高原牧區(qū)不同害鼠胃腸內(nèi)容物對(duì)D 型肉毒神經(jīng)毒素的破壞強(qiáng)度分析

摘 要 為探明高原牧區(qū)不同害鼠胃腸內(nèi)容物對(duì)D型肉毒毒素的破壞強(qiáng)度與害鼠對(duì)毒素的敏感性之間的關(guān)系，采用霍恩氏法測(cè)定了D型肉毒毒素對(duì)高原鼠兔（Ochotona cur?zoniae）、高原鼢鼠（Eospalax baileyi）及青海松田鼠（Neodon fuscus）的灌胃半數(shù)致死劑量（LD50），并測(cè)定3種害鼠胃腸內(nèi)容物及其上清液與D型肉毒毒素作用后的毒素殘留量。結(jié)果表明：D 型肉毒毒素對(duì)高原鼠兔、高原鼢鼠及青海松田鼠的LD50 分別為5 110、5 840、50 100 MLD/kg。害鼠胃腸內(nèi)容物對(duì)毒素的破壞強(qiáng)度由高到低依次是青海松田鼠、高原鼢鼠、高原鼠兔。3種害鼠胃腸內(nèi)容物對(duì)D型肉毒毒素的破壞作用存在差異，且LD50與毒素殘留量之間呈正相關(guān)性。胃腸道環(huán)境差異是導(dǎo)致不同害鼠對(duì)D型肉毒毒素產(chǎn)生敏感性差異的原因之一，研究結(jié)果對(duì)今后選育高效、特異性D型肉毒毒素生物滅鼠劑具有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：草地鼠害；D型肉毒毒素；腸內(nèi)容物；破壞強(qiáng)度；青藏高原牧區(qū)

中圖分類號(hào)：S812. 6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 02 - 0321 - 07

DOI：10.12375/ysdwxb.20240211

由D型肉毒梭菌（Clostridium botulinum）所產(chǎn)毒素研制成的D型肉毒滅鼠劑，在草地鼠害防治過程中通過害鼠自然采食后進(jìn)入其胃腸道，進(jìn)而通過肉毒毒素“四步”作用機(jī)制達(dá)到毒素中毒的效果。第一步，肉毒毒素與細(xì)胞表面受體特異結(jié)合；第二步，通過受體介導(dǎo)胞吞毒素內(nèi)化，進(jìn)入胞漿；第三步，毒素鏈選擇性切割胞內(nèi)底物SNARE蛋白；最后，通過封閉乙酰膽堿的釋放［1］導(dǎo)致呼吸麻痹引起害鼠死亡。因此，分析毒素進(jìn)入害鼠胃腸道，在腸上皮細(xì)胞吸收內(nèi)化之前，胃腸內(nèi)容物對(duì)D型肉毒毒素的破壞強(qiáng)度的差異，是分析D型肉毒毒素對(duì)不同害鼠敏感性差異產(chǎn)生的必不可少的環(huán)節(jié)之一。

生物因?yàn)樗幍纳鷳B(tài)領(lǐng)域豐富多樣，自然環(huán)境的特殊性使得各種生物的食物結(jié)構(gòu)組成各不相同，藥物作為一種外源性攝入的物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)將受到不同因素的影響，特別是口服藥物進(jìn)入機(jī)體后，先后通過口腔、食道、胃腸道等消化器官，接觸到機(jī)體分泌的各種酶類物質(zhì)，繼而發(fā)生物理、化學(xué)反應(yīng)，這一生理過程勢(shì)必會(huì)影響藥物在不同生物體內(nèi)的生物利用度，從而影響藥物在機(jī)體內(nèi)的實(shí)際效果［2］。趙德華等［3］研究也證實(shí)食物可影響一部分小分子靶向藥物的生物利用度，應(yīng)重視食物與小分子靶向藥物之間的相互作用，選擇合理的服藥時(shí)間，以避免增加藥物不良反應(yīng)或降低藥物療效。

關(guān)于高寒草甸主要害鼠高原鼠兔（Ochotona cur?zoniae）、高原鼢鼠（Eospalax baileyi）的食性研究［4］結(jié)果顯示，高原鼠兔的食譜主要為禾草、莎草等單子葉植物及其種子，而高原鼢鼠由于常年生活在地底，俗稱“瞎老鼠”，該鼠種的食物主要由一些植物的發(fā)達(dá)軸根、根莖、球莖和塊根類物質(zhì)組成。從幾種害鼠的采食特性可以看出其食物組成存在一定的差異。測(cè)定并分析不同害鼠胃腸內(nèi)容物對(duì)D型肉毒毒素的破壞強(qiáng)度，對(duì)于補(bǔ)充分析害鼠對(duì)D型肉毒毒素敏感性差異，研制驅(qū)避胃腸道對(duì)D型肉毒毒素的破壞，提高害鼠胃腸道對(duì)毒素吸收的D型肉毒毒素滅鼠劑新劑型非常有必要。因此，本研究主要分析了不同害鼠胃腸內(nèi)容物對(duì)D型肉毒毒素蛋白的破壞強(qiáng)度，在補(bǔ)充完善D型肉毒毒素對(duì)不同害鼠敏感性差異的基礎(chǔ)上，為下一步研制免受胃腸道破壞的新型D型肉毒毒素新制劑提供理論依據(jù)。

1 材料

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

青海松田鼠（Neodon fuscus）捕捉自青海省海北州剛察縣青海湖農(nóng)場，體質(zhì)量25～35 g，在室內(nèi)人工飼養(yǎng)1周后供實(shí)驗(yàn)室用。

高原鼠兔捕捉自青海省海北州祁連縣野牛溝鄉(xiāng)達(dá)玉村野外牧區(qū)，體質(zhì)量125～153 g，在室內(nèi)人工飼養(yǎng)1周后供實(shí)驗(yàn)室用。

高原鼢鼠捕捉自青海省海南藏族自治州貴南縣野外，體質(zhì)量200～270 g，正常飼喂，在室內(nèi)有土的鐵桶內(nèi)避光人工飼養(yǎng)1周后供實(shí)驗(yàn)室用。

1. 2 試驗(yàn)藥品

取D 型肉毒毒素原藥（批號(hào)：2018036，毒價(jià)：2 000萬 MLD/mL），做2 mL毒素+18 mL凍水的10倍稀釋，再做1∶4倍稀釋，即為40萬 MLD/mL小鼠靜注毒價(jià)毒素。

2 方法

2. 1 D 型肉毒毒素對(duì)3 種害鼠灌胃半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定

2. 1. 1 對(duì)高原鼠兔灌胃LD50的測(cè)定

LD50的測(cè)定按霍恩氏法進(jìn)行，以每毫升分別含2 150、4 640、10 000、21 500 MLD的不同毒素濃度灌服量分為4個(gè)試驗(yàn)組。將野生高原鼠兔20只，隨機(jī)分為4組，每組5只，以每100 g體質(zhì)量灌服1 mL的標(biāo)準(zhǔn)灌服，觀察10 d，記錄中毒癥狀和死亡情況。

2. 1. 2 對(duì)高原鼢鼠灌胃LD50的測(cè)定

將抓捕的高原鼢鼠置于鐵皮桶中，飼喂甘藍(lán)。試驗(yàn)時(shí)將試驗(yàn)鼢鼠編號(hào)，放置于相應(yīng)編號(hào)桶內(nèi)，夜間放回裝有泥土的原桶內(nèi)。用霍恩氏法測(cè)定LD50，以每千克體質(zhì)量設(shè)置2 150、4 640、10 000、21 500 MLD劑量組，每組5只，以每100 g體質(zhì)量分別灌服215、464、1 000、2 150 MLD的毒素，飼喂甘藍(lán)，觀察10 d，記錄死亡情況。

2. 1. 3 對(duì)青海松田鼠灌胃LD50的測(cè)定

用霍恩氏法測(cè)定LD50，以每千克體質(zhì)量設(shè)置21 500、464 00、100 000、215 000 MLD 劑量組，每組灌服5只，即每20 g體質(zhì)量分別灌服430、930、2 000、4 300 MLD毒素，喂以燕麥和胡蘿卜，觀察5 d，記錄死亡結(jié)果。

2. 2 三種害鼠胃腸內(nèi)容物對(duì)D 型肉毒毒素的破壞強(qiáng)度分析

將3種試驗(yàn)鼠分別麻醉后，固定在小動(dòng)物解剖臺(tái)上，按試驗(yàn)需求先進(jìn)行心臟穿刺采血，待試驗(yàn)鼠死亡后，分別從每只鼠胃腸內(nèi)容物中取樣品2 g置于離心管中，加入4 mL生理鹽水稀釋搖勻，再加入1 mL稀釋好的毒素，充分混勻，作用24 h后，離心，測(cè)毒。所有試驗(yàn)程序均經(jīng)青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

2. 3 三種害鼠胃腸內(nèi)容物上清液對(duì)D 型肉毒毒素的破壞強(qiáng)度分析

另取胃腸內(nèi)容物分別置于離心管中，加入4 mL生理鹽水稀釋搖勻，4 ℃放置2 h，以4 000 r/min 離心20 min，上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再加入1 mL40萬MLD/mL的毒素，充分混勻，室溫作用24 h后，離心，稀釋測(cè)毒。

3 結(jié)果

3. 1 D 型肉毒毒素對(duì)高原鼠兔、高原鼢鼠和青海松田鼠的灌胃LD50

試驗(yàn)測(cè)得D型肉毒毒素對(duì)高原鼠兔灌胃LD50為5 110 MLD/kg（可信限2 550～10 200 MLD/kg），對(duì)高原鼢鼠灌胃LD50 為5 840 MLD/kg（可信限3 430～9 950 MLD/kg），對(duì)青海松田鼠灌胃LD50 為5. 01 萬MLD/kg（可信限3. 08萬～8. 14萬MLD/kg）（表1）。

3. 2 青海松田鼠胃腸內(nèi)容物及離心上清液對(duì)毒素的影響

將肉毒毒素置于青海松田鼠胃腸內(nèi)容物中作用24 h后，可發(fā)現(xiàn)溶液中D型肉毒毒素含量均有降低，尤其腸內(nèi)容物的毒素含量只有原毒素的1/8，但胃腸內(nèi)容物經(jīng)離心后的上清液對(duì)肉毒毒素的破壞強(qiáng)度明顯低于腸內(nèi)容物原液的破壞強(qiáng)度，上清液與毒素作用后，剩余毒力基本為原毒素的1/4（表2）。

3. 3 高原鼠兔胃腸內(nèi)容物及離心上清液對(duì)毒素的影響

將肉毒毒素置于高原鼠兔胃腸內(nèi)容物中作用24 h后，發(fā)現(xiàn)溶液中D型肉毒毒素含量也有不同程度的降低，腸內(nèi)容物的毒素含量為原毒素的1/4，但胃腸內(nèi)容物經(jīng)離心后的上清液對(duì)肉毒毒素的破壞強(qiáng)度同樣低于腸內(nèi)容物原液的破壞強(qiáng)度，上清液與毒素作用后，剩余毒力基本為原毒素的1/2（表3）。

3. 4 高原鼢鼠胃腸內(nèi)容物及離心上清液對(duì)毒素的影響

將肉毒毒素置于高原鼠兔胃腸內(nèi)容物中作用24 h后，發(fā)現(xiàn)溶液中D型肉毒毒素含量均有不同程度的降低，尤其腸內(nèi)容物的毒素含量只有原毒素的1/8，但胃腸內(nèi)容物經(jīng)離心后的上清液對(duì)肉毒毒素的破壞強(qiáng)度明顯低于腸內(nèi)容物原液的破壞強(qiáng)度，上清液與毒素作用后，剩余毒力基本為原毒素的1/4（表4）。

4 討論與結(jié)論

國內(nèi)外已有很多關(guān)于肉毒毒素作用機(jī)制的報(bào)道，肉毒梭菌菌株培養(yǎng)液中肉毒神經(jīng)毒素主要是以前體毒素復(fù)合物的形式存在，前體復(fù)合物中的非毒素組分能夠保障神經(jīng)毒素不被消化道內(nèi)的各種酶分解破壞而失去活性。當(dāng)毒素通過消化系統(tǒng)進(jìn)入小腸后，內(nèi)部的微堿性環(huán)境可以引起毒素復(fù)合物的解離，部分神經(jīng)毒素可穿過小腸黏膜［5?6］，并通過血液和淋巴兩個(gè)體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)阻止神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的胞吐釋放，最終導(dǎo)致肌肉麻痹，引起動(dòng)物死亡。肉毒毒素作為一種細(xì)菌分泌毒素蛋白，同樣存在易失活、不穩(wěn)定的特性，使得口服蛋白的應(yīng)用增加了一定難度［7?8］，極大地限制了毒素蛋白在各領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示，3種害鼠胃腸內(nèi)容物對(duì)D型肉毒毒素的破壞作用由高到低依次為青海松田鼠、高原鼢鼠、高原鼠兔，且腸內(nèi)容物對(duì)毒素的破壞強(qiáng)度明顯高于胃內(nèi)容物。初步推斷不同害鼠對(duì)D型肉毒毒素敏感性差異的產(chǎn)生與害鼠體內(nèi)腸內(nèi)容物的破壞有一定相關(guān)性。該研究對(duì)今后選育腸道釋放型高效、特異性D型肉毒毒素生物滅鼠劑具有很好的指導(dǎo)意義。

D型肉毒滅鼠劑是利用D型肉毒梭菌所產(chǎn)毒素研制的生物滅鼠劑，自2005年開始大面積示范應(yīng)用以來，取得了良好的生態(tài)和社會(huì)效益［9?10］，然而，從本研究中不同害鼠對(duì)D型肉毒毒素的LD50分析看，其LD50及害鼠對(duì)藥物的敏感性明顯不同。有研究報(bào)道表明，由于保守的VAMP1 序列中的單個(gè)殘基變化（Q78V），已顯示出大鼠VAMP1（突觸小泡締合性膜蛋白）在體外對(duì)BoNT/B（肉毒神經(jīng)毒素）有抗性［11］，而人體內(nèi)VAMP1對(duì)BoNT/D顯示出一定的抗性，這是由于另一個(gè)殘基變化（M48I）導(dǎo)致的［12］。這些長期體外觀察的數(shù)據(jù)似乎與體內(nèi)毒性數(shù)據(jù)相關(guān)，因?yàn)殚L期以來一直觀察到大鼠對(duì)BoNT/B不敏感，LD50的中位數(shù)為小鼠的10 000倍［13］。

很多口服性小分子靶向藥物制劑在機(jī)體內(nèi)的生物利用度非常容易受到不同食物組成的影響，導(dǎo)致藥物效果出現(xiàn)明顯差異［14?15］。本研究通過胃腸內(nèi)容物對(duì)D型肉毒毒素的破壞強(qiáng)度分析得出，不同害鼠腸內(nèi)容物對(duì)D 型肉毒毒素蛋白均有一定程度的破壞，毒素在胃內(nèi)容物中作用24 h后，剩余毒素的有效毒力基本上在原毒素的50%以下；從研究結(jié)果對(duì)比分析可以看出：（1）離心后的胃腸內(nèi)容物上清液對(duì)毒素的破壞強(qiáng)度明顯低于胃腸內(nèi)容物的直接破壞強(qiáng)度；（2）青海松田鼠胃腸內(nèi)容物不論原液還是上清液對(duì)D型肉毒毒素的破壞強(qiáng)度明顯高于高原鼠兔和高原鼢鼠；（3）腸內(nèi)容物原液對(duì)D型肉毒毒素的破壞強(qiáng)度明顯比胃內(nèi)容物高。

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基金項(xiàng)目：青海省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2021-ZJ-923）