酸丁酯（butyl 3-O-caffeoylquinate）、6α-羥基蓖麻酮（6alpha-hydroxycastasterone）、云杉苷（picein）、乙酸苯酚酯（phenyl acetate）和日當藥黃素（swertiajaponin），其正相關(guān)系數(shù)均大于0.9。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，在葉片生長發(fā)育過程中，正相關(guān)的代謝物可能位于相同的代謝通路上，參與相同的發(fā)育過程。

2.4 差異代謝物的K-mean分析

采用K-mean對差異代謝物的表達趨勢進行聚類分析，將差異代謝物共劃分為12個亞組，在這12個組中，差異代謝物的變化趨勢基本一致，其中1、2、6、8、10和11組中差異代謝物的數(shù)目較多，分別是229、200、104、304、256和81個，其中1、2和8組中差異代謝物的含量變化趨勢基本一致。在3、6、7和9組中，福鼎大白茶葉片中代謝物的含量明顯高于梨葉片中代謝物的含量。在4組中總共含有29種代謝物，且其在梨葉片中的含量明顯高于在茶葉片中的含量，主要包括勒皮啶、吡咯黃質(zhì)、艾格利諾，其分屬于苯環(huán)型化合物、糖類、多酮類化合物、脂類和類脂類分子。在5組中，超紅葉片中代謝物的含量顯著低于其他梨葉片中該代謝物的含量，主要代謝物有γ-西紅花酸（gamma-crocetin）、阿爾巴呋喃素A（albafuran A）、甲基三烯炔諾酮（gestrinone）、槲皮素3-（6''-丙二酰半乳糖苷）[quercetin 3-（6''-malonylgalactoside）]、1-十六烷基-2-[（2'-α-葡糖基）-β-葡糖基]-3-β-木糖基-sn-甘油{1-hexadecanyl-2-[（2'-alpha-glucosyl）-beta-glucosyl]-3-beta-xylosyl-sn-glycerol}、異肝素 2''-[6-（E）-阿魏酰葡糖苷] 4'-葡糖苷｛isoscoparin 2''-[6-（E）-feruloylglucoside] 4'-glucoside｝，多數(shù)屬于脂類和類脂類分子，該結(jié)果也表明西方梨與東方梨葉片的代謝物含量具有明顯的差異（圖5）。

2.5 差異代謝物的代謝通路分析

對庫爾勒香梨、超紅、南紅、鴨梨、翠冠與福鼎大白茶葉片的差異代謝物進行KEGG富集分析，結(jié)果表明，5個比較組的差異代謝物共富集到78個KEGG通路上，每個比較組分別富集在76、71、73、70和74通路上。對5個不同的比較組分別分析發(fā)現(xiàn)，不同比較組的差異代謝物排名前3位的KEGG通路一致，分別是ABC轉(zhuǎn)運（pxb02010）、黃酮和黃酮醇生物合成（pxb00944）及類黃酮生物合成（pxb00941），分別有13～14、9～10和7～8種代謝物富集在這3個通路上。與福鼎大白茶相比，梨葉片中主要上調(diào)的代謝物有膽堿、D-核糖、D-甘露醇、山梨醇、木二糖和槲皮素3-（6''-丙二酰-葡萄糖苷）；梨葉片中下調(diào)的差異代謝物含量主要有鄰苯二甲酸、阿洛糖、槲皮苷、異牧荊素、芹菜苷、異槲皮苷、蕓香苷、山柰酚、白藜蘆素、葉酮醇和表兒茶素。相較于茶樹葉片中的黃酮和黃酮醇生物合成途徑中代謝物的含量，梨葉片中檢測出該途徑所涉及VIP值排名靠前的差異代謝物含量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，間接說明梨葉片中黃酮和黃酮醇次生代謝物的含量低于茶葉中該類代謝物的含量。梨中黃酮類物質(zhì)主要存在于葉片和果皮中，在果樹應(yīng)對非生物脅迫、調(diào)節(jié)花色、藥用、調(diào)控激素等方面具有重要作用。黃酮和黃酮醇生物合成途徑中包含的代謝物主要有槲皮苷、異牡荊素、芹菜苷、異槲皮苷、蘆丁、黃芪苷、漆葉苷、山柰酚-3-槐糖苷、槲皮素3-（6''-丙二?；?糖苷）等，是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)梨生長發(fā)育過程[20-21]。另外，VIP值排名前20的差異代謝物的富集通路基本一致，富集在每個通路上的差異代謝物的數(shù)目也基本一致，主要有甲硫腺苷、順-玉米素-O-葡萄糖苷、順-玉米素-7-N-葡萄糖苷、二氫玉米素-O-葡萄糖苷和二氫玉米素核苷。在單桿菌生物合成途徑中富集的代謝物主要有天門冬氨酸、精氨酸和四氫吡啶二羧酸（圖6）。

3 討 論

庫爾勒香梨、超紅、南紅、鴨梨、翠冠5個主栽品種代謝物數(shù)量和含量具有明顯差異，其中超紅梨葉片的代謝物明顯區(qū)別于其他4個梨品種，這可能是超紅梨屬于西方梨，而翠冠、鴨梨、南紅、庫爾勒香梨屬于東方梨所導(dǎo)致。另外，庫爾勒香梨葉片的代謝物在PCA聚類分析中與翠冠、鴨梨和南紅梨葉片代謝物聚類較遠，這也進一步說明起源不同的梨可能導(dǎo)致其代謝物差異。庫爾勒香梨屬于新疆梨系統(tǒng)，其是西方梨和東方梨雜交形成的品種[15]。因此，庫爾勒香梨葉片代謝物PCA聚類分析介于西方梨和東方梨之間。

葉片作為植物重要的營養(yǎng)器官，不僅支持果樹生長發(fā)育，也為果實品質(zhì)發(fā)育提供營養(yǎng)成分。在超紅梨葉片代謝物的KEGG富集分析時發(fā)現(xiàn)，玉米素合成途徑（pxb00908）和單桿菌生物合成（pxb00261）途徑是超紅葉片代謝物顯著富集的兩個通路，該通路包含的代謝物主要有順-玉米素-O-葡萄糖苷、順-玉米素-7-N-葡萄糖苷和二氫玉米素-O-葡萄糖苷、天門冬氨酸、精氨酸和四氫吡啶二羧酸等，分屬于有機氧化合物和羧酸及其衍生物，主要參與植物抗性調(diào)控和果實品質(zhì)前體物質(zhì)的合成。梨葉片代謝物與果實品質(zhì)的形成和調(diào)控具有相關(guān)性，代謝物的差異也可能是果實品質(zhì)差異的原因之一。另外，果實中可溶性糖含量是評價果實品質(zhì)和風(fēng)味的重要因素，其主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、木糖和甘露醇等。果實中可溶性糖主要來源于葉片光合作用的產(chǎn)物，以蔗糖和山梨醇的形式存在于葉片中，經(jīng)過韌皮部的長距離運輸最終到達果實，經(jīng)過不同酶的催化反應(yīng)，形成不同種類的糖，在梨中糖的運輸形式則以山梨醇為主[22-23]。葉片和果實中的糖代謝過程可按照產(chǎn)物的不同劃分為3種，即山梨醇代謝型、蔗糖代謝型和己糖代謝型。另外，果實獲取山梨醇的能力和對其轉(zhuǎn)化速率決定著果實的生長速度，調(diào)控果實的生長發(fā)育。山梨醇在山梨醇脫氫酶的催化下轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖，在山梨醇氧化酶的作用下氧化成葡萄糖[24-25]。梨果實在生長發(fā)育的后期，葉片中山梨醇、果糖、甘露醇等代謝物的含量顯著上調(diào)是果實成熟時期合成和轉(zhuǎn)運糖分必要條件之一。此外，山梨醇還參與提高植物的抗逆性，促進養(yǎng)分吸收、提高愈傷誘導(dǎo)率、參與其他糖類物質(zhì)的合成轉(zhuǎn)化等[26]。溫帶植物越冬期間，植物體內(nèi)通過代謝糖醇（山梨醇、甘露醇等）、可溶性糖（蔗糖、海藻糖等）等冷凍保護劑的合成，來提高自身的耐寒性[27]。

福鼎大白茶葉片包含著豐富的營養(yǎng)成分與藥效成分，氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、多酚、咖啡堿和茶色素等均是茶葉中的重要組分，不僅可以滿足人們對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，同時具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌及降血糖、降血壓、降血脂等功效[28-29]。梨葉片中也含有豐富的氨基酸類與黃酮類代謝物，具有抗菌消炎、抗氧化、防癌和抗癌的作用，如甘草次酸、三羥異黃酮、反式綠原酸等。筆者在本研究中也鑒定出具有開發(fā)利用價值的次生代謝物質(zhì)，如在鴨梨葉片中的矢車菊苷、三羥異黃酮、獐牙菜紅素和日當藥黃素等；在南紅梨葉片中含量較高的絲瓜皂苷R、原堿草酸；在庫爾勒香梨葉片中含量較高的二氫薔薇苷；在超紅梨葉片中含量較高的3-反式-香豆酰圓環(huán)酸、三萜皂苷Ⅰ等。梨葉片中含有的可開發(fā)利用的次生代謝物質(zhì)成分大多具有藥用價值，抗氧化性較強，在抗炎、抗菌等方面具有潛在的應(yīng)用價值。這也間接增加了梨葉片的開發(fā)利用途徑，梨葉片可以作為活性物質(zhì)的提取原料之一。

4 結(jié) 論

基于代謝組比較分析庫爾勒香梨、超紅、南紅、鴨梨、翠冠與對照福鼎大白茶的葉片代謝物含量和種類的差異，共檢測出9011種代謝物，代謝物種內(nèi)聚類較為集中，種間聚類相對較遠。庫爾勒香梨、超紅、南紅、鴨梨、翠冠與福鼎大白茶比較組，差異代謝物的數(shù)目分別是1194、1153、1176、1153和1164種，共有的差異代謝物的數(shù)目為747種，特異性差異代謝物分別有55、155、54、59和28種。排名前50的差異代謝物在5個主栽梨葉片中的表達豐度上具有明顯差異，并且642對代謝物含量存在正相關(guān)，633對代謝物含量存在負相關(guān)。超紅葉片中代謝物在3、5和7組中含量差異較大，南紅梨在12組中代謝物含量相對較少。黃酮和黃酮醇生物合成（pxb00944）、ABC轉(zhuǎn)運（pxb02010）和類黃酮生物合成（pxb00941）等途徑是差異代謝物富集的主要通路，其中山梨醇、果糖、甘露醇、檸檬酸、水楊酸、馬來酸、甲基丙二酸等代謝物的含量顯著上調(diào)。玉米素合成（pxb00908）和單桿菌生物合成（pxb00261）途徑也是超紅葉片中代謝物顯著富集的代謝通路。因此，不同栽培種的梨葉片的代謝物在種類和含量上具有顯著差異，研究結(jié)果可為開發(fā)利用梨葉片資源提供理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2024-02-02 接受日期：2024-04-20

基金項目：山東省農(nóng)科院創(chuàng)新工程項目（CXGC2023F21、CXGC2023A13）；山東省果樹研究所青年基金（GSS2022QN11）；國家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-28-37）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2020MC141、ZR2021MC177、ZR2023MC061）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點實驗室開放基金（NYZS202206）

作者簡介：焦慧君，女，助理研究員，博士，研究方向為果實品質(zhì)調(diào)控。Tel：0538-8806302，E-mail：jiaohj_njau@163.com。#為共同第一作者。冉昆，男，研究員，博士，研究方向為果樹遺傳育種與栽培管理。Tel：0538-8207123，E-mail：rkrl001@126.com

*通信作者 Author for correspondence. Tel：0538-8207123，E-mail：weisw2007@163.com