我國(guó)圈養(yǎng)和野生東北虎種群線粒體基因組遺傳多樣性的比較研究

摘要 東北虎（Panthera tigris altaica）是體型最大的貓科（Felidae）動(dòng)物之一，是極具代表性的珍稀野生動(dòng)物?，F(xiàn)有研究表明，我國(guó)野生東北虎種群遺傳多樣性較低、近交水平較高。盡管目前我國(guó)野生東北虎的數(shù)量在逐步增長(zhǎng)，但通過(guò)人工干預(yù)來(lái)提高野生東北虎的遺傳多樣性會(huì)更利于其數(shù)量的恢復(fù)，通過(guò)野化放歸進(jìn)行遺傳拯救是一種關(guān)鍵策略，但實(shí)施遺傳拯救之前，必須確定圈養(yǎng)個(gè)體與現(xiàn)存野生個(gè)體間的遺傳關(guān)系。采用糞便DNA的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)組裝了51只橫道河子圈養(yǎng)東北虎和13只完達(dá)山、老爺嶺等地的野生東北虎的線粒體基因組，分析兩者之間的關(guān)系，評(píng)估線粒體基因組的遺傳多樣性。結(jié)果表明：圈養(yǎng)東北虎的遺傳多樣性高于野生種群，所有遺傳變異均為無(wú)害。部分圈養(yǎng)個(gè)體與野生種群同屬一個(gè)進(jìn)化支，且具有野生種群所不包含的遺傳變異，可用于實(shí)施遺傳拯救。此外，圈養(yǎng)種群存在顯著的遺傳分化，一個(gè)與當(dāng)前野生種群關(guān)系很遠(yuǎn)的分支可能代表未知的地理種群，因此，建議對(duì)該遠(yuǎn)緣分支開(kāi)展野外來(lái)源的追溯，確定其譜系地理學(xué)地位和保護(hù)價(jià)值，使其成為恢復(fù)野外歷史遺傳多樣性的后備資源。

關(guān)鍵詞：東北虎；遺傳拯救；線粒體基因組；糞便DNA；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：Q953 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 02 - 0231 - 11

DOI：10.12375/ysdwxb.20240201

東北虎（Panthera tigris altaica）在維持東北亞森林生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性和完整性中扮演著重要角色。人口的增長(zhǎng)和人類活動(dòng)的日益增強(qiáng)、擴(kuò)展，導(dǎo)致野生東北虎的棲息地遭到嚴(yán)重破壞［1］，使之持續(xù)縮小和破碎化［2］，嚴(yán)重影響了野生東北虎的生存。此外，氣候變化和環(huán)境污染等直接或間接造成的獵物數(shù)量下降，也給東北虎的生存帶來(lái)了很大挑戰(zhàn)［3］。因此，東北虎與其他虎亞種一起在國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟紅色名錄（IUCN Red List）中被列為瀕危級(jí)（EN），同時(shí)被瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約（CITES）列為附錄Ⅰ物種。

目前我國(guó)境內(nèi)野生東北虎包括4個(gè)相互隔離的小種群［4］，各個(gè)小種群之間缺乏可用的生態(tài)廊道，無(wú)法進(jìn)行自然的基因交流，發(fā)生了較為嚴(yán)重的近交，導(dǎo)致野生東北虎種群遺傳多樣性較低［5］。遺傳多樣性對(duì)于野生動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境、抵御疾病等都具有極為重要的意義［6?7］。當(dāng)小種群無(wú)法自我維持遺傳多樣性時(shí)，就需要通過(guò)人工輔助引入外源基因來(lái)提高遺傳多樣性，這被稱為遺傳拯救［8］。目前野生東北虎的處境需要開(kāi)展人工輔助基因交流：一方面，通過(guò)建設(shè)生態(tài)廊道使不同種群之間得以自然交流［9］；另一方面，將人工繁育的東北虎野化放歸，參與野生種群的繁殖，達(dá)到提升遺傳多樣性的目的［10］。野化放歸的策略首先要基于充分的遺傳學(xué)分析，從圈養(yǎng)種群中選擇與野生種群同屬一個(gè)進(jìn)化分支且能提高野生種群遺傳多樣性的個(gè)體，進(jìn)行野化訓(xùn)練并放歸。在提高遺傳多樣性的同時(shí)應(yīng)當(dāng)權(quán)衡遺傳拯救的收益和風(fēng)險(xiǎn)，既要避免遠(yuǎn)交衰退的產(chǎn)生還要避免有害基因的引入。本研究所考察的圈養(yǎng)種群來(lái)自國(guó)家東北虎種源基地橫道河子貓科動(dòng)物飼養(yǎng)繁育中心，該基地先后從多國(guó)引進(jìn)東北虎種源，目前已飼養(yǎng)超過(guò)1 000只東北虎，這一龐大的數(shù)量足以支撐野化放歸項(xiàng)目。本研究利用東北虎糞便提取DNA，并通過(guò)高通量測(cè)序獲取東北虎線粒體全基因組，用于圈養(yǎng)種群與野生種群遺傳多樣性評(píng)估和遺傳關(guān)系的比較，從母系遺傳層面為圈養(yǎng)東北虎野化放歸個(gè)體的遴選提供支持。

1 材料與方法

1. 1 糞便采集與DNA 提取

共采集64份東北虎糞便樣品，包括來(lái)自中國(guó)橫道河子貓科動(dòng)物飼養(yǎng)繁育中心的51只圈養(yǎng)東北虎和13只完達(dá)山、老爺嶺等地的野生東北虎。13個(gè)野生東北虎的糞便樣本分別取自吉林省琿春市（8個(gè)）、黑龍江省鶴崗市蘿北縣（2 個(gè)）、吉林省敦化市（1 個(gè)）、吉林省舒蘭市（1 個(gè)）和黑龍江省東寧市（1個(gè)）［11］。野生東北虎的糞便樣本均通過(guò)擴(kuò)增線粒體的一個(gè)271 bp的細(xì)胞色素b 基因片段進(jìn)行物種確認(rèn)；并選擇18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行基因分析和個(gè)體鑒定［5］。采用本團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建的糞便DNA富集方法（periextractionenrichment using SDS，PEERS，專利號(hào)：CN113186185A）對(duì)糞便進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)向糞便溶解液中加入終濃度為5% 的SDS，破壞東北虎的細(xì)胞，同時(shí)保持微生物的完整性，從而優(yōu)先釋放東北虎的DNA。離心后采用Axygen Multisource GenomicDNA（Axygen，美國(guó)）試劑盒提取上清液DNA，即得到富集的東北虎總DNA。

1. 2 DNA 質(zhì)檢

獲得的糞便DNA中只有宿主DNA占比足夠高才適合進(jìn)行高通量測(cè)序。因此，分別以東北虎核基因GAPDH（nuDNA，NCBI序列號(hào)：NC056666. 1）和線粒體基因Cyt b（mtDNA，NCBI序列號(hào)：KF297576. 1）為模板，設(shè)計(jì)定量PCR引物，用于測(cè)定總DNA中二者的拷貝數(shù)；同時(shí)在細(xì)菌的16S rRNA 基因上設(shè)計(jì)1 對(duì)通用引物，用于測(cè)定細(xì)菌DNA（bDNA）的拷貝數(shù)。當(dāng)mtDNA 與bDNA 的CT 值差值小于3、bDNA的CT值大于10、nuDNA的CT值小于25時(shí)用于高通量測(cè)序（表1）。

熒光定量PCR體系10. 0 μL：1. 0 μL DNA提取液，5. 0 μL TB Green Premix ExTaq Ⅱ酶（TaKaRa，大連），濃度為10 μmol/L 的上、下游引物各0. 4 μL和ddH2O 3. 2 μL。三對(duì)引物采用相同的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s+65 ℃退火5 s+95 ℃延伸15 s。利用9700 型PCR 擴(kuò)增儀（Gene?Amp，美國(guó)）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

1. 3 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

合格的DNA在MGISEQ-2000測(cè)序平臺(tái)（華大智造，中國(guó)）進(jìn)行高通量測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)使用FastQC進(jìn)行可視化質(zhì)量查驗(yàn)；使用Trimmomatic去除低質(zhì)量序列和接頭；用BWA（Burrow-Wheeler Aligner）完成線粒體數(shù)據(jù)的比對(duì)；用SAMtools 將測(cè)序數(shù)據(jù)中的read排序整齊，并用GATK去除重復(fù)序列，計(jì)算測(cè)序覆蓋度與測(cè)序深度。

1. 4 線粒體組裝與遺傳多樣性分析

使用NOVOPlasty 將整理后的序列組裝成完整的mtDNA基因組。組裝好的mtDNA用MAFFT進(jìn)行序列比對(duì)，提取線粒體的D-loop區(qū)、2個(gè)編碼核糖體核酸的基因（12S rRNA和16S rRNA）和13個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，用于不同區(qū)域的分析。使用DnaSP6計(jì)算核苷酸多樣性（Pi ）與單倍型多樣性（Hd），并使用POPART繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)。用VCFtools計(jì)算遺傳分化系數(shù)（FST），基于最大似然法（ML）構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)和遺傳距離的計(jì)算由MEGA 11完成。

1. 5 注釋突變位點(diǎn)

選用東北虎線粒體全基因組（NCBI 序列號(hào)：KF297576. 1）作為參考序列，使用GATK完成SNP位點(diǎn)的檢測(cè)和篩選，檢測(cè)得到的SNP 位點(diǎn)使用軟件ANNOVAR 進(jìn)行注釋和分析。在ANNOVAR 中的grantham. matrix 矩陣下，對(duì)所有突變進(jìn)行Grantham評(píng)分，評(píng)估突變是否有害。評(píng)估主要基于氨基酸的物理/化學(xué)組成，一般認(rèn)為，Grantham評(píng)分≥150的突變是有害的，評(píng)分lt;150的突變是良性的。

2 結(jié)果

2. 1 糞便DNA 質(zhì)量與測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

所有糞便DNA 的質(zhì)量濃度都分布在12. 5～47. 0 ng/μL，均滿足高通量測(cè)序要求。測(cè)序數(shù)據(jù)中質(zhì)量達(dá)到Q20的堿基在95％以上，且堿基質(zhì)量平均值波動(dòng)較小，表明測(cè)序質(zhì)量足夠高。堿基分離程度均勻，序列中GC含量的實(shí)際分布與理論分布接近。平均測(cè)序覆蓋度均為100%，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

2. 2 組裝線粒體基因組

所有個(gè)體的mtDNA均被完整組裝，其中D-loop區(qū)中POLYC片段的長(zhǎng)度在個(gè)體間變化較大，具體數(shù)目無(wú)法通過(guò)read比對(duì)來(lái)確定，屬于測(cè)量不精準(zhǔn)區(qū)域，故取所有個(gè)體中最短的長(zhǎng)度作為POLYC片段的長(zhǎng)度，因而D-loop區(qū)的長(zhǎng)度為1 180 bp，線粒體基因總長(zhǎng)度為16 629 bp。其他各個(gè)基因區(qū)段均未見(jiàn)插入和缺失的堿基（表2）。

2. 3 核苷酸多樣性與單倍型多樣性

在64只東北虎的線粒體基因組中共鑒定到41個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和9種單倍型。圈養(yǎng)東北虎的多態(tài)位點(diǎn)為39個(gè)，其中單次突變位點(diǎn)1個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)38個(gè)。野生東北虎的多態(tài)位點(diǎn)為3個(gè)，全部是簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。圈養(yǎng)和野生東北虎單倍型數(shù)量分別為7、2種，二者之間不存在共享單倍型。圈養(yǎng)種群和野生種群的單倍型多樣性分別為0. 711和0. 385，核苷酸多樣性分別為0. 001 05和0. 000 07。對(duì)于所有樣本，單倍型多樣性為0. 793，核苷酸多樣性為0. 001 14?？傮w而言，圈養(yǎng)種群的核苷酸多樣性和單倍型多樣性要遠(yuǎn)高于野生種群的多樣性（表3）。

基于線粒體全基因序列，分別繪制圈養(yǎng)個(gè)體、野生個(gè)體和全部個(gè)體的核苷酸多樣性分布圖（圖1）?？傮w來(lái)看，線粒體基因組上核苷酸多樣性的分布以圈養(yǎng)種群為主導(dǎo)（圖1A）；圈養(yǎng)種群的核苷酸多樣性（圖1B）要遠(yuǎn)高于野生種群（圖1C），但在不同區(qū)域間，二者核苷酸多樣性差異較大，圈養(yǎng)虎在堿基序號(hào)4 900～8 600、10 300～13 200和13 600～16 000三個(gè)區(qū)域較高（圖1B），而野生虎主要表現(xiàn)在2 100～2 500、8 700～9 100和15 100～15 500三個(gè)區(qū)域（圖1C）。

為了進(jìn)一步分析線粒體基因組上不同功能區(qū)域的多樣性水平，將線粒體基因組分成6個(gè)功能區(qū)：ND編碼區(qū)、ATP編碼區(qū)、COX編碼區(qū)、Cyt b 編碼區(qū)、D-loop 區(qū)和rRNA 編碼區(qū)。各個(gè)區(qū)域的長(zhǎng)度為其所包含的基因長(zhǎng)度之和，其中ND4L 基因與ND4 基因存在7 個(gè)重疊堿基，ND5 基因與ND6 基因存在17個(gè)重疊堿基，ATP8 基因與ATP6 基因存在43個(gè)重疊堿基，故ND區(qū)與ATP區(qū)的長(zhǎng)度分別為6 345 bp與842 bp。

圈養(yǎng)種群的Cyt b 基因具有最高的核苷酸多樣性（0. 002 04）；rRNA 編碼區(qū)的核苷酸多樣性最低（0. 000 55）；D-loop 區(qū)的單倍型多樣性最高，達(dá)到0. 623；編碼細(xì)胞色素C氧化酶的COX區(qū)和Cyt b 基因的單倍型多樣性最低，均為0. 466。野生種群中D-loop 控制區(qū)的核苷酸多樣性和單倍型多樣性最高，分別為0. 000 40 和0. 462；而編碼NADH 脫氫酶的ND區(qū)與編碼ATP合成酶的ATP區(qū)核苷酸多樣性和單倍型多樣性均為0，表現(xiàn)出極低的多樣性（表4）。

圈養(yǎng)種群和野生種群共檢測(cè)到9種單倍型（表5）?；趩伪缎托蛄欣L制的單倍型網(wǎng)絡(luò)顯示，東北虎的單倍型可以分為兩個(gè)大組，一組由Hap_2 和Hap_3組成，另一組由其他單倍型組成（圖2）。兩組之間的核苷酸差異遠(yuǎn)大于組內(nèi)，遺傳分化系數(shù)（FST）為0. 061。野生種群的單倍型全部包含在第2組中，且與圈養(yǎng)種群?jiǎn)伪缎偷牟町愔挥?或2個(gè)核苷酸。單倍型的分化主要發(fā)生在圈養(yǎng)種群中。

2. 4 野生和圈養(yǎng)東北虎的母系遺傳關(guān)系

9種單倍型之間的Nei氏遺傳距離在0. 000 06～0. 002 35，平均為0. 000 76。其中，Hap_3 與Hap_9的遺傳距離最大，為0. 002 35；Hap_1 與Hap_4、Hap_7、Hap_8，Hap_2 與Hap_3，Hap_5 與Hap_4、Hap_7，Hap_6與Hap_8之間的遺傳距離最小，均為0. 000 06。圈養(yǎng)種群與野生種群?jiǎn)伪缎虷ap_8遺傳距離最近的為單倍型Hap_1和Hap_6，最遠(yuǎn)的單倍型為Hap_3；與野生單倍型Hap_9遺傳距離最近的為Hap_1，最遠(yuǎn)的為Hap_3（表6）。

以家貓（Felis catus）、華南虎（Panthera tigrisamoyensis）、虎指名亞種（P. t. tigris）為外群，在東北虎個(gè)體的線粒體全基因構(gòu)建的ML進(jìn)化樹(shù)上，外群均位于東北虎的外側(cè)，說(shuō)明該系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)構(gòu)正確。東北虎分為兩個(gè)大的分支，其中攜帶Hap_2與Hap_3的個(gè)體聚為第1個(gè)分支，其他個(gè)體聚為第2個(gè)分支。在第2個(gè)分支中，攜帶Hap_8的野生個(gè)體與攜帶Hap_6的圈養(yǎng)個(gè)體聚為一個(gè)小支，攜帶Hap_9的野生個(gè)體與攜帶Hap_1的圈養(yǎng)個(gè)體聚為一個(gè)小支（圖3）。這表明所研究的野生個(gè)體與圈養(yǎng)個(gè)體之間存在很近的進(jìn)化關(guān)系，這一進(jìn)化關(guān)系完全印證了單倍型網(wǎng)絡(luò)與遺傳距離計(jì)算的結(jié)果。

2. 5 線粒體基因組突變的有害性

以東北虎線粒體基因組（NCBI序列號(hào)：KF297576. 1）為參照，64 只個(gè)體共篩選得到493 個(gè)SNP 位點(diǎn)。493 個(gè)SNP 位點(diǎn)的Grantham 評(píng)分最大值為34. 67，最小值為2. 00，意味著所有突變均為非有害突變（ 圖4）。

3 討論

3. 1 糞便DNA 在線粒體基因組重測(cè)序中的可用性

線粒體DNA可以反映母系的遺傳變異［12］，由于其具有高拷貝、高突變率的特點(diǎn)［13］，被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育和地理學(xué)［14］、群體遺傳學(xué)［15］及醫(yī)學(xué)研究［16］。糞便是較易獲得的非損傷性材料，可從中獲得DNA用于分子生態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)分析［17?18］。但是，糞便中含有極其豐富的微生物和少量的宿主腸上皮細(xì)胞［19］，其DNA的質(zhì)量和可用性受到宿主消化能力、攝入食物、DNA 降解程度和糞便采集時(shí)機(jī)等影響［20?21］，因此從糞便中獲取高質(zhì)量的宿主DNA始終是個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，好在糞便DNA中的mtDNA拷貝數(shù)高于核DNA，通過(guò)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)更容易實(shí)現(xiàn)基因組的組裝［22］。本研究進(jìn)行了有益的嘗試，從所有樣品的糞便DNA測(cè)序數(shù)據(jù)中成功組裝了完整的線粒體基因組，且平均覆蓋度均達(dá)到100%，達(dá)到了血液等高通量材料組裝的效果［23］。

日后可憑借本試驗(yàn)的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)以及組裝成功的完整線粒體基因組開(kāi)展后續(xù)分析，這相較于傳統(tǒng)的局部片段或某一基因的分析更加全面、信息量更大［23?24］。本研究的DNA提取、質(zhì)檢、測(cè)序和線粒體基因組的組裝方法等可為將來(lái)其他物種基于糞便的研究提供一定經(jīng)驗(yàn)。

3. 2 圈養(yǎng)和野生東北虎的線粒體基因組多樣性

我國(guó)動(dòng)物園飼養(yǎng)東北虎的歷史可以追溯到新中國(guó)成立初期，如1952—1959年，哈爾濱動(dòng)物園共收幼虎99只，平均每年12只［25］。彼時(shí)我國(guó)的東北虎數(shù)量較多，圈養(yǎng)種群的初始建群者來(lái)源廣泛，遺傳多樣性較高［25］。本研究所考察的橫道河子貓科動(dòng)物飼養(yǎng)繁育中心的種群來(lái)源廣泛，先后從多個(gè)國(guó)家及國(guó)內(nèi)動(dòng)物園引進(jìn)種源，因此推測(cè)這一種群攜帶的遺傳多樣性較高。Ning等［5］的研究表明，當(dāng)前的東北虎野生種群已經(jīng)處于中等近交水平，局部近交和遺傳漂變使其原有的遺傳多樣性在一定程度上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

除此之外，還有研究表明，野生東北虎種群的遺傳多樣性較低。2003 年，Russello 等［26］在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)對(duì)來(lái)自至少27只個(gè)體的82個(gè)野生東北虎糞便樣本進(jìn)行分析，結(jié)果表明，野生東北虎線粒體控制區(qū)的單倍型多樣性水平極低，82個(gè)糞便樣本僅共享3種單倍型，其中最廣泛的一個(gè)單倍型占所有樣本的96. 4%，其余兩種單倍型僅占所有樣本的3. 6%。與之前Cracraft等［27］報(bào)道的14只圈養(yǎng)東北虎共享的4種mtDNA細(xì)胞色素b 基因單倍型相比，在一個(gè)突變率相對(duì)較低的基因區(qū)域中有著更高水平的單倍型多樣性，表明圈養(yǎng)個(gè)體可能比野生個(gè)體存在更大數(shù)量的遺傳變異。除東北虎之外，在其他物種的研究中也存在類似結(jié)果，如Zhu等［23］在對(duì)圈養(yǎng)與野生大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）線粒體基因組編碼區(qū)的比較中發(fā)現(xiàn)，圈養(yǎng)大熊貓的遺傳多樣性高于野生大熊貓的遺傳多樣性。

本研究針對(duì)圈養(yǎng)與野生東北虎線粒體基因組的比較得到了類似結(jié)果，并驗(yàn)證了本研究的推測(cè)，圈養(yǎng)東北虎的遺傳多樣性高于野生東北虎的遺傳多樣性，具有更高的遺傳變異水平。將線粒體基因組分區(qū)段考察，每個(gè)區(qū)段上野生種群的多樣性水平也都顯著低于圈養(yǎng)種群。這一結(jié)果雖然不能完全排除樣本量的影響（野生種群只有13只個(gè)體，而圈養(yǎng)種群有51只個(gè)體），但是與Ning等［5］的評(píng)估結(jié)果部分相符。也就是說(shuō)，從線粒體全基因組看，圈養(yǎng)種群的遺傳多樣性要高于完達(dá)山與老爺嶺等地的野生東北虎的遺傳多樣性。相較于傳統(tǒng)的對(duì)線粒體基因組上某一基因或片段的研究，本研究放眼于整個(gè)東北虎線粒體基因組，并針對(duì)不同區(qū)域進(jìn)行分段比較，從全局水平上對(duì)東北虎線粒體遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估，使遺傳多樣性的評(píng)價(jià)更為全面、精準(zhǔn)。

值得關(guān)注的是，在其他保護(hù)動(dòng)物的研究中［28］也發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果。這可能是圈養(yǎng)種群的初始群體來(lái)自不同地理區(qū)域或不同親本個(gè)體。并且，圈養(yǎng)種群的繁殖受人工管理控制，以最大程度維持種群的遺傳多樣性水平。此外，圈養(yǎng)種群相對(duì)于野生種群來(lái)說(shuō)，通常處于更加安全、穩(wěn)定的環(huán)境中，圈養(yǎng)動(dòng)物基本不會(huì)面臨野外的自然選擇壓力、環(huán)境威脅或食物競(jìng)爭(zhēng)等不利生存的困境，從而使圈養(yǎng)種群有更多的個(gè)體生存下來(lái)并繁殖后代。這樣一來(lái)，圈養(yǎng)種群基因池中的各種變異就會(huì)有更大的機(jī)會(huì)傳遞給下一代。但需要注意的是，這些傳遞到下一代的遺傳變異可能不都是有利的，因此在提高種群遺傳多樣性的同時(shí)應(yīng)該注意有害基因的引入。

線粒體基因組除了D-loop區(qū)以外，所有的編碼區(qū)都有其重要功能，有害突變往往影響其多方面的功能［29］。線粒體不僅被認(rèn)為是能量的供應(yīng)者，而且在與衰老相關(guān)的疾病發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［30?31］，當(dāng)線粒體出現(xiàn)嚴(yán)重衰退時(shí)，會(huì)導(dǎo)致個(gè)體適合度降低而使個(gè)體甚至種群被自然界淘汰。研究顯示，虎在野生和圈養(yǎng)種群中都會(huì)受到有害突變的清除作用（purging）的影響，如虎指名亞種野生種群［32］和人工飼養(yǎng)的華南虎種群［33］。為了檢驗(yàn)線粒體基因組的質(zhì)量，本研究掃描了全基因組，在圈養(yǎng)和野生東北虎種群中均未發(fā)現(xiàn)明顯的有害突變，表明雖然線粒體基因組的遺傳多樣性豐富度不同，但都是安全的。

3. 3 圈養(yǎng)和野生東北虎的關(guān)系

本研究從圈養(yǎng)和野生東北虎種群的樣本中得到9種單倍型，其中圈養(yǎng)種群7種，野生種群2種，二者之間沒(méi)有共享單倍型。這說(shuō)明圈養(yǎng)東北虎種群遺傳多樣性要高于野生東北虎種群，而從進(jìn)化樹(shù)與單倍型網(wǎng)絡(luò)中可以看出，圈養(yǎng)種群的部分個(gè)體與野生東北虎屬于同一進(jìn)化分支，具有較近的遺傳關(guān)系。因此，在利用該圈養(yǎng)種群部分個(gè)體實(shí)施遺傳拯救時(shí)，可以在增加遺傳多樣性的同時(shí)避免產(chǎn)生遠(yuǎn)交衰退。

本研究的野生個(gè)體為隨機(jī)采集，而圈養(yǎng)個(gè)體主要是育齡虎，是該種源基地的核心群體。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Hap_2和Hap_3分支對(duì)應(yīng)的個(gè)體占全部圈養(yǎng)樣本的64. 7%，是圈養(yǎng)種群線粒體遺傳多樣性的主要組成部分。但是，它們與當(dāng)前的野生種群距離甚遠(yuǎn)，說(shuō)明其可能來(lái)自當(dāng)前分布區(qū)以外的某個(gè)地區(qū)的滅絕種群。但該分支具體代表哪個(gè)地理種群尚不明確，日后可將該樣本與中國(guó)、俄羅斯野外所有種群進(jìn)行遺傳多樣性綜合分析，追溯其根源［34］。

4 結(jié)論與建議

在本研究現(xiàn)有樣本條件下，中國(guó)橫道河子貓科動(dòng)物飼養(yǎng)繁育中心圈養(yǎng)種群線粒體基因組的遺傳多樣性較高，且所有的遺傳變異均無(wú)害。該圈養(yǎng)種群的部分個(gè)體與野生種群遺傳關(guān)系較近，遺傳多樣性高度互補(bǔ)，可用來(lái)實(shí)施野生種群的遺傳拯救，消除近交影響。應(yīng)對(duì)圈養(yǎng)種群中的一些遠(yuǎn)緣分支及時(shí)開(kāi)展野外來(lái)源追溯，確定其譜系地理學(xué)地位和保護(hù)價(jià)值，使其成為恢復(fù)野外歷史遺傳多樣性的后備資源。

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