非洲豬瘟病毒O174L 蛋白的真核表達(dá)載體構(gòu)建及分子特征分析

沙嘎那日·吉日木圖　林曉　沈兆基　郭肖蓉　李奎　賈紅　周榮

摘要：為分析非洲豬瘟病毒O174L 基因，通過同源重組方式將O174L 基因連接至pRK5M-C-2×Strep載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至豬小腸上皮細(xì)胞系（porcine intestinal columnarepithelial cells，IPEC-J2）中，通過免疫熒光和Western blot檢測(cè)O174L蛋白的表達(dá)情況。PCR及測(cè)序結(jié)果顯示，pRK5M-C-2×Strep-O174L 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。免疫熒光和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，O174L蛋白能夠在IPEC-J2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，基于O174L 基因和B646L（p72）基因序列構(gòu)建各分離毒株的2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹間排列高度相似。來自中國的16株分離株中，O174L 基因序列的相似性高達(dá)96.76%～100.00%。其中，與中國爆發(fā)的其他Ⅱ型分離株相比，China/2018/AnhuiXCGQ在O174L蛋白的第67、75及110位氨基酸存在差異，GZ201801在第110位氨基酸存在差異。Ⅰ型分離株 SD/DY-I/2021和 HeN/ZZ-P1/2021的O174L蛋白的氨基酸序列分別在第13、73、93、95、113和114位上與其他中國Ⅱ型分離株存在差異。O174L蛋白為穩(wěn)定的親水蛋白，沒有信號(hào)肽和跨膜區(qū)；其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相符。以上結(jié)果為深入研究ASFV O174L蛋白與宿主間的相互作用和遺傳進(jìn)化提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒；O174L 基因；真核表達(dá)；分子特征

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0162

中圖分類號(hào)：S858.28；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）04011414

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種烈性、高度接觸性傳染病，可感染家豬、野豬，其天然宿主為軟蜱（Ornithodoros moubata）。ASFV通過空氣、食物、環(huán)境和蟲媒等多個(gè)途徑傳播。其強(qiáng)毒力株對(duì)生豬致病率高，致死率可高達(dá)100%，臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、皮膚發(fā)紺及淋巴結(jié)、腎、胃腸粘膜明顯出血等[1]。ASF在全球的爆發(fā)和流行對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)和食品安全產(chǎn)生了巨大威脅。自2018年傳入我國后，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了毀滅性打擊[1]。

ASFV 是非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，為一種大型的線性雙鏈DNA 病毒[2]?；蚪M大小約170～190 kb，編碼150多種蛋白質(zhì)，參與ASFV 生命周期的不同階段，包括進(jìn)入宿主細(xì)胞、抑制宿主免疫反應(yīng)、病毒復(fù)制及病毒自身DNA 損傷修復(fù)等[3]。ASFV感染的主要靶細(xì)胞類型是單核-吞噬系統(tǒng)的細(xì)胞，包括特定組織巨噬細(xì)胞（macrophages，Mφ）和網(wǎng)狀細(xì)胞的特定譜系[4]。其中，巨噬細(xì)胞作為重要的固有免疫細(xì)胞之一，是機(jī)體抵御病原微生物入侵的第一道防線[5]。巨噬細(xì)胞的主要特點(diǎn)是能夠產(chǎn)生活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）和提高一氧化氮合成酶（nitric oxidesynthetase，iNOS）活性，使其清除胞內(nèi)感染的能力增強(qiáng)[6-9]。

ASFV基因組DNA是ROS攻擊的重要靶分子之一。DNA受ROS氧化損傷的方式主要有2種：一種是DNA雙鏈中的堿基直接被氧化，如鏈斷裂和自發(fā)脫嘌呤/脫嘧啶；另一種是脫氧核苷三磷酸（dNTPs）池中的游離堿基被氧化。然而，包括病毒在內(nèi)的所有生物體基本都無法避免來自外界和生物體自身內(nèi)部的DNA損傷，若不及時(shí)修復(fù)這些損傷，將會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生災(zāi)難性的后果，比如DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程將不能正常進(jìn)行，嚴(yán)重影響基因組的完整性和穩(wěn)定性，進(jìn)而引起病毒自身復(fù)制和組裝停止、突變以及死亡等一系列危害[10]。為了有效克服這些DNA損傷，ASFV 進(jìn)化出了自己的修復(fù)系統(tǒng)。ASFV 修復(fù)系統(tǒng)包括由自身編碼的Ⅱ類AP內(nèi)切酶（E269R）、修復(fù)性DNA 聚合酶（O174L）、DNA連接酶（NP419 L）3個(gè)修復(fù)酶參與的堿基切除修復(fù)通路[1112]。O174L 蛋白是一種類似細(xì)胞DNA聚合酶β（DNA polymerase beta，Pol β）的修復(fù)性DNA 聚合酶，能夠有效修復(fù)單核苷酸缺口DNA[1314]。O174L 蛋白的三維結(jié)構(gòu)表明，與其他DNA聚合酶不同，O174L僅由1個(gè)具有催化位點(diǎn)的手掌結(jié)構(gòu)域和參與脫氧核苷三磷酸（dNTP）選擇的C末端結(jié)構(gòu)域組成，缺乏Pol β具有的帶有dRP裂解酶活性位點(diǎn)的N末端8-kD結(jié)構(gòu)域[1516]。然而關(guān)于O174L 的保真度卻存在爭(zhēng)議，研究報(bào)道，O174L 錯(cuò)誤插入核苷酸的頻率為10-4～10-5，與Pol β的值相當(dāng)[1718]。相比之下，O174L在其他研究中的保真度值低40～700倍[19]。盡管對(duì)O174L蛋白有了一定的了解，但是ASFV整個(gè)DNA修復(fù)系統(tǒng)以及O174L蛋白在病毒自身DNA損傷修復(fù)中的作用機(jī)制仍未知。因此，本研究通過真核系統(tǒng)表達(dá)ASFV的DNA聚合酶O174L，進(jìn)一步利用生物信息學(xué)方法分析O174L蛋白的分子特征，以期對(duì)該基因及其蛋白的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pRK5M-C-2×Strep 載體、DH5α 感受態(tài)和IPEC-J2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

高保真DNA聚合酶 2×Phanta Max Master Mix（P515）、快速克隆試劑盒 Clon Express Ⅱ OneStepCloning Kit（C112）、DNA 聚合酶2×Rapid TaqMaster Mix（P222）、小量提取質(zhì)粒試劑盒 FastPure Plasmid Mini Kit（DC201）購自諾唯贊生物科技股份（南京）有限公司。限制性內(nèi)切酶NotⅠ（R0189V）和BamHⅠ（R0136V）購自New EnglandBiolabs 公司（ 美國）。DNA 回收試劑盒（DR010250）購自浙江易思得生物科技有限公司（杭州）。聚乙烯亞胺（polyethylenimine， PEI）轉(zhuǎn)染試劑（23966）購自Polyscience 公司（美國）?？筍treptavidin標(biāo)簽單克隆抗體（BE2076-100）購自柏奧易杰（北京）科技有限公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔&鼠IgG（M210035）購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司。蛋白顯色液ImmobilonWestern HRP（WBKLS0100）購自 Merck 公司（美國）。BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒PierceTM BCA ProteinAssay Ki（t WL338065）購自Thermo公司（美國）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

查詢GeneBank數(shù)據(jù)庫中已有注釋的ASFV基因組數(shù)據(jù)，下載 O174L 基因序列以及相應(yīng)分離株的B646L（p72）基因序列，利用 DNAstar7.1和DNAMAN7等分析軟件對(duì)其進(jìn)行多序列比對(duì)。使用CLUSTALW程序進(jìn)行核苷酸序列的多重比對(duì)。使用MEGAX 軟件采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法基于O174L 和B646L 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過1 000 個(gè)自展值（Bootstraps）確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。從NCBI 下載ASFV分離株CADC_HN09中O174L蛋白的氨基酸序列，通過ExPASy在線分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，采用SignalP和TMHMM法分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和跨膜區(qū)，采用PSIPRED法在線分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過同源建模SWISS-MODEL法在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)NCBI GenBank 中ASFV CADC_HN09 基因組（GenBank ID：MZ614662.1）的核苷酸序列合成O174L 基因，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。并設(shè)計(jì)含有載體和O174L 基因同源序列的特異性引物O174L-F（5-TGAATTAAGCTTGGTGGATCCATGTTAACGCTTATTCAAGGAAAA-3，下劃線部分為Not Ⅰ酶切位點(diǎn)）和 O174L-R（ 5-TGCGGGTGGCTCCATGCGGCCGCTTATAAACGTTTCTTAGGTATGCG-3，下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)），并加入保護(hù)性堿基，擴(kuò)增片段大小為525 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 O174L 基因的擴(kuò)增

以合成的O174L 基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的基因。PCR 體系：2×Phanta Max Master Mix 10 μL，ddH2O 5 μL，上、下游引物各1 μL，模板3 μL，共20 μL。PCR程序：95 ℃3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.3.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶Not Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切pRK5M-C-2×Strep 載體，用快速克隆試劑盒將純化回收的O174L 基因PCR產(chǎn)物及雙酶切載體pRK5M-C-2×Strep 進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。挑取單菌落置于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)振蕩培養(yǎng)12 h，再進(jìn)行菌液PCR鑒定及質(zhì)粒小量提取，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含有10% 的胎牛血和1%的青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)IPEC-J2 細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至約80%密度時(shí)使用PEI轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至IPEC-J2細(xì)胞中，加入無血清、無抗性DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6 h后，更換新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.6 免疫熒光試驗(yàn)

使用12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒并培養(yǎng)24 h后收取細(xì)胞。采用4% 多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，加入0.5% Triton X-100對(duì)細(xì)胞通透15 min，隨后使用3% BSA室溫封閉1 h。4 ℃條件下加入Strep標(biāo)簽抗體（1∶8 000）孵育過夜，隨后加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，最后加入4，6-二脒基-2-苯基吲哚[2-（4-amidinophenyl）-6-indole‐carbamidine dihydrochloride，DAPI]進(jìn)行避光染色，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.7 Western blot 檢測(cè)

用添加蛋白酶抑制劑的RIPA（radio immunoprecipitation assay）裂解緩沖液提取細(xì)胞蛋白，并使用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。將蛋白質(zhì)樣品與1×SDSloading buffer 混合并煮沸10 min。取上清進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜（Merck，美國）。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶溶液封閉2 h，加入一抗（1∶10 000）4 ℃孵育過夜；隨后加入二抗（1∶5 000）室溫孵育45 min；最后通過化學(xué)發(fā)光試劑和成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白信號(hào)。使用Image J（v.1.53k）對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 處理數(shù)據(jù)并作圖，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 O174L 系統(tǒng)發(fā)育分析

在GeneBank 數(shù)據(jù)庫檢索ASFV 分離株基因組，共獲得92 個(gè)不同分離株的O174L 基因序列和相應(yīng)分離株的B646L（p72）基因序列，包括完整的分離時(shí)間、地點(diǎn)、宿主和p72 基因型等相關(guān)信息，如表1所示。參考NCBI，獲得的分離株有7 個(gè)不同的p72 基因型，分別是Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅸ、ⅩⅩ和ⅩⅫ型。

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖1）顯示，基于O174L 和B646L 基因序列的2 個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中各分離株的排列和基因型分型高度吻合?；蛐廷瘢ǔ齃IV_5_40外）、Ⅱ和Ⅸ的ASFV分離株在2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中相同的基因型均聚類在同一個(gè)進(jìn)化枝上?；蛐蜑棰?、Ⅷ、XX和XXII 的分離株聚類在同一個(gè)大進(jìn)化枝上，說明這幾個(gè)基因型分離株相互之間的遺傳關(guān)系與Ⅰ、Ⅱ和Ⅸ型更近。贊比亞分離株（LIV_5_40，MN318203）雖然是Ⅰ型，但基于O174L 和B646L 基因序列的2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中均與其他Ⅰ 型分離株的距離較遠(yuǎn)。

基于O174L 基因和B646L（p72）基因的2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹存在2個(gè)細(xì)微差異。首先是基于O174L基因的系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖1A），相同的基因型大進(jìn)化枝下面出現(xiàn)了子進(jìn)化枝，其中子進(jìn)化支上的Ⅰ型分離株為L(zhǎng)iv13/33 （OmLF2）（MN913970）、K49（MZ202520）、NHV（KM262845）、OURT 88/3（AM712240）、Arm/07/CBM/c4（LR881473）、Pig/HeN/ZZ-P1/2021（MZ945536）和Pig/SD/DY-I/2021（MZ945537）；Ⅱ 型分離株為ASFV/Ulyanovsk 19/WB-5699（MW306192）、GZ201801（MT496893） 和China/2018/AnhuiXCGQ（MK128995）。雖然基于O174L 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Ⅰ型和Ⅱ型分支也出現(xiàn)了子進(jìn)化枝，但這些子進(jìn)化枝上的分離株O174L 基因序列與其他大進(jìn)化枝上的分離株O174L 基因序列相比有著99%以上的序列一致性，而基于B646L（p72）基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上沒有出現(xiàn)類似的子進(jìn)化枝（圖1B）。

由圖2可知，來自中國的16個(gè)ASFV分離株包括2個(gè)基因Ⅰ型和14個(gè)基因Ⅱ型，通過多序列比對(duì)，各分離株間的O174L 基因序列相似性高達(dá)96.76%～100.00%。在氨基酸序列比對(duì)中，與中國爆發(fā)的其他Ⅱ型分離株相比，China/2018/AnhuiXCGQ在O174L蛋白的第67、75以及110位氨基酸上存在差異，GZ201801在第110位氨基酸上存在差異；基因Ⅰ型分離株SD/DY-I/2021 和HeN/ZZ-P1/2021 的O174L蛋白氨基酸序列分別在第13、73、93、95、113和114位上與其他中國Ⅱ型分離株存在差異。

2.2 O174L蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、信號(hào)肽與跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

ExPASy在線預(yù)測(cè)分析顯示，O174L 基因編碼蛋白長(zhǎng)度為174 aa，理論分子量為20.33 kD，預(yù)估半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為25.44，表明O174L蛋白為穩(wěn)定蛋白。親水性平均值為-0.101，為親水蛋白。經(jīng)SignalP 和TMHMM 法預(yù)測(cè)（圖3）顯示，O174L蛋白質(zhì)不存在信號(hào)肽和跨膜區(qū)。

2.3 O174L 蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）顯示，O174L蛋白由8 個(gè)α 螺旋（α helix）、7 個(gè)β 折疊（β strand）和16 個(gè)無規(guī)則卷曲（random coil）組成（圖4A）。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖4B）顯示，依然是α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲為該蛋白質(zhì)的主要組成結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相符。

2.4 O174L 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

以合成的O174L 基因?yàn)槟０?，通過PCR擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在525 bp處有明亮的特異性條帶，條帶大小與預(yù)期一致（圖5A）。

2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將O174L 基因連接至線性化載體pRK5M-C2×Strep 中（圖5B）。重組表達(dá)質(zhì)粒pRK5M-C-2×Strep-O174L 經(jīng)菌液PCR鑒定，可見525 bp的目的基因片段（圖5C），測(cè)序結(jié)果正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.6 O174L 蛋白在IPEC-2 細(xì)胞中的表達(dá)

用PEI轉(zhuǎn)染試劑將重組表達(dá)質(zhì)粒pRK5M-C-2×Strep-O174L 轉(zhuǎn)染至IPEC-J2 細(xì)胞。通過免疫熒光和Western blot 檢測(cè)O174L 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染試驗(yàn)組在熒光顯微鏡下顯示大量綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞未見綠色熒光（圖6A）。Western blot 分析IPEC-J2細(xì)胞出現(xiàn)大小為20.33 kD的特異性條帶，與重組蛋白O174L 的預(yù)期大小相符?；叶戎到Y(jié)果顯示，對(duì)照組無特異性條帶（圖6B和C），進(jìn)一步證明目的蛋白O174L 能在IPEC-J2 細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。

3 討論

1921年肯尼亞首次報(bào)道ASF疫情，隨后蔓延到歐洲，又傳播到南美洲和加勒比地區(qū)[20]；2007年，進(jìn)入格魯吉亞，逐步影響東歐等國家[21]；2018年，我國沈陽地區(qū)首次爆發(fā)[22]，并逐漸向其他國家蔓延，如巴布亞新幾內(nèi)亞、印度[23]、德國[24]、多米尼加[25]和海地[26]。因ASFV基因組復(fù)雜、編碼蛋白較多，很多蛋白功能未知以及交叉保護(hù)免疫力差等因素嚴(yán)重阻礙了ASF疫苗的研發(fā)，到目前為止，還沒有有效的治療措施。

本研究根據(jù)ASFV 分離株CADC_HN09 基因組序列合成O174L基因，成功構(gòu)建了O174L基因的真核表達(dá)載體，通過免疫熒光與Western blot驗(yàn)證了O174L基因能夠在豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）中穩(wěn)定表達(dá)。O174L 是聚合酶PolX 家族成員[13]。PolX家族顯示出一種典型的聚合酶結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗c人手相似，被稱為拇指、手掌和手指。枯草芽孢桿菌PolX（BsPolX）、嗜熱細(xì)菌PolX（TtPolX）、大鼠PolX（RatPolβ）和人類Polβ（HsPolβ）中8-kD結(jié)構(gòu)域和拇指結(jié)構(gòu)域在同源蛋白中高度保守，但O174L與這些同源蛋白的序列相似性非常低，約為30%，一致性更低，僅約10%[2728]，且O174L缺少8-kD結(jié)構(gòu)域和拇指結(jié)構(gòu)域，但多了1個(gè)專門與受損傷DNA堿基缺口位點(diǎn)下游5端寡核苷酸上的磷酸基團(tuán)（5-P）結(jié)合的口袋結(jié)構(gòu)域。當(dāng)堿基缺口位點(diǎn)的下游具有5-P時(shí)，O174L的催化效率會(huì)比沒有5-P時(shí)高出約14倍，由此表明，與5-P結(jié)合的口袋結(jié)構(gòu)域在O174L的DNA修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用[29]。但目前O174L 的DNA 修復(fù)機(jī)制還未知，因此研究O174L的DNA修復(fù)機(jī)制，對(duì)研制ASFV疫苗以及抗病育種具有很大的理論指導(dǎo)作用。

本研究對(duì)O174L 基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)基于O174L 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的分支和分離株的排列與基于B646L 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果高度相似，來自中國的16株分離株中，各分離株間的O174L 基因序列相似性高達(dá)96.76%～100.00%。其中，與中國爆發(fā)的其他Ⅱ 型分離株相比，China/2018/AnhuiXCGQ 在O174L 的第67、75以及110位氨基酸上存在差異，GZ201801 在第110 位氨基酸上存在差異。Ⅰ型分離株SD/DY-I/2021和HeN/ZZ-P1/2021的O174L氨基酸序列分別在第13、73、93、95、113和114位上與其他中國Ⅱ型分離株存在差異。O174L蛋白為穩(wěn)定的親水蛋白，無信號(hào)肽和跨膜區(qū)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊和無規(guī)卷曲組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相符。對(duì)ASFV進(jìn)行基因分型對(duì)于揭示病毒的起源和快速鑒定同源性毒株非常重要。隨著基因克隆、PCR和測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，ASFV 的基因組研究也得到了進(jìn)一步的發(fā)展。1984年，含有98% ASFV基因組信息的文庫被成功建立[30]，之后，關(guān)于ASFV基因組文庫建設(shè)的文章數(shù)量逐漸增加。目前幾個(gè)特定的基因已被用來評(píng)估ASFV 基因型，包括B646L（p72）、E183L（p54）、CP204L（p30）、EP402（CD2v）、O174L、KP86R 等[31]。迄今為止，基于C-末端p72編碼基因（B646L）已經(jīng)描述了24種基因型[32]，然而，公開可用的完整基因組序列僅代表基因型Ⅰ至Ⅴ、Ⅶ至Ⅹ和XX，絕大多數(shù)序列對(duì)應(yīng)于基因型Ⅰ、Ⅱ和Ⅸ[33-37]，從而限制了對(duì)地理起源和爆發(fā)模式的理解。隨著對(duì)ASFV基因組和分型技術(shù)，特別是全基因組測(cè)序和交叉保護(hù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的不斷深入研究，對(duì)進(jìn)化和選擇過程將會(huì)有更好的理解，對(duì)不同DNA病毒和單獨(dú)病毒基因的分化時(shí)間和起源也會(huì)有更準(zhǔn)確的估計(jì)[38]。

贊比亞分離株LIV_5_40在B646L（p72）基因型分類中雖然屬于Ⅰ型，但無論是在基于O174L和B646L 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹中還是在ASFV全基因組發(fā)育樹中，與其他Ⅰ型分離株均不在同一個(gè)進(jìn)化枝上，而是與Ⅲ和XXII 型聚在一起，且與Ⅳ和XX 型也較為接近[38]。通過DNAMAN7堿基序列比對(duì)，LIV_5_40分離株的O174L 和B646L 基因序列與本研究中的其他Ⅰ型分離株序列相比存在43～45 和102～109 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotide polymorphisms，SNP）。這種數(shù)量較多的堿基突變可能是由于不同分離株間的基因重組。當(dāng)不同亞種的毒株感染同一宿主，均需要利用宿主細(xì)胞的復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制，不同毒株間雖然各有一些特殊基因片段，但很多基因片段非常相似，導(dǎo)致宿主細(xì)胞復(fù)制系統(tǒng)有時(shí)會(huì)將兩者弄混，在復(fù)制不同毒株的相同基因片段時(shí)，連帶把一種毒株的特殊基因片段重組到了另一種毒株上，形成“雜交”毒株。ASFV在贊比亞地區(qū)叢林中反復(fù)感染軟蜱、疣豬、叢林豬等多種宿主，因此其面臨的選擇壓力和環(huán)境壓力導(dǎo)致贊比亞地區(qū)的ASFV毒株易發(fā)生基因重組，因此猜測(cè)贊比亞ASF 流行病學(xué)中可能存在叢林作用[39]。

研究表明，ASFV 聚合酶Ⅹ基因的缺失導(dǎo)致豬巨噬細(xì)胞內(nèi)ASFV的DNA損傷積累和突變頻率增加[40]，表明該基因?qū)S持ASFV基因的穩(wěn)定必不可少。然而，O174L 基因序列的突變和缺失對(duì)其蛋白功能的影響仍是未知。本研究構(gòu)建O174L 在豬消化道細(xì)胞（IPEC-J2）內(nèi)表達(dá)的重組質(zhì)粒，為今后O174L蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用研究提供了工具。

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（責(zé)任編輯：張冬玲）

基金項(xiàng)目：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（Y2021XK20）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31972541）；六安市產(chǎn)學(xué)合作重大專項(xiàng)。