一例赤大袋鼠梭菌性腸炎的診斷和病原分離鑒定

摘 要 通過臨床癥狀、尸體剖檢、組織病理學(xué)、毒素實驗和細(xì)菌分離鑒定的方法確診了1例由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的赤大袋鼠（Macropus rufus）梭菌性腸炎的自然病例。動物園1只成年赤大袋鼠突然精神沉郁、厭食，于20 h后死亡，尸體角弓反張，腹圍膨大。尸體剖檢和組織學(xué)檢查表明：胃腸道、肝臟和腎臟出現(xiàn)具有梭菌性腸炎證病意義的病變。小白鼠毒素實驗結(jié)果顯示，血樣腸內(nèi)容物內(nèi)有急性致死性毒素。從出血的腸黏膜面分離到單一、有芽孢、粗大的革蘭陽性桿菌，經(jīng)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因型多重PCR鑒定為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。研究結(jié)果可為赤大袋鼠梭菌性腸炎的診斷和防控提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：赤大袋鼠；梭菌性腸炎；出血性壞死性胃腸炎；A型產(chǎn)氣莢膜梭菌

中圖分類號：S858. 9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2310 - 1490（2024）- 02 - 0403 - 06

DOI：10.12375/ysdwxb.20240220

梭菌性腸炎也叫魏氏梭菌病，是由產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的人和動物多發(fā)的腸道疾病，本病以急性、致死性和出血性腸炎為主要特征。產(chǎn)氣莢膜梭菌過度生長，伴隨著細(xì)菌外毒素的釋放，導(dǎo)致感染動物胃或腸黏膜嚴(yán)重出血和壞死［1］。動物的梭菌性腸炎常見于牛［2］、馬鹿（Cervus ca?nadensis）［3］、野牦牛（Bos mutus）［4］、鹿（Cervidae）［5］和羊駝（Vicugna pacos）［6］等反芻動物，也有豬［7］、家兔［8］和馬［9］等發(fā)生此病的報道。產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的毒素有20多種，單一菌株產(chǎn)生特定毒素，根據(jù)菌株攜帶毒素的情況將其分為7 個基因型：A 型（α）、B 型（α、β、ε）、C型（α、β、+/-cpe）、D型（α、ε、+/-cpe）、E型（α、? 、+/-cpe）、F型（α、cpe）和G型（α、netB）［10］。

赤大袋鼠（Macropus rufus）屬有袋目（Marsupia?lia）袋鼠科（Macropodidae），產(chǎn)于澳大利亞，是袋鼠科中體型最大的一種［11］，以群居活動為主，生活于草原地帶，以各種草類、野菜等為食［12］。目前，在國內(nèi)外還未見赤大袋鼠梭菌性腸炎病例的報道。本研究通過多種方法確診了1例赤大袋鼠梭菌性腸炎的死亡病例，為該類疾病的診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 實驗動物

1只病死老年赤大袋鼠，由大青山野生動物園提供。6只6周齡昆明種小白鼠（SPF級），購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

1. 1. 2 產(chǎn)氣莢膜梭菌5種毒素基因特異性引物

選取產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性菌株，根據(jù)已有文獻(xiàn)［13?14］設(shè)計α、β、ε、? 四種毒素基因引物，引物信息見表1。

1. 2 方法

1. 2. 1 尸體剖檢

對病死赤大袋鼠進(jìn)行尸體剖檢，觀察和記錄大體病變。剖檢過程中分別取心、肝、脾、肺和腎等全身各組織器官（1. 5 cm×1. 0 cm×1. 0 cm），放入10%福爾馬林溶液中固定。

1. 2. 2 病理組織切片制備和觀察

對固定24 h的組織進(jìn)行修塊、脫水、透明、石蠟包埋、切片（厚度為3 μm）、蘇木素-伊紅染色（HE）、封片和烤片，并在顯微鏡下觀察。

1. 2. 3 小白鼠毒素實驗

取空腸血樣內(nèi)容物3 mL，加2倍生理鹽水稀釋后，3 000 r/min離心5 min，取上清液，均勻分成2份，1份60 ℃加熱30 min，1份不加熱。取6只小白鼠隨機(jī)分為2組，3只/組。2份上清液分別腹腔注射于一組小白鼠，1. 2 mL/只，觀察結(jié)果至接種后24 h。

1. 2. 4 細(xì)菌分離和鑒定

1. 2. 4. 1 細(xì)菌分離

用接種環(huán)無菌挑取赤大袋鼠出血的腸黏膜組織，接種于硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（FTG）內(nèi)，37 ℃厭氧培養(yǎng)6～8 h，取培養(yǎng)物接種于梭菌選擇性培養(yǎng)基（TSN培養(yǎng)基），37 ℃厭氧培養(yǎng)6～8 h，觀察菌落生長情況。挑取菌落制備涂片，革蘭染色，鏡檢。

1. 2. 4. 2 細(xì)菌毒素基因型多重PCR鑒定

取純培養(yǎng)的1～2個產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落，置于100 μL蒸餾水中97 ℃煮沸10 min，10 000 r/min離心10 min。取上清液用于PCR 模板。PCR 反應(yīng)體系：25 μL2×Taq Master Mix酶，引物上、下游各1 μL，DNA模板5 μL，補(bǔ)水至50 μL混勻后進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 7 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃，30 min。PCR程序結(jié)束后在2%瓊脂糖凝膠上電泳，110 V 30 min結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2. 1 臨床病史

大青山野生動物園的1只成年雄性赤大袋鼠突然精神沉郁、厭食，于第2天清晨死亡，病程20 h。

2. 2 剖檢病變

病死赤大袋鼠尸體角弓反張，腹圍膨大（圖1），肛門周圍毛上附著少量污紅色稀便。血液呈黏稠的黑紅色，凝固不良。腹壁腹膜表面有彌漫性分布的出血斑點，胃漿膜面散在大小不等的出血點。脾臟表面分布大小不等的黑紅色輕度隆起病灶。腎臟嚴(yán)重淤血和水腫，呈暗紅色，切面髓質(zhì)有散在和密集呈細(xì)線狀排列的灰色結(jié)晶樣物，腎乳頭部位結(jié)晶樣物密集。肝臟輕度淤血和水腫，呈暗紅色至黑紅色，表面局灶性病變（土黃色），膽囊明顯擴(kuò)張。心肌色彩混濁無光，心臟橫徑明顯增寬，心肌質(zhì)軟，右心室質(zhì)軟、擴(kuò)張明顯，左右心室內(nèi)充滿黑紅色凝固不良的帶有氣泡的血液。肺臟呈粉紅色，回縮良好，膈葉表面散在或密集大小不等的出血斑點，肺泡性肺氣腫?？漳c后段漿膜面呈污黑紅色，腸系膜靜脈因嚴(yán)重淤血怒張，局部漿膜面散在大小不等的出血斑點?？漳c后段不同程度出血，腸黏膜表面散在或密布黑紅色出血斑點，嚴(yán)重區(qū)域腸腔內(nèi)充有大量污濁的黑紅色血樣液體，腸黏膜彌漫性出血，表面粗糙呈黑紅色（圖2，圖3）。胃漿膜面及附近系膜出血呈黑紅色，胃底部黏膜增厚，因嚴(yán)重彌漫性出血呈大面積黑紅色（圖4）。

2. 3 組織病理學(xué)變化

嚴(yán)重出血性壞死性胃腸炎，胃和空腸黏膜層和局部黏膜下層彌漫出血和水腫（圖5），黏膜層上三分之二組織壞死，上皮細(xì)胞完全脫落，嚴(yán)重區(qū)域腸黏膜層全部壞死，黏膜下層淋巴濾泡嚴(yán)重出血和壞死（圖6）。肺輕度充血和水腫，肺泡腔內(nèi)可見大量中性粒細(xì)胞和少量巨噬細(xì)胞，部分巨噬細(xì)胞出現(xiàn)“吞紅”現(xiàn)象。急性腎小球腎炎，腎臟水腫，腎小管上皮普遍腫脹，局部整個腎小管上皮發(fā)生明顯的透明變性。壞死性肝炎，肝臟淤血和水腫，肝細(xì)胞板上肝細(xì)胞排列松散，竇狀隙壁溶解，破壞明顯，肝細(xì)胞廣泛散在性壞死，出現(xiàn)大小不等的壞死灶，無炎性細(xì)胞浸潤，部分未壞死的肝細(xì)胞呈明顯微泡性脂肪變性。急性炎性脾腫，脾臟嚴(yán)重充血和出血，淋巴細(xì)胞數(shù)量稀少，白髓數(shù)量少，體積縮小，紅髓內(nèi)淋巴細(xì)胞所剩無幾。其他組織器官不同程度的變質(zhì)性變化。

2. 4 小白鼠毒素實驗

不加熱組小白鼠于接種后13～18 h全部死亡，加熱組小白鼠接種后24 h未見異常。實驗結(jié)果表明血樣腸內(nèi)容物內(nèi)有致死性毒素。

2. 5 細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定

2. 5. 1 細(xì)菌培養(yǎng)

在TSN培養(yǎng)基上生長出大量黑色圓形小菌落，菌落涂片可見大量單一的革蘭陽性粗大桿菌（圖7）。

2. 5. 2 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因型多重PCR鑒定

產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因型多重PCR 結(jié)果顯示（圖8），獲得475 bp長的α 毒素基因目的條帶，病原菌鑒定為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

3 討論

本病例赤大袋鼠臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、厭食和排稀便，發(fā)病急，死亡快，尸體角弓反張。這些臨床癥狀和家兔［15］、犢牛［16］感染梭菌性腸炎的表現(xiàn)相似。梭菌性腸炎具有證病意義的病變是胃腸道嚴(yán)重出血性壞死性炎。本病例赤大袋鼠剖檢顯示其患嚴(yán)重的出血性壞死性胃腸炎，胃、空腸黏膜層和局部黏膜下層彌漫出血和水腫，黏膜層組織壞死，上皮細(xì)胞脫落，黏膜下層淋巴濾泡出血和壞死；腸腔內(nèi)有大量污濁的黑紅色血樣液體，腸黏膜彌漫性出血，呈黑紅色。其他動物梭菌性腸炎也表現(xiàn)出相似的胃腸道出血性壞死性變化，如家兔梭菌性腸炎腸道腫脹充氣，致使腸壁變薄而透明，腸黏膜上有大量出血點，胃黏膜脫落，出現(xiàn)潰瘍灶［15］；犢牛梭菌性腸炎的空腸和回腸出現(xiàn)壞死性腸炎［16］。

梭菌性腸炎肝臟和腎臟的病變也具有證病意義。本病例赤大袋鼠腎臟嚴(yán)重淤血和水腫，急性腎小球腎炎，切面髓質(zhì)、腎乳頭部位有結(jié)晶樣物密集，腎小管上皮發(fā)生明顯的透明變性。肝臟輕度淤血和水腫，出現(xiàn)壞死性肝炎。病死赤大袋鼠腎臟和肝臟的病變特征和家兔梭菌性腸炎病變［15］相似，患病家兔腎臟和肝臟均出現(xiàn)充血和腫大，并伴有肝細(xì)胞壞死。

本病例赤大袋鼠剖檢脾臟出現(xiàn)炎性脾腫，心臟出現(xiàn)心功能不全。這些病變與家兔發(fā)生的梭菌性腸炎病變相似，患病家兔脾臟腫大，為深褐色，心臟表面血管怒張，呈樹枝狀［15］。

本病例中產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因型經(jīng)多重PCR獲得了α 毒素基因目的條帶，病原菌判定為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。梭菌性腸炎的防控難度較大。Arturs?son等［17］報道產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）可以突破腸道間的緊密連接，引起食源性疾病。A型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的芽孢能夠長時間存在于外界環(huán)境中，對環(huán)境造成污染，并會隨動物飲食進(jìn)入其消化系統(tǒng)。動物腸胃內(nèi)益菌數(shù)量較多時，對梭菌腸炎病原體的抵抗能力就較強(qiáng)，不會發(fā)病。動物自身免疫力下降或者產(chǎn)生應(yīng)激（長途運輸、幼畜斷奶或更換飼料）時，會導(dǎo)致消化系統(tǒng)功能紊亂、菌群失調(diào)，引起動物發(fā)?。凰拗髂挲g變大或者疾病等誘發(fā)因素也可引起梭菌性腸炎的發(fā)生［18］。本案例中，年齡偏大、自身免疫力下降可能是赤大袋鼠發(fā)病的主要原因。定期進(jìn)行疫苗免疫或在飼草料中添加磺胺咪片等可以預(yù)防動物梭菌性腸炎的發(fā)生［19］。

參考文獻(xiàn)：

［1］ SIMPSON K M， CALLAN R J， VAN METRE D C. Clostridial ab?omasitis and enteritis in ruminants［J］. Veterinary Clinics of NorthAmerica - Food Animal Practice， 2018， 34（1）：155-184.

［2］ 陳錦輝，郭宏軍．牛產(chǎn)氣莢膜梭菌性腸炎的診治［J］．中國獸醫(yī)雜志，2016，52（6）：49-50.

CHEN J H， GUO H J. Diagnosis and treatment of Clostridium per?fringens enteritis in cattle［J］. Chinese Journal of Veterinary Medi?cine， 2016， 52（6）： 49-50.

［3］ 冉多良，黃嘉駟，蘇艷，等．馬鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌性腸炎的診治［J］. 中國獸醫(yī)雜志，2005，41（4）：54.

RAN D L， HUANG J S， SU Y， et al. Diagnosis and treatment ofClostridium perfringens enteritis in red deer［J］. Chinese Journalof Veterinary Medicine， 2005，41（4）： 54.

［4］ 韓志輝．野牦牛魏氏梭菌性腸炎的診治［J］．中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2001，20（2）：27-28.

HAN Z H. Diagnosis and treatment of wild yak Clostridium perfrin?gens enteritis［ J］. Journal of Traditional Chinese Veterinary Medi?cine， 2001，20（2）： 27-28.

［5］ ASCHFALK A， VALENTIN-WEIGAND P， MüLLER W， et al.Toxin types of Clostridium perfringens isolated from free-ranging，semi-domesticated reindeer in Norway［J］. The Veterinary Re?cord， 2002， 151（7）：210-213.

［6］ ROSADIO R， LONDO?E P， PéREZ D， et al. Eimeria macusani?ensis associated lesions in neonate alpacas dying from enterotox?emia［J］. Veterinary Parasitology， 2010， 168（1/2）：116-120.

［7］ 陳永云．豬梭菌性腸炎診治［J］．中國畜禽種業(yè)，2016，12（12）：48.

CHEN Y Y. Diagnosis and treatment of porcine Clostridium per?fringens enteritis［J］. The Chinese Livestock and Poultry Breed?ing， 2016， 12（ 12）： 48.

［8］ 馬愛華，朱鳳霞．一例肉兔魏氏梭菌性腸炎的診治報告［J］．畜禽業(yè)，2018，29（8）：132.

MA A H， ZHU F X. Diagnosis and treatment report of a case ofClostridium perfringens enteritis in meat rabbits［J］. Livestock andPoultry Industry， 2018， 29（8）： 132.

［9］ DIAB S S， KINDE H， MOORE J， et al. Pathology of Clostridiumperfringens type C enterotoxemia in horses［J］. Veterinary Pathol?ogy， 2012， 49（2）：255-263.

［10］ ROOD J I， ADAMS V， LACEY J， et al. Expansion of the Clos?tridium perfringens toxin-based typing scheme［J］. Anaerobe，2018，53：5-10.

［11］ 趙芳菊. 赤大袋鼠飼養(yǎng)繁殖及人工育幼［J］. 畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），2019（1）：22-24.

ZHAO F J. Breeding and artificial breeding of red kangaroo ［J］.Graziery Veterinary Sciences （Electronic Version）， 2019 （1）：22-24.

［12］ 盛志鵬，李欽．內(nèi)固定治療赤大袋鼠跗跖骨骨折病例［J］．中國獸醫(yī)雜志，2021，57（1）：116-117.

SHENG Z P， LI Q. Treatment of tarsometatarsal fracture of redkangaroo with internal fixation ［J］. Chinese Journal of Veteri?nary Medicine， 2021， 57（1）： 116-117.

［13］ MEER R R， SONGER J G. Multiplex polymerase chain reactionassay for genotyping Clostridium perfringens［J］. American Jour?nal of Veterinary Research， 1997， 58（7）： 702-705.

［14］ BUESCHEL D M， JOST B H， BILLINGTON S J，et al. Preva?lence of cpb2， encoding beta2 toxin， in Clostridium perfringensfield isolates： correlation of genotype with phenotype［J］. Veteri?nary Microbiology， 2003， 94（2）：121-129.

［15］ 桑雷， 孫世坤， 陳巖鋒， 等． 一例仔兔魏氏梭菌病的診治［J］． 中國養(yǎng)兔， 2018（6）： 32； 31.

SANG L， SUN S K， CHEN Y F， et al. Diagnosis and treatmentof a young rabbit with Clostridium perfringens disease ［J］. Chi?nese Journal of Rabbit Farming， 2018（6）： 32； 31.

［16］ 李繼堂，梁淑娟，劉興福．犢牛梭菌性腸炎的診治［J］．中國動物保健，2023，25（6）：42-43.

LI J T， LIANG S J， LIU X F. Diagnosis and treatment of Clos?tridium perfringens enteritis in calves ［J］. China Animal Health，2023， 25（ 6）： 42-43.

［17］ ARTURSSON P，KNIGHT S D. Structural biology. Breaking theintestinal barrier to deliver drugs［J］. Science，2015，347（6223）：716-717.

［18］ MINICH D， MADDEN C， NAVARRO M A， et al. Gut micro?biota and age shape susceptibility to clostridial enteritis in lori?keets under human care［J］. Animal Microbiome， 2022， 4（1）： 7.

［19］ 鄭秉武，智宇，李彥軍，等. 一例大林羚腸毒血癥的診斷［J］.野生動物學(xué)報，2022，43（3）：788-792.

ZHENG B W，ZHI Y，LI Y J， et al. Diagnosis of a case of entero?toxaemia in a common eland （Tragelaphus oryx）［J］. ChineseJournal of Wildlife，2022，43（3）：788-792.

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項課題（2021ZD0012）