基于肝臟轉(zhuǎn)錄組測序?qū)Σ煌０蜗柴R拉雅旱獺的低氧適應(yīng)性研究

摘 要 為探究低、中、高3個(gè)不同海拔梯度下喜馬拉雅旱獺（Marmota himalayana）基因表達(dá)是否存在差異，篩選該物種與高原低氧及強(qiáng)紫外輻射環(huán)境適應(yīng)的相關(guān)候選基因，采用Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺對喜馬拉雅旱獺肝臟組織進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，通過對質(zhì)控后測序數(shù)據(jù)與參考基因組的比較分析，篩選差異表達(dá)基因后進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析。結(jié)果顯示：樂都樣品（低海拔組，LD）、玉樹樣品（高海拔組，YS）喜馬拉雅旱獺肝臟組織中差異表達(dá)基因差異較大，剛察樣品（中海拔組，GC）與其他兩組間均具有較小的基因表達(dá)差異模式。上調(diào)表達(dá)基因在19個(gè)GO Terms和6個(gè)KEGG通路上有顯著富集，氧化磷酸化相關(guān)基因（HiF-1α、MPKA3）、礦物質(zhì)吸收及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因（PPARs）在高海拔組中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，推測這些基因可能直接或間接在喜馬拉雅旱獺適應(yīng)高海拔低氧等極端環(huán)境中，通過調(diào)整細(xì)胞代謝、提高氧化還原能力以及增強(qiáng)免疫反應(yīng)來維持自身的生理功能和生存能力，為后續(xù)深入研究高原野生動物基因多樣性以及喜馬拉雅旱獺低氧適應(yīng)性提供基因組學(xué)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：喜馬拉雅旱獺；低氧適應(yīng)性；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；肝臟

中圖分類號：Q953 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2310 - 1490（2024）- 02 - 0305 - 09

DOI：10.12375/ysdwxb.20240209

喜馬拉雅旱獺（Marmota himalayana）隸屬于哺乳綱（Mammalia）嚙齒目（Rodentia）松鼠科（Sciuri?dae）旱獺屬（Marmota）。目前，世界范圍內(nèi)有2個(gè)亞種，分別是指名亞種（M. h. himalayana）和川西亞種（M. h. rubustus），指名亞種主要分布在我國甘肅西部、青海（柴達(dá)木盆地）及新疆等地，川西亞種主要分布在我國四川西部和西北部等地［1］。作為青藏高原特有野生動物資源，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用［2］。

2012年，王忠東［3］首次通過旱獺活體肝臟穿刺術(shù)，成功建立實(shí)驗(yàn)技術(shù)與室內(nèi)飼養(yǎng)管理技術(shù)，隨后，劉海青等［4］成功采用人工批量化繁育技術(shù)并建立人工繁育種群，為后續(xù)喜馬拉雅旱獺實(shí)驗(yàn)動物化研究的開展提供基礎(chǔ)技術(shù)支持。研究人員通過觀測并分析該物種骨骼?。?］與心?。?］等組織學(xué)相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過長期的自然選擇和進(jìn)化，喜馬拉雅旱獺在高原環(huán)境中表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，獲得適應(yīng)低氧環(huán)境且穩(wěn)定遺傳的生物學(xué)特性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，李優(yōu)等［7］利用dd-RAD基因組學(xué)測序技術(shù)對青海省44例喜馬拉雅旱獺進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，揭示不同地區(qū)喜馬拉雅旱獺種群之間存在遺傳差異。盡管線粒體基因組在研究物種進(jìn)化和親緣關(guān)系等方面發(fā)揮了重要作用，但無法提供整體基因組完整信息［8］。

現(xiàn)有喜馬拉雅旱獺相關(guān)研究大多集中于傳染病學(xué)及生物學(xué)等方面，包括病原體鑒定［9］、疾病傳播途徑［10］及遺傳進(jìn)化差異［7］等。隨著深度測序的市場化，RNA測序（RNA-Seq）利用高通量測序平臺更精準(zhǔn)全面地探索特定生物在特定條件下的基因表達(dá)和生物代謝，具有低成本、全面及高準(zhǔn)確度的優(yōu)勢，現(xiàn)已成為探究物種進(jìn)化調(diào)控機(jī)制的重要技術(shù)手段［11］，然而目前對不同海拔下喜馬拉雅旱獺適應(yīng)低氧的調(diào)控機(jī)制及整體性分析研究尚不深入。本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)，通過對3個(gè)不同海拔梯度下的喜馬拉雅旱獺肝臟組織進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，初步篩選出喜馬拉雅旱獺與低氧適應(yīng)有關(guān)的候選基因，為進(jìn)一步挖掘高原土著動物低氧適應(yīng)機(jī)制及相關(guān)功能基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 樣本采集

在海東市樂都區(qū)引勝鄉(xiāng)［海拔1 992 m；36°35' N，102°24' E；3例；記為低海拔組（LD組）］、海北藏族自治州剛察縣［海拔3 127 m；35°29' N，102°16' E；3例；記為中海拔組（GC組）］和玉樹州曲麻萊縣麻多鄉(xiāng)［海拔4 101 m；35°1' N，96°22' E；3例；記為高海拔組（YS組）］3個(gè)地區(qū)采集喜馬拉雅旱獺新鮮肝臟組織，共9例（圖1），分別裝入2 mL凍存管內(nèi)（n=3），液氮速凍后按照分組標(biāo)記，置于冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆?。取樣過程與青海省地方病預(yù)防控制所合作，遵循動物倫理相關(guān)法規(guī)（PJ20230306）。

1. 2 RNA 提取與質(zhì)控

使用TRIzol法提取喜馬拉雅旱獺肝臟組織中的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳初步分析RNA降解及污染程度，采用Agilent 2100生物分析儀與NanoDrop設(shè)備檢測RNA 的完整性（RNA integrity number，RIN）及純度。建庫要求為動物組織樣本不得少于250 mg，OD260/280為1. 8～2. 2，RIN值≥7，28S∶18S≥7。

1. 3 文庫構(gòu)建與基礎(chǔ)分析

利用Oligo（dT）磁珠富集法富集mRNA，使用Ragmentation Buffer 隨機(jī)打斷mRNA，通過AMPureXP beads 純化PCR 產(chǎn)物后，構(gòu)建cDNA 文庫。采用Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺同時(shí)進(jìn)行合成與測序。測序原始數(shù)據(jù)（raw reads）經(jīng)過濾后得到優(yōu)質(zhì)測序數(shù)據(jù)（clean reads）。使用Trinity軟件對cleanreads 進(jìn)行拼接，得到Unigenes 轉(zhuǎn)錄本，獲取后續(xù)分析參考序列。

1. 4 差異表達(dá)基因分析

采用DESeq2（1. 6. 3）軟件篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），顯著差異表達(dá)閾值為plt;0. 05且 | log2FoldChange | 值大于1。為分析差異表達(dá)基因的功能特性和參與的生理生化代謝途徑，對DEGs進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析，展現(xiàn)3組喜馬拉雅旱獺種群間差異表達(dá)基因序列在兩數(shù)據(jù)庫中的分布狀況，在DEGs中顯著富集的閾值（q）不超過0. 05。所有統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS 18. 0軟件進(jìn)行，使用兩兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較，同時(shí)用GraphPad Prism 8. 0 軟件繪圖，plt;0. 05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA 質(zhì)檢結(jié)果

從LD組、GC組及YS組喜馬拉雅旱獺肝臟組織中提取的總RNA無DNA等雜質(zhì)污染，純度（OD260/280為2. 02～2. 08，OD260/230 為2. 33～2. 35）、濃度（545. 9～584. 1 ng/μL）和檢測的RIN 值（8. 8～9. 6）滿足建庫及測序要求。

2. 2 功能注釋分析

質(zhì)控后轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)總量為20. 38 Gb，Q20≥96. 45%，GC 比例介于47. 63%～48. 20%，堿基錯(cuò)誤率低，數(shù)據(jù)質(zhì)量合格，表明測序數(shù)據(jù)整體質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析（表1）。將質(zhì)控后數(shù)據(jù)與NT、NR、KO、PFAM、KOG和Swiss Prot 六個(gè)數(shù)據(jù)庫比對，統(tǒng)計(jì)各數(shù)據(jù)庫占比情況并可視化處理（圖2），注釋結(jié)果表明：NT數(shù)據(jù)庫注釋信息較為豐富，轉(zhuǎn)錄本平均占比最高，KOG數(shù)據(jù)庫信息匹配率較低，轉(zhuǎn)錄本平均占比最低。

2. 3 差異表達(dá)基因的篩選及聚類分析

對LD、GC、YS兩兩組間交集差異表達(dá)基因關(guān)聯(lián)后，將信息整合繪制Venn圖（圖3），其中3組共表達(dá)基因有991個(gè)。對DEGs進(jìn)行表達(dá)模式聚類分析（圖4），發(fā)現(xiàn)LD、YS組喜馬拉雅旱獺的表達(dá)模式區(qū)別顯著，推測是相鄰海拔梯度間環(huán)境氧含量變化程度較為溫和所致。

2. 4 差異表達(dá)基因的GO 富集分析

將喜馬拉雅旱獺差異表達(dá)基因與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，差異基因注釋結(jié)果被分為生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）及分子功能（MF）三大功能類別，主要顯著富集在外切脫氧核酸酶Ⅶ復(fù)合物部分DNA降解、DNA修飾、芳香氨基酸家族代謝和賴氨酸代謝、脫氧核糖核酸酶以及結(jié)合血紅素部分活性等生物學(xué)過程（圖5）。

上調(diào)差異表達(dá)基因主要富集在線粒體電子傳遞（GO：0006120）、礦物質(zhì)吸收（GO：0055072）以及DNA降解（GO：0006308）等生物學(xué)過程，表明機(jī)體通過上調(diào)線粒體電子傳遞鏈的活性，增加線粒體數(shù)量來維持低氧環(huán)境下HIF-1α 基因的穩(wěn)定，以優(yōu)化氧氣的吸收和運(yùn)輸能力，從而更有效地利用有限的氧氣資源，保持正常的能量代謝。下調(diào)基因顯著富集在分子功能（MF）分類中，主要是DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（GO：0006355）、小GTP酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（GO：0007264）、DNA定向DNA聚合酶活性（GO：0003887）以及DNA結(jié)合（GO：0003677）等方面，說明可能在低氧低壓條件下機(jī)體通過抑制DNA損傷過程，以及下調(diào)小GTP活性狀態(tài)降低高原環(huán)境中喜馬拉雅旱獺的一些基因表達(dá)以及生理代謝過程（表2）。

2. 5 差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析

為探究差異基因參與影響的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或生物學(xué)功能，進(jìn)行KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集在乙酰乙酸和二羧酸代謝通路，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的降解代謝，胰島素信號通路，真核生物中核糖體生物合成等通路（圖6）。

3 討論

青藏高原的低氧環(huán)境對本土動物施加選擇壓力，使其在分子水平上表現(xiàn)出趨同進(jìn)化等遺傳特性，在長期低氧及強(qiáng)紫外輻射等極端氣候環(huán)境中，高原土著動物形成穩(wěn)定可遺傳的適應(yīng)性機(jī)制［12］。KEGG通路富集分析表明，不同海拔梯度下喜馬拉雅旱獺差異表達(dá)基因顯著富集在氧化磷酸化（ko00190）、細(xì)胞周期（ko04110）、鐵調(diào)控信號通路（ko04927）、PI3K-Akt 信號通路（ko04151）、脂質(zhì)代謝（ko00061）以及細(xì)胞凋亡（ko04210）等通路（表3）。

線粒體作為“能量工廠”為機(jī)體提供ATP，支撐高原哺乳動物的正常生命活動，能量產(chǎn)生方式主要依賴于氧化磷酸化及三羧酸循環(huán)［13］。文禹粱［14］在藏綿羊?qū)嶒?yàn)中發(fā)現(xiàn)，氧化磷酸化的上調(diào)表達(dá)可維持藏綿羊日常生理需求使機(jī)體表現(xiàn)出低氧適應(yīng)性。HIF-1α 作為缺氧時(shí)下游基因的主要激活因子，通過調(diào)控多個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性并上調(diào)表達(dá)增加機(jī)體對ATP的依賴性，形成低氧適應(yīng)性機(jī)制［15］，在藏綿羊［16］、藏雞［17］等高原土著動物的研究中該基因均受到正選擇影響。此外，研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路和PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等與低氧適應(yīng)有關(guān)聯(lián)的通路顯著富集。細(xì)胞通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路響應(yīng)外部刺激，參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)反應(yīng)［18］。PI3K-Akt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要細(xì)胞內(nèi)信號通路，具有在缺氧條件下保護(hù)機(jī)體免受細(xì)胞凋亡影響的作用［19］。張倩等［20］在牦牛大腦皮質(zhì)組織轉(zhuǎn)錄學(xué)研究中證明，MAPK 信號通路和PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)低氧適應(yīng)機(jī)制的形成。青藏地區(qū)氧氣稀薄且海拔較高，大氣層厚度變薄，對入射輻射的吸收和散射能力減弱［21］，Song等［22］研究表明，高原土著生物通過修復(fù)基因的高表達(dá)，消除紫外誘導(dǎo)下DNA損傷等不良反應(yīng)，獲得強(qiáng)紫外輻射適應(yīng)性優(yōu)勢。

綜上，本研究利用RNA-Seq技術(shù)對LD、GC和YS三組不同海拔梯度下喜馬拉雅旱獺肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，檢測出大量與能量代謝及細(xì)胞維穩(wěn)相關(guān)的DEGs，KEGG富集分析結(jié)果表明這些基因主要富集在氧化磷酸化、DNA損傷感應(yīng)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及PI3K-Akt等途徑，GO注釋分析中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，這可能提示成年喜馬拉雅旱獺通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激、維護(hù)細(xì)胞基因組穩(wěn)定性等生理機(jī)制維持自身穩(wěn)定，獲得高原環(huán)境適應(yīng)優(yōu)勢。以上結(jié)果有助于更好地理解喜馬拉雅旱獺在高海拔環(huán)境中的適應(yīng)生存策略，進(jìn)一步對研究高原生物適應(yīng)性機(jī)制提供更多的參考，為高原野生動物基因多樣性的保護(hù)和管理奠定基礎(chǔ)。

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