福建獼猴桃細(xì)菌性枯萎病的病原菌鑒定

季夢婷　陳長江　羅流河　林志堅(jiān)　詹夢琳　楊丙燁　胡方平　蔡學(xué)清

摘要：為明確近年來在福建省寧德市蕉城區(qū)石后鄉(xiāng)獼猴桃苗圃新發(fā)生的一種細(xì)菌性病害病的原菌，并進(jìn)一步探討其發(fā)生流行規(guī)律，采用稀釋分離法對采集病株進(jìn)行病原菌的分離和純化，對獲得的細(xì)菌菌株進(jìn)行致病性測定，通過柯赫氏法則驗(yàn)證、常規(guī)的細(xì)菌生物學(xué)特性、生理生化反應(yīng)、Biolog 鑒定、16S rDNA和內(nèi)切葡聚糖酶基因（egl）序列分析對病原菌進(jìn)行分類鑒定。結(jié)果表明，從發(fā)病獼猴桃病株上獲得9株細(xì)菌菌株，將其接種在健康的獼猴桃植株后，其發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀基本一致，且從接種后病株的莖稈和根部又重新分離到與原菌落形態(tài)相同的細(xì)菌?？潞帐戏▌t證實(shí)這9株細(xì)菌菌株為獼猴桃細(xì)菌性枯萎病的致病菌。這9株菌株在NA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)一致，均呈不規(guī)則型、扁平，并逐漸向四周擴(kuò)散，不產(chǎn)生粘稠狀物質(zhì)，不會使培養(yǎng)基變色；在TTC培養(yǎng)基上，菌落顏色呈暗紅色，產(chǎn)生可擴(kuò)散至培養(yǎng)基中的紅褐色色素，其流動(dòng)性較差；在YDC培養(yǎng)基上，菌落呈乳白色。經(jīng)綜合分析，這9株細(xì)菌菌株均被鑒定為假茄科雷爾氏菌（Ralstonia pseudosolanacearum），生化型Ⅲ和演化型Ⅰ（亞洲組），序列變種14。這是首例青枯菌侵染獼猴桃的報(bào)道。以上研究結(jié)果為制定獼猴桃細(xì)菌性枯萎病精準(zhǔn)有效的綜合防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：獼猴桃；細(xì)菌性枯萎?。徊≡b定；生理生化測定；假茄科雷爾氏菌；16S rDNA

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.1058

中圖分類號：S663.4；S436.634.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）04014409

獼猴桃（Actinidia）含有豐富的維生素C、礦物質(zhì)及膳食纖維，營養(yǎng)價(jià)值高，被譽(yù)為“水果之王”。中國是獼猴桃原產(chǎn)地和主要生產(chǎn)國之一，近年來，獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植面積逐年增加，獼猴桃病害的種類也逐漸增加。據(jù)報(bào)道，獼猴桃病害有40多種，主要有：細(xì)菌病害，如獼猴桃細(xì)菌性潰瘍?。≒seudomonas syringae pv. actinidiae）、獼猴桃根癌?。ˋgrobacterium tumefaciens）、獼猴桃花腐?。≒.viridiflava）；真菌病害，如獼猴桃褐斑?。ˋlternariatenuissima）、獼猴桃軟腐?。˙otryosphaeriadothidea）、獼猴桃灰霉?。˙otrytis cinerea）、獼猴桃黑斑?。ˋ. alternata）等[1]；病毒病害，約有15種，如柑橘葉斑駁病毒（Citrus leaf blotch virus）[2]；以及營養(yǎng)缺乏[3]和藥害[4]等非侵染性病害。

假茄科雷爾氏菌Ralstonia pesudosolanacearum又名茄雷爾氏菌（R. solanacearum），由其引起的作物細(xì)菌性枯萎病是一種毀滅性的土傳病害，病菌具有豐富的寄主多樣性，可侵染45科540多種的寄主植物，包括一年生或多年生的草本、藤本或木本植物，如番茄、馬鈴薯、煙草、辣椒、茄子、花生、生姜、芝麻、甘薯、桉樹、桑樹、星油藤和玫瑰等[5-8]。該病菌為土壤習(xí)居菌，且近年來隨著土壤復(fù)種指數(shù)的增加以及全球氣候變暖，其病害發(fā)生面積不斷增加，且有由南向北擴(kuò)展的趨勢。作物細(xì)菌性枯萎病在一般年份的發(fā)病率為10%～20%，嚴(yán)重年份可達(dá)50%～80%，甚至絕收，嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[9]。近年來，在福建省寧德市蕉城區(qū)石后鄉(xiāng)獼猴桃苗圃發(fā)現(xiàn)一種新的病害，發(fā)病初期植株葉片出現(xiàn)萎蔫，后整株全部枯死，莖部維管束出現(xiàn)黑褐色病斑；鏡檢發(fā)病組織有明顯的噴菌現(xiàn)象，說明該病害由細(xì)菌引起，但目前尚未見引起獼猴桃細(xì)菌性枯萎病病因的相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究對該病害的病原菌進(jìn)行分離，通過常規(guī)的細(xì)菌學(xué)方法及分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，明確該病害的病原菌及其分類地位，以便對該病害采取有效的預(yù)防及防控措施。

1 材料與方法

1.1 供試材料及菌株

1.1.1 供試菌株

供試9株（MHRS1～MHRS9）細(xì)菌菌株均從福建省寧德市蕉城區(qū)石后鄉(xiāng)發(fā)病的獼猴桃植株上分離純化后保存，對照菌株番茄青枯病菌（R. pesudosolanacearum ）FQRS1、甘薯青枯病菌（R. pesudosolanacearum） GSRS1 由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存。

1.1.2 供試植物

供試獼猴桃樹品種為‘中華獼猴桃，由安發(fā)（福建）生物有限公司提供；供試番茄苗品種為‘新中蔬四號。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離、純化

參照方中達(dá)[10]的方法分離、純化病原菌。用滅菌解剖刀切取病健交界部組織，經(jīng)無菌水沖洗后置于滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，加少量無菌水搗爛；然后用接種環(huán)蘸取該組織浸出液在NA培養(yǎng)基平板上劃線，置于恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落；按常規(guī)方法純化，純化后的菌株保存在-75 ℃低溫冰箱中。

1.2.2 致病性測定

將分離獲得的菌株在NB（nutrient broth）培養(yǎng)基中振蕩（28 ℃、180 r·min-1）培養(yǎng)24～36 h，將培養(yǎng)好的菌液調(diào)至108 CFU·mL-1（OD600=0.8）備用。

針刺接種：用無菌的大頭針蘸取準(zhǔn)備好的菌懸液針刺接種到健康的獼猴桃苗莖稈，3次重復(fù)。

傷根接種：用無菌的小刀將獼猴桃兩側(cè)根系切斷，每株澆灌50 mL準(zhǔn)備好的菌液，3次重復(fù)。

以接種無菌水為對照。保濕48 h，觀察發(fā)病情況，然后將發(fā)病的植株進(jìn)行細(xì)菌的再分離。

1.2.3 細(xì)菌的形態(tài)觀察、培養(yǎng)性狀和生理生化測定

供試菌株的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征觀察參照東秀珠等[11]方法；淀粉水解、明膠液化、果膠酶水解、果聚糖、H2S試驗(yàn)、精氨酸水解、氧化酶試驗(yàn)、聚-β-羥基丁酸酯（poly-β-hydroxybutyrate，PHB）的積累、水解七葉靈、KB 培養(yǎng)基產(chǎn)熒光現(xiàn)象、YDC（yeastextract dextrose calcium carbonate）培養(yǎng)基生長情況、硝酸鹽還原、耐鹽性、生長溫度、石蕊牛乳、吲哚反應(yīng)、3% KOH等測定參照趙廷昌[12]的方法進(jìn)行。

1.2.4 Biolog 測定

采用Gen Ⅲ Microstationbiolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行Biolog鑒定。

1.2.5 青枯菌特異性引物擴(kuò)增鑒定、生化型及演化型測定

參照Opina等[13]方法采用青枯菌特異性引物（表1）對分離菌株進(jìn)行擴(kuò)增鑒定；參照Huang等[14]方法測定菌株對3種雙糖（麥芽糖、乳糖、纖維二糖）和3種己醇（甘露醇、甜醇、山梨醇）的利用情況；參照Fegan等[15]的方法測定菌株的演化型。

1.2.6 16S rDNA基因和egl 基因鑒定

采用通用引物27F/1492R（表1）擴(kuò)增16Sr DNA 和引物Endo-F/Endo-R擴(kuò)增egl 基因，通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后送上海生工生物工程公司測序，將所得序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫，并利用BLAST 軟件進(jìn)行比對分析，用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉分析為1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)得到的自舉置信度。從GenBank 選取已確定序列變種歸屬的參考菌株序列作為參考，以確定供試菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

獼猴桃細(xì)菌性枯萎病主要危害植株根部和莖稈。發(fā)病初期，植株上部或中部葉片的葉尖、葉緣處卷曲萎蔫，早晚恢復(fù)，后變褐干枯或擴(kuò)展至全葉，靠近病葉部分的葉柄縊縮，或全株葉片同時(shí)出現(xiàn)失水凋萎，但仍保持綠色，呈青枯狀（圖1A）；病莖表皮開裂（圖1B），容易脫落，剖開根莖部皮層時(shí)，可見維管束褐變，發(fā)病后期植株死亡。橫剖病莖或病根，切口處用手?jǐn)D壓，可見乳白色菌液溢出。切小塊病部組織進(jìn)行顯微鏡觀察，可見大量細(xì)菌溢流從患病薄壁組織涌出。

2.2 病原菌的致病性測定

從福建省寧德市蕉城區(qū)石后鄉(xiāng)發(fā)病的獼猴桃病株上分離純化到9株細(xì)菌菌株，將其分別命名為MHRS1～MHRS9。致病性測定結(jié)果（圖2）表明，供試菌株和對照菌株（番茄青枯菌）接種獼猴桃后均能發(fā)病，接種后的發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相同。針刺接種后3 d，接種部位變褐色，后逐漸擴(kuò)展，后期表皮開裂，維管束變色，接種部位上部新葉葉緣卷曲、焦枯，后期脫落，與田間癥狀基本一致。傷根接種后14 d，葉片邊緣發(fā)黃變色，葉緣卷曲，葉柄處溢縮，植株青枯萎蔫，后期葉片干枯脫落，病害癥狀發(fā)展快；接種后21 d，植株開始死亡，與田間發(fā)病癥狀基本一致。從發(fā)病植株上再次分離得到與接種菌落形態(tài)一致的菌株，經(jīng)再接種，這9株菌株均為該病的病原菌，且各菌株間的致病性無明顯差異。另外，將這9株菌株傷根接種番茄后14 d，番茄出現(xiàn)萎蔫癥狀，與用番茄青枯菌灌根接種后番茄表現(xiàn)出的癥狀一致，發(fā)病的時(shí)間也相同。說明從獼猴桃病株上分離菌株的致病性與番茄青枯菌沒有差異，而且能夠侵染番茄。

2.3 病原細(xì)菌鑒定

2.3.1 培養(yǎng)性狀

由圖3可知，供試菌株在NA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈不規(guī)則型、扁平，并逐漸向四周擴(kuò)散，不產(chǎn)生粘稠狀物質(zhì)，不會使培養(yǎng)基變色；在KB培養(yǎng)基平板上，菌落不會向四周擴(kuò)散，流動(dòng)性較差；在TTC培養(yǎng)基上，菌落顏色呈暗紅色，產(chǎn)生的紅褐色色素可擴(kuò)散至培養(yǎng)基中，菌落表面較干燥，流動(dòng)性差；在YDC培養(yǎng)基上，菌落呈白色，較為干燥，流動(dòng)性差；而番茄青枯菌（FQRS1）在YDC培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，濕潤，流動(dòng)性強(qiáng)，會向周圍擴(kuò)散。

2.3.2 細(xì)菌的形態(tài)特征

供試菌株的菌體呈短桿狀，兩端圓，大小為（0.40～0.90） μm×（1.10～2.80） μm，革蘭氏染色反應(yīng)陰性，極生1～2根鞭毛（圖4）。

2.3.3 生理生化性狀

生理生化測定結(jié)果（表2）表明，與對照菌株番茄青枯菌和甘薯青枯菌相同，供試菌株能積累聚-β-羥基丁酸鹽（PHB），在40 ℃能生長，耐鹽性為1.5%，果膠酶反應(yīng)呈陽性，能還原硝酸鹽并產(chǎn)生氣體，3% KOH反應(yīng)呈陽性，不產(chǎn)生吲哚，不能水解七葉靈和精氨酸，在YDC培養(yǎng)基上菌落呈白色，在KB培養(yǎng)基上生長后置260 nm紫外燈下無黃綠色熒光；與對照菌株番茄青枯菌和甘薯青枯菌不同，供試菌株氧化酶和H2S反應(yīng)為陽性，不能使明膠液化，果聚糖反應(yīng)為陰性。

2.3.4 Biolog 鑒定

由于9株供試菌株的17項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測試結(jié)果均表現(xiàn)一致，因此，隨機(jī)挑選MHRS3和MHRS8這2株菌株進(jìn)行71種碳源利用及23 種化學(xué)敏感性測試，經(jīng)培育24 h 后，Microlog 軟件讀數(shù)結(jié)果（表3）顯示，菌株 MHRS3和MHRS8與數(shù)據(jù)庫中R. pseudosolanacearum 的相似度最高，為0.697。

2.3.5 青枯菌生化型和演化型測定結(jié)果

由表4可知，與對照番茄青枯菌和甘薯青枯菌一致，供試菌株能利用乳糖、麥芽糖、纖維二糖3種雙糖和甘露醇、山梨醇和甜醇3種己醇。根據(jù)青枯菌生化型劃分標(biāo)準(zhǔn)[18]將供試菌株鑒定為青枯菌生化型Ⅲ（表4）。根據(jù)青枯菌演化型分類體系，用青枯菌演化型復(fù)合引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果（圖5）顯示，擴(kuò)增得到2條條帶；一條片段大小為280 bp；另一條片段大小為144 bp。其中，片段大小為280 bp的條帶為青枯菌特異性擴(kuò)增條帶；片段大小為144 bp 的為演化型Ⅰ的特異性擴(kuò)增條帶。參照演化型劃分標(biāo)準(zhǔn)[10]將供試菌株鑒定為演化型Ⅰ。

2.3.6 16S rDNA基因擴(kuò)增

用16S rDNA的通用引物27F/1492R擴(kuò)增后測序，測序結(jié)果通過NCBI在線比對，供試菌株的16S rDNA序列與假茄科雷爾氏菌（R. pseudosolanacearum）同源性最高，為99%；以大腸埃希氏菌（Escherichia coli）為外群（outgroup），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖6）顯示，供試菌株與R. pseudosolanacearum 聚在一支，屬于新分類命名的假茄科雷爾氏菌。

2.3.7 基于egl 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

對9株供試菌株的egl 基因進(jìn)行PCR后測序，將測序結(jié)果進(jìn)行在線比對，采用已知序列變種的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列作為參照，結(jié)果（圖7）顯示，9株供試菌株均屬于演化型Ⅰ下的1個(gè)序列變種，即序列變種14。

3 討論

本研究通過對福建省寧德獼猴桃苗圃細(xì)菌性枯萎病株病原菌的分離、致病性測定、生物學(xué)特征、生理生化和Biolog 測定、青枯菌特異性引物PCR 擴(kuò)增、青枯菌生化型和演化型測定以及16S rDNA基因序列分析，根據(jù)Hayward [18]對青枯菌生化型的劃分依據(jù)、Fegan等[15，17]對青枯菌演化型的分類依據(jù)和Safni等[19]提出的青枯菌新分類法，將寧德獼猴桃細(xì)菌性枯萎病的病原菌鑒定為茄假雷爾氏菌的生化型Ⅱ、演化型Ⅰ、序列變種14。這是第一次發(fā)現(xiàn)由茄假雷爾氏菌可自然侵染獼猴桃并引起枯萎病。

Hayward[18]提出了青枯菌生化型的劃分標(biāo)準(zhǔn)，并將其生化型劃分為生化型Ⅰ、生化型Ⅱ、生化型Ⅲ、生化型Ⅳ和生化型Ⅴ。研究顯示，青枯菌生化型Ⅲ為侵染我國番茄[2021]、辣椒[21]、煙草[21]、筍瓜[22]、星油藤[7]、仙草[23]等作物的優(yōu)勢群體。本研究表明，供試菌株與對照番茄青枯菌和甘薯青枯菌一致，均可利用3種雙糖和3種己醇；同時(shí)依據(jù)青枯菌生化型的劃分標(biāo)準(zhǔn)，供試菌株屬于青枯菌生化型Ⅲ，與已有報(bào)道的生化型Ⅲ為我國作物青枯菌優(yōu)勢群體的研究結(jié)果一致[7，20-23]。與番茄青枯菌和甘薯青枯菌不同，供試菌株的H2S反應(yīng)呈陽性、果聚糖反應(yīng)呈陰性；且供試菌株在TTC和YDC培養(yǎng)基上的菌落特征也與番茄青枯菌和甘薯青枯菌有所不同，是否與其寄主植物及來源地理位置不同有關(guān)這有待于進(jìn)一步研究。

Fegan等[15]提出了以演化型分類框架來描述青枯菌種內(nèi)的差異，將已報(bào)道的青枯菌劃分為演化型Ⅰ、演化型Ⅱ、演化型Ⅲ和演化型Ⅳ 4個(gè)類型，其中，演化型I包含了所有來自亞洲的生化型Ⅲ、生化型Ⅳ和生化型Ⅴ。按此分類依據(jù)對我國侵染番茄[2021]、辣椒、茄子、馬鈴薯和姜[21]、筍瓜[22]、花生[21，24]、桑[21，25]、煙草[21，26]、星油藤[7]等作物的青枯病菌R. pseudosolanacearum 進(jìn)行演化型分析，結(jié)果顯示是以演化型Ⅰ為主。本研究對福建省寧德市蕉城區(qū)石后鄉(xiāng)引起獼猴桃細(xì)菌性枯萎病的病菌進(jìn)行鑒定，也是演化型Ⅰ（亞洲組），與前人研究結(jié)果一致。

根據(jù)其內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）基因egl 序列，可以將每個(gè)演化型分為不同的序列變種，目前已經(jīng)鑒定出的序列變種有59 個(gè)[20-22，27]。Xu等[21]對我國13省、17種寄主植物上的286個(gè)青枯菌以及潘哲超等[26]對福建、貴州及廣西的62個(gè)煙草青枯病菌株進(jìn)行了演化型及序列變種鑒定，結(jié)果表明，我國青枯菌屬于演化型Ⅰ的 10個(gè)序列變種及演化型Ⅱ的 1 個(gè)序列變種，其中福建的演化型Ⅰ鑒定出 7個(gè)序列變種（變種14、15、16、17、18、34、44）。本研究顯示，基于egl 基因分析，供試病原菌屬于茄科雷爾氏菌演化型Ⅰ下的序列變種14。然而，獼猴桃細(xì)菌性枯萎病菌是否還存在其他演化型或其他序列變種需要廣泛收集福建省不同地區(qū)的病菌進(jìn)行測定和分析。

獼猴桃細(xì)菌性枯萎病主要發(fā)生在福建省寧德市蕉城區(qū)石后鄉(xiāng)的獼猴桃苗圃，田間發(fā)病率約6%～10%。據(jù)報(bào)道，作物青枯病具有潛伏侵染現(xiàn)象，即植株受到病菌侵染但不表現(xiàn)出枯萎癥狀[28]。因此，一旦苗圃出現(xiàn)病株，病菌可隨苗木調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播和擴(kuò)散，造成病害的流行。再者，青枯菌是一種土壤習(xí)居菌，即使沒有適當(dāng)寄主，病菌在土壤中也可存活1年以上，因此，該病害一旦發(fā)生很難防治。本研究明確了獼猴桃是青枯菌的寄主之一，為該病害的流行及防控提供了重要的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張冬玲）

基金項(xiàng)目：福建省引導(dǎo)性項(xiàng)目（2022N0004）；安發(fā)（福建）生物有限公司項(xiàng)目（YCHX00011）。