巴西蘇木素通過抑制SarA以PIA依賴性方式減少MRSA生物膜形成的研究

李明哲 楊智芳 周小仙 劉和蘭 黎瑞 周永雯 陳澤慧

摘要：目的 探究巴西蘇木素（brazilin，BN）抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）生物膜形成的機制，為開展中醫(yī)藥防治MRSA感染提供新思路。方法 建立MRSA ATCC43300菌株生物膜模型，試驗分為BN 8、16和32 μg/mL組及對照組；通過結晶紫法測定BN對MRSA生物膜的抑制作用；剛果紅平板法、硫酸-苯酚法檢測BN對細胞間多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）合成的影響；使用real-time PCR（qRT-PCR）方法驗證胞間黏附素操縱子icaA和icaD轉錄水平；分析高通量轉錄組測序可能存在的生物膜抑制基因；通過qRT-PCR、Western blot方法對相關基因及蛋白加以驗證；通過皮下埋植靜脈導管建立MRSA生物膜感染小鼠模型進一步驗證BN療效。結果 與對照組相比，不同濃度的BN組均能顯著減少MRSA生物膜及PIA生成，其中在最低劑量8 μg/mL BN作用下，MRSA生物膜形成量下降40.17% （P<0.01）、PIA減少55.56% （P<0.01）；通過qRT-PCR驗證不同濃度的BN組均能顯著抑制icaA和icaD基因的表達，其中在8 μg/mL濃度下，icaA和icaD基因的表達量分別比對照組降低了59.03%（P<0.01）、48.33%（P<0.05）；高通量測序顯示sarA下調(diào)-1.458 log2；qRT-PCR、Western blot結果顯示，BN能顯著抑制sarA轉錄及其蛋白表達；通過體內(nèi)實驗顯示，BN能有效抑制小鼠體內(nèi)MRSA生物膜的形成。結論 BN通過抑制SarA的表達，減少PIA的合成，進而干預生物膜的形成。

關鍵詞：巴西蘇木素；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；生物膜；PIA；sarA

中圖分類號：R978文獻標志碼：A

Study on the reduction of MRSA biofilm formation by Brazilin through the inhibition of SarA in a PIA-dependent manner

Li Mingzhe1，2， Yang Zhifang3， Zhou Xiaoxian1， Liu Helan2， Li Rui2， Zhou Yongwen2 and Chen Zehui1，2

（1 Department of Laboratory Medicine， Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zunyi 563003; 2 School of Laboratory Medicine， Zunyi Medical University， Zunyi 563006; 3 The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zunyi 563000）

Abstract Objective The goal was to find out how Brazilin （BN） inhibited methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） from making biofilms and to give new ideas for using traditional Chinese medicine to prevent and treat MRSA infections. Methods A biofilm model of the MRSA ATCC43300 strain was established. The experiment was divided into BN 8， 16 and 32 μg/mL groups as well as a control group. The inhibitory effect of BN on MRSA biofilm was determined through the crystal violet method. The Congo red agar plate method and the sulfuric acid-phenol method were employed to detect the effect of BN on the synthesis of polysaccharide intercellular adhesion （PIA）. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to verify the transcription levels of the icaA and icaD gene clusters involved in intercellular adhesion. High-throughput transcriptomic sequencing was performed to identify potential biofilm-inhibitory genes. qRT-PCR and Western blot validated the relevant genes and proteins. The mouse model of MRSA biofilm infection through subcutaneous placement of an intrvenous catheter was established to further validate the efficacy of BN. Results Compared to the control group， BN at different concentrations significantly reduced MRSA biofilm and PIA formation. Specifically， at the lowest dose of 8 μg/mL BN， MRSA biofilm formation was decreased by 40.17% （P<0.01） and PIA by 55.56% （P<0.01）. qRT-PCR verification indicated that BN at different concentrations significantly inhibited the expression of the icaA and icaD genes. Compared to the control group， the expression levels of icaA and icaD genes were reduced by 59.03% （P<0.01） and 48.33% at an 8 μg/mL concentration （P<0.05）， respectively. High-throughput sequencing revealed a sarA downregulation of -1.458 log2. qRT-PCR and Western blot results showed that BN significantly inhibited the transcription and protein expression of sarA. In vivo experiments indicated that BN effectively inhibited MRSA biofilm formation in mice. Conclusion BN reduces the synthesis of PIA by inhibiting the expression of SarA and thereby intervening in biofilm formation.

Key words Brazilian; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Biofilm; PIA; sarA

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）在金黃色葡萄球菌分離株中的比例高達5%～82%，其導致的菌血癥、心內(nèi)膜炎在內(nèi)的臨床綜合征死亡率高達15%～60%[1]。MRSA對現(xiàn)有的β-內(nèi)酰胺類抗生素普遍耐藥，耐萬古霉素金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)，使金黃色葡萄球菌有可能突破抗生素防御的最后一道防線[2]。因此，深入探究MRSA的耐藥機制及尋找新的抗菌藥物對于金黃色葡萄球菌的治療和預防具有重大臨床意義。生物膜是導致機體80%的慢性和復發(fā)性細菌感染的主要原因[3]，多糖胞間黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）是生物膜相關性多糖，在細菌生物膜的形成中發(fā)揮重要作用，主要由胞間黏附素操縱子icaABCD表達產(chǎn)物共同催化合成[4-5]。SarA是MRSA主要毒力因子表達調(diào)控系統(tǒng)之一，能促進或抑制金黃色葡萄球菌許多毒力基因的表達[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌sarA突變株ica表達量減少，抑制了PIA合成，從而導致生物被膜表型缺失[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，巴西蘇木素（brazilin，BN）在體外可抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成[8]。因此，本研究擬探索BN是否能夠通過抑制SarA減少由ica介導合成的PIA，進而干預生物膜的形成，為新型生物膜抑制劑研發(fā)提供思路。

1 材料與儀器

1.1 材料和試劑

BN（成都普思生物科技有限公司，純度≥98%）；細菌組DNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司）；溶葡萄球菌酶（南京都萊生物技術有限公司）；結晶紫（BeckMan）；無水乙醇（成都金山化工公司）；PrimeScript RT reagent kit、SYBR、Green Realtime PCR Master Mix（Takara）；剛果紅（北京索萊寶生物有限公司）；MRSA ATCC43300、E.coli DH5α、原核表達載體pET28a均為本實驗室保存。

1.2 試驗儀器

3111型二氧化碳培養(yǎng)箱；722型分光光度計；T100型PCR儀；FUSIONFX凝膠成像分析儀；CFX-96 Real-time PCR系統(tǒng)；TS-211B型恒溫搖床；MICRO21R高速低溫微量離心機等。

2 方法

2.1 BN對MRSA生物膜形成的影響

2.1.1 結晶紫染色法測定生物膜

從-80 ℃取出保存菌種，接種至血平板上過夜培養(yǎng)。挑取單菌落，用TSB培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×106 CFU/mL，向96微孔板中加入菌液200 μL，加入不同濃度的BN，使其終濃度為8、16和32 μg/mL以及對照組（未加BN）。于37 ℃培養(yǎng)24 h。對菌株進行生物膜染色，測定590 nm波長下的吸光度。

2.1.2 剛果紅法測定PIA

從血平板上挑取單菌落，用TSB培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×106 ?CFU/mL，吸取5 μL菌液滴至含不同藥物濃度（8、16、32 μg/mL）以及對照組的剛果紅平板中心，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。其中菌落顏色呈黑色的為PIA陽性菌株，根據(jù)中心黑色變化觀察BN對PIA合成的影響。

2.1.3 硫酸-苯酚法測定PIA

生物膜的培養(yǎng)參照“2.1.1”的方法培養(yǎng)24 h后，棄去TSB，用PBS重懸，超聲20 min后，4000 r/min離心30 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｏ葘藴势咸烟侨芤航?jīng)硫酸-苯酚法測定制作標準曲線，再將多糖沉淀按同樣的方法進行顯色，酶標儀測定A490值，根據(jù)標準曲線并結合回歸方程由測得的A值計算出相應的PIA含量。

2.2 Real-time PCR

參考文獻方法對生物被膜態(tài)細菌進行總RNA提取[9]，反轉錄得到cDNA后進行qRT-PCR，以檢測生物膜相關調(diào)控基因的轉錄水平，引物序列見表1。

2.3 高通量轉錄組測序

分別將不加BN的對照組以及抑制生物膜最佳藥物濃度組所提取的細菌總RNA，送至上海生物工程股份有限公司，使用Illumina Hiseq軟件進行測序，由公司提供具體數(shù)據(jù)。

2.4 SarA抗體的制備

2.4.1 重組表達質(zhì)粒pET28a-sarA的構建和鑒定

以ATCC43300的基因組為模板，擴增sarA基因全長片段，引物序列見表1，經(jīng)快速限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ和Xho I雙酶切后克隆至pET28a質(zhì)粒，轉入大腸埃希菌（E.coli DH5α），抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切、PCR及DNA測序后獲得重組表達質(zhì)粒pET28a-sarA，隨后轉入表達菌株E.coli BL21（DE3），獲得重組表達菌株BL21- pET28a-sarA；

2.4.2 重組蛋白SarA的誘導表達和純化

參考文獻[10]對蛋白進行大量誘導，并利用鎳柱親和層析法獲得高純度蛋白。

2.4.3 血清效價鑒定

將免疫原SarA重組蛋白與弗氏佐劑1：1混合，選擇小鼠皮下注射，共3次，每次間隔14 d，收集血清，用ELISA法檢測其效價。

2.5 Western blot

從血平板上挑取單菌落，37 ℃搖至A600=0.3，加入BN，使其終濃度為8、16、32 μg/mL以及對照組，繼續(xù)以200 r/min，37 ℃搖至A600=1.6后離心，取上清液，加入三氯乙酸4 ℃過夜沉淀蛋白。加入上樣緩沖液混勻，煮沸后在12.5%的SDS-PAGE上進行電泳，結束后轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上轉膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h后加入制備的SarA抗體（1：2000），4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌3次后加入稀釋的二抗（1：10000），室溫孵育2 h，TBST洗滌3次用ECL檢測系統(tǒng)進行顯影并觀察蛋白條帶。

2.6 BN對MRSA生物膜感染小鼠模型的治療效果

2.6.1 構建小鼠生物膜感染模型

參考文獻[11]采用皮下埋植法進行MRSA生物膜感染小鼠模型建立，采取靜脈導管作為MRSA生物膜生長載體，將載體浸泡MRSA菌液后于脊柱中段埋入皮下，將小鼠分為空白組、對照組以及實驗組，對照組不給藥，實驗組于造模24 h后皮下注射

32 μg/mL BN治療，一周后觀察創(chuàng)面感染情況。

2.6.2 HE染色

取皮膚感染病理組織，放入組織盒，浸泡在配制10%的多聚甲醛溶液中，石蠟包埋后切片，經(jīng)脫蠟、蘇木素染色、分化、返藍、伊紅染色和脫水封片后倒置顯微鏡拍照并進行病理分析。

3 結果

3.1 BN對MRSA生物膜形成的影響

采用結晶紫染色法測定不同濃度的BN對MRSA生物膜形成的影響，與對照組相比，BN 8、16和

32 μg/mL均能顯著抑制MRSA生物膜形成，并呈現(xiàn)劑量依賴性，各組生物膜形成量分別下降了40.17%、57.32%和89.43%（P<0.01），見圖1A。采用剛果紅平板觀察BN對MRSA生物膜中PIA合成的影響，與對照組相比，8、16和32 μg/mL BN組菌落中心黑色明顯變淺，見圖1B。采用硫酸-苯酚法對PIA含量進行定量檢測，葡萄糖標準曲線得到線性方程為：Y=94.29X+0.1006（R2=0.9989），根據(jù)方程計算PIA含量，在8、16和32 μg/mL BN的作用下，MRSA PIA

形成量分別下降了55.56%、77.64%和94.89% （P<0.01），呈明顯的劑量依賴性，見圖1C。

3.2 BN對MRSA icaA和icaD基因表達的影響

采用qRT-PCR技術檢測BN對MRSA icaA和icaD基因表達的影響，與對照組相比8、16和32 μg/mL BN組以上基因相對表達量均呈現(xiàn)下降趨勢，且呈現(xiàn)劑量依賴性。icaA表達量分別下降了59.03%、82.63%和86.35% （P<0.01），icaD表達量分別下降了48.33%、71.73%、83.17% （P<0.05），見圖2。

3.3 高通量轉錄組測序結果

通過不加藥組與32 μg/mL BN處理后的測序對比結果發(fā)現(xiàn)，大量差異基因富集在生物致病相關功能通路上GO：0009405，其中與金黃色葡萄球菌生物膜密切相關的毒力調(diào)控因子sarA（SAOUHSC_00620），下調(diào)-1.458 log2，見表2；sarA基因共作網(wǎng)絡圖并結合相關文獻，發(fā)現(xiàn)sarA參與胞間黏附素操縱子icaABCD的調(diào)控，見圖3。

3.4 BN對MRSA sarA基因表達的影響

通過qRT-PCR技術驗證BN對MRSA sarA基因表達的影響，與對照組相比，8、16和32 μg/mLBN均能減少sarA基因相對表達量，呈現(xiàn)劑量依賴性，sarA表達量分別下降了59.03%、76.63%和83.13% （P<0.01），見圖4。

3.5 制備SarA抗體

將構建的重組質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示重組質(zhì)粒pET28a-sarA可以被酶切為pET28a質(zhì)粒和sarA基因片段兩部分，菌液PCR、基因測序鑒定結果顯示重組質(zhì)粒pET28a-sarA構建成功，見圖5A；并經(jīng)誘導成功表達出SarA（13.7 kDa）蛋白，200和300 mmol咪唑洗脫出高純度蛋白，將洗脫的蛋白樣品使用10 kDa超濾濃縮管濃縮，用于多克隆抗體制備，見圖5B。

3.6 BN對MRSA SarA蛋白表達的影響

通過ELISA法測定小鼠血清抗體效價達到1：128000后進行Western blot檢測SarA蛋白的表達量，在8～32 μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著BN濃度增加，SarA蛋白表達量逐漸減少，見圖6。

3.7 BN在小鼠體內(nèi)抑制MRSA生物膜的形成

靜脈穿刺管植入72 h后，模型組創(chuàng)口部位形成紅腫凸起，BN處理一周后，紅腫消失，創(chuàng)面減小趨于愈合。HE病理染色結果顯示，陰性對照組皮膚組織顯示表皮層、真皮層和皮下附屬器輪廓清晰，結構完整，模型組皮下組織出現(xiàn)退化中性粒細胞組成的膿腫病變，同時表皮層、真皮層損害嚴重。BN處理組與對照組相比，中性粒細胞浸潤減少，表皮層和真皮層損傷明顯減輕，見圖7。

4 討論

金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌，在自然環(huán)境中廣泛存在，其生物膜的形成是造成金黃色葡萄球菌耐藥和持續(xù)性感染的主要原因。因此，抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成是改善細菌耐藥和抗菌藥物開發(fā)的重要策略[12]。BN是中藥蘇木的主要活性成分，屬于高異黃酮類化合物的衍生物，具有抗氧化、抗菌、抗老化、降血糖、抗痤瘡、抗血小板濃縮及抗癌等多種生物學活性[13-14]。本課題組前期研究已證實BN能夠抑制MRSA生物膜的形成，但其作用機制尚不清楚。因此，本課題擬深入研究其抑制生物膜形成的機制。首先采用了結晶紫法驗證了BN對生物膜形成的抑制作用，結果顯示在本實驗條件下，8、16和32 μg/mL BN能夠顯著抑制MRSA生物膜的形成，不僅驗證了前期研究結果，更為后續(xù)機制研究奠定可靠的實驗基礎。

金黃色葡萄球菌生物膜的形成分為4個階段，分別為黏附、聚集、成熟和脫落，PIA是生物膜形成聚集階段重要的物質(zhì)基礎，能夠介導細菌間黏附促進生物膜的形成，并參與細菌感染宿主的過程[15]。因此，抑制PIA的生成是抑制細菌生物膜形成和感染宿主能力的關鍵。本研究采用了剛果紅法和硫酸-苯酚法兩種不同的方法對BN抑制MRSA生物膜形成的作用進行定性和定量分析。剛果紅染色結果顯示，與對照組相比，8、16和32 μg/mL BN組菌落中心黑色明顯變淺，說明BN能夠顯著抑制PIA的生成。同時，硫酸-苯酚法定量分析結果顯示，8、16和32 μg/mL BN能夠劑量依賴性地降低PIA的合成量，進一步驗證了BN抑制PIA合成的作用，說明BN抑制生物膜形成與抑制PIA合成有關。

細菌生物膜的形成不僅受外界因素的影響，同時也受自身基因的調(diào)控，有研究證實PIA生成與ica操縱子密切相關[16]。ica操縱子基因座由調(diào)節(jié)基因icaR和串聯(lián)存在的icaABCD組成，共同調(diào)控PIA的合成，其中icaA基因是編碼乙酰葡萄糖胺轉移酶的基因[17]，與icaD基因的共表達可提高乙酰葡糖胺轉移酶活性，從而促進PIA合成，且有研究證實將icaA/icaD敲除后發(fā)現(xiàn)生物膜形成能力明顯降低[18]。因此，本研究檢測了BN對icaA和icaD基因的表達，結果顯示，BN 8、16和32 μg/mL均能顯著抑制icaA和icaD基因的表達。說明BN抑制PIA的生成可能與抑制其上游調(diào)控基因表達有關。

葡萄球菌附屬蛋白調(diào)節(jié)系統(tǒng)中SarA是一種二聚體DNA結合蛋白[19]，Tormo等[20]研究發(fā)現(xiàn)SarA與icaR-icaA啟動子序列之間具有高親和力并存在多個DNA結合位點，SarA易與這些DNA位點結合，促進ica操縱子的表達，從而調(diào)節(jié)纖連蛋白和結合蛋白的表達抑制細菌生物膜的形成，并且icaA不能在沒有sarA的情況下表達[21]。SarA是抗生物膜制劑開發(fā)的重要靶點，目前已有針對SarA的生物膜抑制劑取得了良好效果[22]?；贐N對生物膜有良好的抑制作用，本研究進行了高通量轉錄組測序，結果發(fā)現(xiàn)與胞間多糖黏附素操縱子icaABCD密切相關的sarA基因顯著下調(diào)。并采用了qRT-PCR進行驗證，結果顯示BN 8、16和32 μg/mL均能顯著抑制sarA基因的表達，說明BN可能通過抑制sarA從而減少ica操縱子的表達，調(diào)控細菌生物膜的形成。有研究發(fā)現(xiàn)SarA蛋白的C端具有較好的柔性、親水性（≥0.5）和表面可及性（≥1），抗原指數(shù)也較高，分布較均勻，易形成抗原表位，與抗體結合的可能性較大[23]。參考此方法，本研究成功構建重組表達質(zhì)粒pET28a-sarA并誘導出SarA蛋白，通過免疫小鼠成功獲得SarA抗體。將此抗體用于western blot觀察BN對SarA的表達的影響，在8、16和32 μg/mL濃度范圍內(nèi)，BN均能顯著抑制SarA的表達。以上結果說明BN可能通過抑制SarA從而減少ica操縱子的表達，減少細菌生物膜的形成。據(jù)文獻報道[24]，sarA啟動子區(qū)域廣泛，包括3個不同的啟動子（P2、P3和P1），每個都攜帶主要的372 bp sarA開放閱讀框，而其中P1啟動子是最活躍的，被廣泛用于在金黃色葡萄球菌中表達各種熒光報告基因，BN是否可能通過與sarA的P1啟動子結合而抑制其轉錄，其具體機制還有待進一步研究。

為了進一步探討B(tài)N對小鼠體內(nèi)MRSA生物膜感染的治療效果，進行了小鼠生物膜模型構建，目前已建立的生物膜感染動物模型有小鼠中心靜脈導管插管模型、大鼠心靜脈導管插管模型、兔皮下埋植支架模型、小鼠皮下埋植導管模型等[25]，由于中心靜脈導管是由MRSA感染引起敗血癥的重要來源[11]。因此，選取中心靜脈導管對小鼠進行皮下埋植建模，在32 μg/mL BN濃度皮下注射一周后可以發(fā)現(xiàn)BN處理組對比模型組皮膚紅腫明顯減輕，且有效減少皮膚表皮層、真皮層損害。因此，進一步說明BN能在體內(nèi)抑制MRSA生物膜的形成，為BN用于MRSA導致的創(chuàng)面感染奠定理論基礎。

綜上所述，BN抑制MRSA生物膜形成可能與抑制sarA調(diào)控的ica操縱子表達，從而減少PIA合成有關。更深的作用機制將通過敲除或過表達sarA基因進行驗證。

參 考 文 獻

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