高濃度褪黑素對麝鼠香腺中FGF20 基因表達的影響

摘 要 麝鼠（Ondatra zibethicus）是一種具有較高經(jīng)濟價值的香料動物和毛皮動物。在一些毛皮動物生產(chǎn)中常使用褪黑素（melatonin，MT）來獲得更高的效益，但MT對麝鼠香腺發(fā)育的作用尚不清楚，為了探究高濃度MT對麝鼠香腺中FGF20 基因表達的影響，通過RT-qPCR技術(shù)檢測高濃度MT處理組與對照組麝鼠香腺中FGF20 基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示：FGF20 基因在對照組中的表達水平為高濃度MT處理組（每只麝鼠埋植1粒含有20 mg MT的埋植劑）的33. 95倍，二者差異極顯著（plt;0. 01）。由此推測，F(xiàn)GF20 基因參與了香腺發(fā)育的調(diào)控，并且高濃度的MT抑制了FGF20 基因的表達，研究結(jié)果可以為探究適量使用MT提高麝鼠的繁殖力和泌香產(chǎn)量提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：麝鼠；香腺；褪黑素；FGF20 基因

中圖分類號：Q959. 9；S865. 2+7 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：2310 - 1490（2024）- 02 - 0314 - 07

DOI：10.12375/ysdwxb.20240210

麝鼠（Ondatra zibethicus）又名麝香鼠、青根貂、水老鼠，是麝鼠屬（Ondatra）中的唯一成員，原產(chǎn)于北美洲，自引入國內(nèi)繁育后分布于多個省份。麝鼠具有較高的經(jīng)濟價值，其經(jīng)濟產(chǎn)品主要包括麝鼠香和毛皮兩大類。麝鼠香香氣沁人，留香持久，是高檔香水的優(yōu)良定香劑，同時具有抗炎鎮(zhèn)痛、強心活絡(luò)、開竅醒神和抑菌等作用，并有類似麝香的特殊香氣和功能，可以作為麝香的天然替代品［1?2］；其毛皮絨毛稠密、皮板結(jié)實、瀝水性和保暖性能良好，是上等的裘皮原料。麝鼠香腺的泌香周期呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化，處于繁殖期的雄性麝鼠香腺在2月開始發(fā)育，3月進入泌香期，4—5月為泌香盛期，6—8月為持續(xù)泌香期，9月到翌年2月為香腺萎縮期，其間腺體逐漸萎縮，最終被結(jié)締組織取代［3］。

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是一類能促進成纖維細胞或上皮細胞生長的蛋白質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)的FGF 超家族中共有23 個成員［4］，大多數(shù)FGFs［5］都能與幾種跨膜的酪氨酸激酶受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）特異性結(jié)合，從而啟動FGFR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（如PI3K-AKT、STAT、Shc/Frs-Raf/MAPKK 與K-MAPKK-MAPK）［6?8］，發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)功能。FGFs廣泛存在于人和動物體內(nèi)，參與機體代謝、器官發(fā)育、細胞分化和癌細胞增殖［9?14］等。

FGF20是FGF家族中的一員，與FGF9和FGF16同屬于FGF9 亞家族。FGF20 在形態(tài)發(fā)生、毛囊生長、組織修復(fù)和腫瘤發(fā)生等［15］過程中發(fā)揮重要作用。近期發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF20具有治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ缗两鹕。┑膽?yīng)用價值［16?18］以及促進小鼠的毛囊生長發(fā)育［19?20］等作用，有望成為治療帕金森病、促進毛囊再生等藥物的多效因子，并在FGFs領(lǐng)域的有關(guān)研究中逐漸受到重視。

埋植褪黑素（melatonin，MT）可以提高毛皮動物產(chǎn)絨量和絨質(zhì)、縮短毛皮成熟時間［21］，且在水貂、藍狐和絨山羊等經(jīng)濟動物生產(chǎn)中的運用已趨近成熟。外源MT對動物表觀形態(tài)形成及微觀分子調(diào)控的影響研究［22?23］是畜牧領(lǐng)域的研究熱點，關(guān)于MT對動物生殖發(fā)育相關(guān)機制的研究較為廣泛，但MT對麝鼠香腺及FGF20 基因表達的影響作用尚不明確。鑒于FGF20 在形態(tài)發(fā)生、細胞分化等方面的作用，推測FGF20 可能在麝鼠香腺周期性發(fā)育中發(fā)揮作用。本研究利用RT-qPCR 技術(shù)比較麝鼠FGF20 基因在高濃度MT處理香腺中的轉(zhuǎn)錄水平差異，探討高濃度MT對麝鼠香腺中FGF20 基因表達量可能的影響，為進一步發(fā)掘MT如何提高麝鼠經(jīng)濟價值的研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物

9月齡雄性麝鼠6只，購自哈爾濱市五常某麝鼠養(yǎng)殖場。

1. 2 樣品采集

2023年2月25日，根據(jù)體質(zhì)量、年齡和健康狀況選擇6只飼養(yǎng)條件相同、生長狀況相近的約9月齡雄性麝鼠，隨機平均分為2組，即MT處理組（n=3）與對照組（n=3）；處理組在每只麝鼠臀部皮下埋植1 粒（20 mg）MT埋植劑，對照組不埋植MT。麝鼠在飼養(yǎng)室內(nèi)分籠舍飼養(yǎng)，舍內(nèi)溫度比舍外氣溫稍高，當(dāng)氣溫超過32 ℃時對籠舍采取降溫措施；保證充足飲水，自由采食，及時清洗食槽和更換水池內(nèi)的水，飼養(yǎng)管理條件各組保持一致。5月10日，分別采集香腺，稱質(zhì)量，取樣時用液氮短暫凍存，于超低溫冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

將香腺組織放入盛有液氮的研缽中快速研磨，然后利用RNA 提取試劑盒（Thermo Scientific Gene?JET RNA Purification Kit #K0371）提取組織總RNA。經(jīng)純化柱洗脫得到RNA后，于超低溫冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩０凑誘aKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime?ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser RR047A，寶生物工程（大連）有限公司）說明書進行反轉(zhuǎn)錄。

1. 4 FGF20 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

利用NCBI 設(shè)計引物，內(nèi)參基因為β-肌動蛋白（β-actin）基因，引物均由哈爾濱睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

RT-qPCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 2 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，Mega Universal qPCR SYBRMaster Mix（Msunflowers）10 μL，最后用ddH2O 補足體系。每個cDNA 樣品均重復(fù)3 次。擴增條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)；退火時收集熒光信號。

1. 5 數(shù)據(jù)處理

RT-qPCR擴增后，用2-ΔΔCt法計算結(jié)果，具體為：樣品內(nèi)目的基因相對內(nèi)參基因的表達差異ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；2個組樣本表達差異ΔΔCt=ΔCt處理樣品-ΔCt對照樣品；倍數(shù)變化=2-ΔΔCt。

采用SPSS 26軟件中獨立樣本t 檢驗法比較兩組間差異，p≤0. 01為差異極顯著，p≤0. 05為差異顯著，αlt;0. 05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 香腺變化

麝鼠解剖后取香腺稱質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)對照組的香腺平均質(zhì)量明顯大于MT處理組（表2），且對照組的香腺外觀形態(tài)大于MT處理組（圖1），即高濃度MT處理組的麝鼠香腺比未處理的對照組質(zhì)量減輕、體積減小。

2. 2 RT-qPCR 結(jié)果

經(jīng)RT-qPCR檢測后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF20 基因擴增曲線經(jīng)歷了指數(shù)增長期、線性增長期和平臺期（圖2），熔解曲線波峰單一（圖3），未出現(xiàn)明顯非特異性擴增，說明FGF20 基因的引物及反應(yīng)條件都較好，可以進行下一步的分析。

RT-qPCR結(jié)果顯示，在麝鼠香腺中，對照組成纖維細胞生長因子FGF20 基因的相對表達量（33. 95）約為MT處理（1. 00）的33. 95倍，差異極顯著（plt;0. 01）。這說明高濃度MT處理抑制了FGF20 基因的表達。

3 討論

褪黑素是一種主要由動物松果體分泌的吲哚類激素，其合成與發(fā)揮生物學(xué)作用受光照時間、激素和年齡等因素影響。大多數(shù)哺乳動物MT在體內(nèi)的含量變化呈現(xiàn)夜間高于白晝的規(guī)律［24］，光照對松果體合成MT具有抑制作用，并隨著光照的節(jié)律變化而做出適應(yīng)環(huán)境的調(diào)控。MT在促進動物生殖協(xié)調(diào)［23］、免疫調(diào)節(jié)［25］和毛皮生長［26］等方面發(fā)揮重要作用。MT對于生殖系統(tǒng)的協(xié)調(diào)主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)促性腺激素和睪酮分泌，作用于HPG軸的相關(guān)環(huán)節(jié)，從而促進睪丸和其他性腺的成熟，同時MT還能清除自由基，防止由環(huán)境毒素或者炎癥導(dǎo)致的睪丸損傷［27］。

史建民等［28］對昆明白鼠在皮下埋植不同劑量（0、1、4、8 mg）的外源MT，發(fā)現(xiàn)4種濃度的MT都分別對雄鼠、雌鼠的體質(zhì)量增長有促進和抑制作用，且8 mg劑量組分別對雄鼠、雌鼠的促進和抑制作用顯著；在繁殖性能方面，4種劑量的MT均對雄鼠繁殖性能有抑制作用，其中1 mg和4 mg劑量組抑制作用顯著，但8 mg劑量組和對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異。崔羽皓等［29］發(fā)現(xiàn)在水貂頸部皮下埋植MT（18 mg）達到158 d 時，水貂睪丸的體積和質(zhì)量等指標(biāo)極顯著增加，達到發(fā)情期狀態(tài)；當(dāng)?shù)?48天時，水貂睪丸各項指標(biāo)均極顯著下降，睪丸呈現(xiàn)退化狀態(tài)。Lang等［30］對20 日齡的試驗組大鼠每天注射100 μg MT，在46日齡（達到性成熟日齡）時處死，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，其睪丸和精囊質(zhì)量顯著減少，血漿睪酮水平、促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）和垂體GnRH受體含量也顯著降低，抑制了雄性大鼠的性成熟，之后同一批從20日齡開始處理至70日齡或80日齡處死的大鼠則與對照組相比無明顯差異，即這種抑制的程度隨著性成熟推進而減輕，說明MT對性腺起促進作用還是抑制作用與動物年齡、種類、劑量和持續(xù)時間等因素有重要關(guān)聯(lián)。

麝鼠是季節(jié)性繁殖動物，其香腺在繁殖期發(fā)育并分泌香液，通過香味傳遞興奮信息，起到引誘雌鼠發(fā)情和標(biāo)記領(lǐng)地的作用，進入非繁殖期香腺逐漸萎縮消失，如此呈現(xiàn)發(fā)育與萎縮的重復(fù)交替性周期變化。曾有研究報道，麝鼠香腺與睪丸存在著協(xié)同發(fā)育的關(guān)系［31?33］，繁殖期睪丸體積明顯大于非繁殖期，可以推測MT和FGF20 基因在香腺發(fā)育和睪丸發(fā)育中起著相似的作用。

對本研究中處理組的每只麝鼠埋植1 粒含20 mg MT的埋植劑，類比其他研究對象的情況，此劑量為抑制生物學(xué)功能的劑量［34?36］，兩個半月后，采集香腺樣品。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，MT處理組麝鼠FGF20 基因在香腺中的轉(zhuǎn)錄水平低于對照組，且差異極顯著（plt;0. 01）。在自然條件下，5月上旬的麝鼠香腺應(yīng)發(fā)育成熟，香腺體積膨大并大量分泌麝鼠香，但在采集香腺稱質(zhì)量時發(fā)現(xiàn)MT處理組的香腺質(zhì)量和體積均小于對照組（表2，圖1）。由此推測麝鼠香腺發(fā)育受到了高濃度MT的抑制作用，F(xiàn)GF20 可能參與了麝鼠香腺發(fā)育的調(diào)控，且被高濃度MT抑制了表達。

徐學(xué)剛［19］利用免疫熒光染色技術(shù)檢測了不同濃度FGF20小鼠觸須毛囊培養(yǎng)液模型，證實FGF20可以促進毛囊生長，而且生長速度與FGF20劑量相關(guān)。除此之外，鑒于與FGFs特異性結(jié)合的酪氨酸激酶受體（FGFR）具有促進上皮和間質(zhì)細胞有絲分裂的功能［37］，成纖維細胞生長因子20（FGF20）-FGF受體1（FGFR1）在其他器官系統(tǒng)中，通過多種細胞內(nèi)途徑［38］發(fā)出信號，包括MAPK（ERK）、PI3K、磷脂酶C-γ（PLC-γ）和p38等，可以起到促進上皮細胞有絲分裂和分化的作用，因此推測FGF20能夠促進麝鼠香腺的發(fā)育。

MAPK和PI3K都是耳蝸毛細胞（HC）和支持細胞（SC）分化過程中FGF20-FGFR1信號傳導(dǎo)的重要下游介質(zhì)，即FGFR1信號傳導(dǎo)對于耳蝸毛細胞和支持細胞分化至關(guān)重要［39］。PI3K活性的降低抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶的活化，從而影響PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［40］。因此推測高濃度MT抑制了PI3K的上游介質(zhì)——FGF20 基因在香腺泌香盛期的表達，通過減少上游介質(zhì)阻斷了流向PI3K/AKT的信號，從而抑制香腺囊上皮細胞的增殖生長。

綜上所述，本研究通過FGF20 基因的轉(zhuǎn)錄水平分析，比較了MT處理組與對照組在香腺中此因子的表達差異，表明其可能參與了香腺發(fā)育，并且高濃度的MT 持續(xù)作用可能抑制了FGF20 的表達，說明FGF20 基因在麝鼠香腺發(fā)育和泌香中起到重要的調(diào)控作用，可以為探究使用適量MT提高麝鼠的繁殖力和泌香產(chǎn)量提供依據(jù)，但其詳細機制還需要進一步驗證。

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基金項目：國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（202310225293）