圈養(yǎng)珍稀鶴類長瘧原蟲流行情況研究

摘 要 2017—2021年，收集5家飼養(yǎng)單位12種圈養(yǎng)珍稀鶴類的284份樣品進行血孢子蟲病的流行調查。采用血孢子蟲細胞色素b（Cyt b）基因套式PCR檢測和Blast序列比對，結果顯示：血孢子蟲基因序列與已知長瘧原蟲（Plasmodium elongatum）DENVID02進化支匹配度達到100％；結合蟲體形態(tài)學，確定該寄生蟲所屬類群為長瘧原蟲。長瘧原蟲在黑頸鶴（Grus nigricollis）、白鶴（Leucogeranus leucogeranus）、丹頂鶴（Grus japo?nensis）、白頭鶴（G. monacha）、灰鶴（G. grus）和白枕鶴（Antigone vipio）6種鶴類中被檢出，檢出率為8. 45%（24/284）。此外，感染長瘧原蟲DENVID02進化支的鶴類個體未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，所有感染個體均未采取防治措施。在跟蹤監(jiān)測中，發(fā)現(xiàn)病原體在鶴類體內消失或呈跨年度攜帶現(xiàn)象，推測鶴類可能對長瘧原蟲DENVID02具有先天抵抗力。

關鍵詞：珍稀鶴類；長瘧原蟲；流行；疾病防控

中圖分類號：S858. 9 文獻標識碼：A 文章編號：2310 - 1490（2024）- 02 - 0347 - 07

DOI：10.12375/ysdwxb.20240214

血液寄生蟲嚴重影響鳥類健康狀況，癥狀表現(xiàn)在生理、行為等多個方面，可能使寄主的適合度降低，是導致物種滅絕的原因之一［1?2］。在各類血液寄生蟲的研究中，以血孢子蟲最為深入［3］。能感染鳥類的血孢子蟲目（Haemosporidia）有3 屬，分別為瘧原蟲屬（Plasmodium）、血變原蟲屬（Haemoproteus）和住白細胞原蟲屬（Leucocytozoon）［4］，通常通過吸血蚊蟲傳播［5］。瘧原蟲是一種呈全球性分布的血液寄生蟲，已報道的瘧原蟲種類多達200余種［6］，通過形態(tài)學特征進行明確鑒定的鳥類瘧原蟲已有55種［7］。長瘧原蟲（Plasmodium elongatum）已在多種鳥類中被檢出，包括企鵝目（Sphenisciformes）、雀形目（Passeri?formes）和無翼鳥目（Apterygiformes）等［8?10］。

鶴被稱為評估濕地生態(tài)系統(tǒng)健康的“旗艦物種”［11］。我國是世界上擁有鶴種類最多的國家之一［12］，其中，白鶴（Leucogeranus leucogeranus）、白枕鶴（Antigone vipio）、赤頸鶴（A. antigone）、黑頸鶴（Grus nigricollis）、白頭鶴（G. monacha）和丹頂鶴（G.japonensis）為國家一級重點保護野生動物［13］。我國鶴類寄生蟲性疾病發(fā)病數量占鶴類疾病發(fā)病數量的26. 15％ ，尤其是幼鶴感染血孢子蟲后致死率較高［14?16］。已有報道指出，長瘧原蟲會對非適應性鳥類的健康造成威脅［8?10，17?19］，典型易感動物為麥哲倫企鵝（Spheniscus magellanicus），其在圈養(yǎng)種群中傳播會導致高發(fā)病率和快速死亡［20?21］。然而長瘧原蟲在圈養(yǎng)鶴類中的感染情況尚未被報道。2017—2021年，以5家飼養(yǎng)單位12種珍稀鶴類的血液或組織樣品為研究對象，采用形態(tài)學和分子生物學等方法分析樣品中長瘧原蟲的感染情況，以期指導生產實踐，促進珍稀鶴類種群健康發(fā)展。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集與處理

采集北京動物園十三陵繁育研究基地（以下簡稱“北京動物園”）、南京紅山森林動物園、保定動物園、杭州動物園和太原動物園12種珍稀鶴類的血液或組織，共284份樣品（表1）。將新鮮血液樣品分為2份，1份用于制備血涂片，另1份置于EDTA抗凝管內，-80 ℃保存?zhèn)溆?；將新鮮組織樣品制備成組織觸片后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。血涂片及臟器觸片經甲醇固定后，室溫存放備用。

1. 2 DNA 提取、擴增、測序和序列分析

按照Ezup 柱式血液基因組DNA 抽提試劑盒（B518253-0050，生工生物工程（上海）股份有限公司）和Ezup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒（B518251-0050，生工生物工程（上海）股份有限公司）的使用說明進行血液及組織樣品的DNA提取。

采用巢式PCR法，擴增鳥類血液和組織寄生蟲細胞色素b（Cyt b）基因片段［22］。第1輪擴增引物為F（5'-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3'；I為通用堿基，次黃（嘌呤核）苷）和R（5'-ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3'）。反應體系20 μL，包括2×Taq酶混合溶液（B639295，Life Biotech，India Delhi）10 μL，F(xiàn)、R各1 μL，ddH2O 6 μL，模板DNA 2 μL。第1輪擴增反應程序：94 ℃模板變性3 min；94 ℃產物變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃引物延伸45 s，20個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。第2 輪擴增引物為F（5'-ATGGTGCTTTCGATATATGCATG-3'）和R（5'-GCATTATCTGGATGTGATAATGGT-3'）。反應體系25. 0 μL，包含2×Taq 酶混合溶液12. 5 μL，F(xiàn)、R 各1. 0 μL，ddH2O 8. 5 μL，模板DNA 2. 0 μL，模板為第1輪擴增產物。第2輪擴增反應程序：94 ℃模板變性3 min；94 ℃產物變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃引物延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1. 5%瓊脂糖凝膠對5 μL第2輪擴增產物進行電泳檢測，凝膠用4S Green Plus無毒核酸凝膠染液（生工生物工程（上海）股份有限公司）染色，在凝膠成像儀（GenoSens1800，Clinx Science Instruments）中觀察結果。電泳檢測為陽性的樣品，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。所有樣品均重復檢測3次。

計算珍稀鶴類某種瘧原蟲的感染率，感染率=某種瘧原蟲陽性樣品數/檢測總樣品數×100%。將雙向測序的序列拼接后，與MalAvi 數據庫（Version2. 5. 6，http：//130. 235. 244. 92/Malavi/about. html）和NCBI數據庫中的Blast模塊進行比對，鑒定血液寄生蟲所屬類群［23］，DNA序列相似度達到100%的歸為相同進化支。多序列比對使用ClustalX 1. 83軟件。

1. 3 血涂片檢測

使用瑞氏-吉姆薩染液（417101，珠海貝索生物技術有限公司）將固定的血涂片和組織觸片染色15 min，雙蒸水漂浮后流水沖洗，風干后在光學顯微鏡下觀察。先在40×物鏡下找到目標位置，再用60×油鏡檢測，判斷個體是否感染血孢子蟲以及寄生蟲的形態(tài)特征，判斷血孢子蟲所屬類群，每個血涂片觀察100個視野［8］。

2 結果

2. 1 長瘧原蟲序列分析

經巢式PCR法檢測、序列拼接和比對分析后，發(fā)現(xiàn)寄生蟲所屬類群為長瘧原蟲。Cyt b 擴增部分序列長度為479 bp，與DENVID02進化支（GenBank登錄號：KU057965）匹配度達100％，與pGRW6進化支（GenBank登錄號：DQ368381）僅有1個堿基差異，即C轉換為T（圖1）。

2. 2 長瘧原蟲形態(tài)學特征

經外周血涂片瑞氏-吉姆薩染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)紅細胞內裂殖體和配子體的形態(tài)符合長瘧原蟲的特征［24］。寄生于紅細胞中的長瘧原蟲早期滋養(yǎng)體形態(tài)不規(guī)則，邊緣偶有輕微變形（圖2A）。裂殖體（圖2B～D）常見于成熟紅細胞中，瘧色素呈棕黑色，常聚集成一個團塊；在成熟裂殖體中，裂殖子的數量從2 個到11 個不等，呈圓形或橢圓形，有時形狀不規(guī)則；當裂殖子數量多達十幾個時，裂殖體體積較大，可占據宿主細胞漿一半的空間，使宿主細胞核移位（圖2D）。大配子體（圖2E）、小配子體（圖2F）形狀細長，邊緣粗糙，細胞質中有多個瘧色素顆粒；大配子體細胞質藍染，較小配子體染色深。

2. 3 長瘧原蟲感染情況

分析發(fā)現(xiàn)5家動物園284份珍稀鶴類樣本中，有24個樣本感染了長瘧原蟲，檢出率為8. 45%。陽性樣品均來自北京動物園，包括黑頸鶴（n=11）、白鶴（n=3）、白頭鶴（n=3）、丹頂鶴（n=2）、灰鶴（Grus grus，n=2）和白枕鶴（n=2）共計6個物種23只個體，且感染個體均未出現(xiàn)臨床癥狀及發(fā)病死亡現(xiàn)象。其他4家動物園的鶴類樣本未檢測出長瘧原蟲。對采樣年份、個體來源、年齡及性別等信息進行分析，發(fā)現(xiàn)：（1）2017—2021年，北京動物園均有鶴類呈長瘧原蟲陽性，2017、2018、2019、2020、2021年陽性樣本數分別為3、4、2、1、14；在感染的23只個體中，22只個體呈單一年份感染，而2018年出殼的黑頸鶴（7Q045）在當年和次年均呈陽性，2020年轉為陰性；（2）野生個體和圈養(yǎng)出生個體均可被感染；（3）幼體（lt;1歲）、亞成體（1～4 歲）和成體（≥4 歲）均可被感染；（4）在感染的23 只個體中，16 只為雌性，7 只為雄性（表2）。

3 討論

北京動物園圈養(yǎng)的黑頸鶴、白鶴、白頭鶴、丹頂鶴、灰鶴和白枕鶴感染的長瘧原蟲（DENVID02）進化支僅在巴西圣保羅動物園的白臉樹鴨（Dendrocygnaviduata）和北京地區(qū)的戈氏巖鹀（Emberiza godlews?kii）樣本中被檢出［25?26］。通過比對DENVID02 與pGRW6 的Cyt b 序列，僅有1 個堿基差異（圖1）。pGRW6進化支在除澳大利亞和南極洲外的其他地區(qū)均有分布，鳥類宿主范圍有60 余種［24］。此外，DENVID02的分布和宿主范圍顯著少于pGRW6，且該進化支的發(fā)現(xiàn)和研究也晚于pGRW6，因此，學者推測DENVID02是由pGRW6進化所得［26］。本研究檢出的DENVID02進化支基因序列與北京地區(qū)的雀形目戈氏巖鹀中報道［26］的進化支序列一致（圖1），推測該進化支可能已經在北京地區(qū)，甚至向周邊其他地區(qū)傳播，但這一推測需要進一步擴大宿主和地域監(jiān)測范圍來驗證。本研究中長瘧原蟲DENVID02的形態(tài)學數據顯示，紅細胞內裂殖體和配子體的形態(tài)特征符合長瘧原蟲的特征，同時發(fā)現(xiàn)存在大量含2個裂殖子的成熟裂殖體，這區(qū)別于金絲雀（Serinuscanaria）長瘧原蟲的形態(tài)［24］，引起圈養(yǎng)鶴類長瘧原蟲（DENVID02）進化支形態(tài)學特征發(fā)生變化的因素有待進一步驗證。

長瘧原蟲不同進化支對鳥類的致病性存在顯著差異，侵染非適應性鳥類種群時，如麥哲倫企鵝和幾維鳥（Apteryx mantelli）感染pGRW6進化支可能出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，甚至死亡［20?21，27］，然而，當紫翅椋鳥（Sturnus vulgaris）和紅交嘴雀（Loxia curvirostra）感染pGRW6進化支時，卻無明顯致病性，推測這兩種鳥可能具有先天抗性［28］。長瘧原蟲（GenBank登錄號：DQ659588）在新西蘭鞍背鴉（Philesturnus carun?culatus）中被檢出，單獨感染無明顯致病性［29］。新西蘭馬爾伯勒海峽2個近海島嶼在2002年和2007年曾爆發(fā)鞍背鴉大量死亡事件，原因是禽痘病毒和長瘧原蟲混合感染導致［30］。本研究中，圈養(yǎng)黑頸鶴、白鶴和丹頂鶴等感染長瘧原蟲（DENVID02）后，并未發(fā)病和死亡，且感染個體未經治療即自愈，因此推測這幾種鶴對此長瘧原蟲有一定的抵抗力。當發(fā)現(xiàn)鶴類感染長瘧原蟲（DENVID02）后，如無臨床癥狀，無需采取干預措施，但建議對感染個體實施跟蹤監(jiān)測，及時了解動物健康狀況，避免出現(xiàn)因抵抗力下降所致的繼發(fā)或混合感染現(xiàn)象。

本研究于2017—2021 年共檢測12 種鶴類，其中，在黑頸鶴、白鶴、白頭鶴、丹頂鶴、灰鶴和白枕鶴6種鶴類中檢出感染個體，而其他鶴類并未檢出，推測不同鶴類是否感染長瘧原蟲可能與動物自身的易感性有關，未來需進一步研究驗證。本研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡和不同性別的鶴類個體均可感染長瘧原蟲（DENVID02），今后可持續(xù)關注感染長瘧原蟲的個體狀態(tài)，為進一步研究長瘧原蟲在珍稀鶴類中的流行特點積累數據。綜上，未來應擴大監(jiān)測范圍，特別是要加強對動物園、保護區(qū)的圈養(yǎng)鳥類及野生鳥類血孢子蟲的主動監(jiān)測力度，了解血孢子蟲病的流行特點，探討病原、宿主與傳播媒介間的相互依存關系，提出有針對性的防治措施，以期為疾病防控和預警提供科學依據。

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基金項目：北京動物園管理處野生鳥類血孢子蟲檢測平臺