堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)的條件優(yōu)化

摘 要：以萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)和堿性蛋白酶為試驗(yàn)材料，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)過(guò)程中溫度、pH值、加酶量對(duì)水解效果的影響。結(jié)果表明，堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)的最佳條件為控制水解溫度45 ℃、pH值10、加酶量2 000 U·g-1、水解120 min，該條件下水解度為20.13%。

關(guān)鍵詞：苦蕎麥；萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)；堿性蛋白酶；水解

Optimization of Alkaline Protease Hydrolysis of Germinating Tartary Buckwheat Protein

GAN Guochao1， CAI Li1， ZHONG Haixia1， CHEN Zhiguang2， XU Yuhang1

（1.College of Agricultural Sciences， Xichang University， Xichang 615013， China;

2.Panxi Crops Research and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province， Xichang University， Xichang 615013， China）

Abstract： The effects of temperature， pH and enzyme addition on the hydrolysis of germinating tartary buckwheat protein by alkaline protease were studied by single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal conditions for alkaline protease to hydrolyze the germinating tartary buckwheat protein were

controlled by controlling the hydrolysis temperature of 45 ℃， pH 10， enzyme dosage of 2 000 U·g-1， and hydrolysis for 120 min，

and the degree of hydrolysis was 20.13%.

Keywords： tartary buckwheat; germinating tartary buckwheat protein; alkali protease; hydrolysis

在我國(guó)西南部，苦蕎資源相當(dāng)豐富，無(wú)論是品種數(shù)量還是產(chǎn)量，在世界上都穩(wěn)居前列，具有極高的開(kāi)發(fā)價(jià)值?？嗍w含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且具有保健功能[1]，越來(lái)越多的研究者以苦蕎為原料制作食品產(chǎn)品、功能性保健品等。目前對(duì)苦蕎食品的加工研究中，不僅僅局限于苦蕎麥，而是包括整個(gè)苦蕎植株，如莖、葉等部位，以及不同生長(zhǎng)時(shí)期的苦蕎麥。在苦蕎各個(gè)部位中，有著各不相同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；在不同的苦蕎食品中，添加的苦蕎部位也各不相同，如苦蕎茶中使用的是莖和葉；苦蕎粉中使用的是苦蕎籽[2]。苦蕎籽粒經(jīng)萌動(dòng)后，體內(nèi)大量高活性的胰蛋白酶抑制劑會(huì)逐漸被降解，為生長(zhǎng)提供氮源。在萌動(dòng)過(guò)程中會(huì)降低胰蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白消化酶的抑制作用，從而提高蛋白質(zhì)吸收率?？嗍w麥萌動(dòng)后總氨基酸含量比苦蕎麥籽粒中蛋白質(zhì)含量高，且檢測(cè)到的多種氨基酸含量隨萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)明顯提高[3-4]。

將萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)水解后，蛋白分子結(jié)構(gòu)疏松，相對(duì)分子質(zhì)量減小，便于人體消化吸收，能使吸收率大大提高。本試驗(yàn)以涼山萌動(dòng)苦蕎粉為研究材料，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件，以供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦蕎籽粒：購(gòu)于四川省涼山州航飛苦蕎有限公司。

堿性蛋白酶，NaCl、NaOH、HCl、CuSO4、K2SO4、H2SO4、HBO3、NaOH均為AR級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL24型低速臺(tái)式離心機(jī)，上海姚氏儀器設(shè)備廠；HH-6單列六孔恒溫水浴鍋，金壇市華城海納儀器廠；PHS雷磁精密pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FA2004電子天平，杭州匯爾儀器廠；KNC-08C全自動(dòng)凱氏定氮儀，上海洪紀(jì)儀器廠；萬(wàn)能可調(diào)電爐，沈陽(yáng)固而特商貿(mào)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)的提取

萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)的提取工藝流程見(jiàn)圖1。

1.3.2 堿性蛋白酶水解條件的初步確定

試驗(yàn)以水解度為考察指標(biāo)，研究堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)的最佳條件。設(shè)置試驗(yàn)溫度為35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃，試驗(yàn)pH值為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0，加酶量為2 000 U·g-1、3 000 U·g-1、4 000 U·g-1、5 000 U·g-1和6 000 U·g-1。除所研究的因素外，其他剩余各因素均取基本值（pH值10.0、溫度45 ℃、加酶量3 000 U·g-1、底物濃度30 g·L-1、反應(yīng)時(shí)間120 min）。

1.3.3 正交試驗(yàn)

以水解度為考察指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)3因素3水平正交試驗(yàn)確定堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白的最佳條件。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

1.3.4 蛋白質(zhì)的測(cè)定

參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）中凱氏定氮法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量[5]。

1.3.5 水解度的測(cè)定

參照楊文博等[6]提出的蛋白質(zhì)水解度測(cè)定方法，采用甲醛滴定法進(jìn)行蛋白質(zhì)水解度測(cè)定。蛋白水解度=氨基酸總量（水解后）（mg）/樣品蛋白質(zhì)總量（mg）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)水解效果的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)水解度呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度在40～50 ℃時(shí)，對(duì)水解效果的影響較大；水解溫度為45 ℃時(shí)，水解度最大。由此可以得出堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白的最適溫度為45 ℃。

2.1.2 pH值對(duì)水解效果的影響

pH值對(duì)酶促反應(yīng)的影響較大，如偏堿性或者偏酸性都有可能導(dǎo)致堿性蛋白酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而使酶變性失活。在不同pH值條件下，底物的解離狀態(tài)會(huì)發(fā)生不同程度的改變，從而影響底物與酶的結(jié)合能力。此外，pH值對(duì)酶促反應(yīng)的影響，還體現(xiàn)在可能影響酶分子鏈上的部分氨基酸側(cè)鏈的解離狀態(tài)，特別是影響酶催化活性所需的某些氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性。對(duì)于堿性蛋白酶的適宜pH值范圍為9.0～12.0。由圖3可知，在本試驗(yàn)條件下，當(dāng)pH值為10時(shí)，整個(gè)水解過(guò)程的水解度最高，由此可認(rèn)為pH=10為堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白質(zhì)的最適pH值。

2.1.3 加酶量對(duì)水解效果的影響

由圖4可知，在不同的加酶量條件下，蛋白質(zhì)水解度不同，且隨著初始加酶量的提高而增大，但當(dāng)加酶量達(dá)到一定數(shù)值后，其水解度的變化與最佳水解值相近并在一定范圍內(nèi)波動(dòng)。分析可知，本試驗(yàn)條件下，加酶量的適宜范圍為2 000～4 000 U·g-1。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2可知，影響堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白試驗(yàn)的因素由小到大分別為加酶量、溫度、pH值。分析K值得出的最佳的組合是A2B3C2，即溫度45 ℃，pH值為10.0，加酶量為3 000 U·g-1。與正交表中最優(yōu)組合（A2B3C1、A2B1C2和A3B2C1）不一致，因此進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。綜合考慮水解度、經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)用價(jià)值，最終確定A2B3C1為最佳組合，即堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白的最佳條件為溫度45 ℃、pH值為10.0、加酶量為2 000 U·g-1、水解120 min、底物濃度30 g·L-1。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化堿性蛋白酶水解萌動(dòng)苦蕎蛋白的水解條件，最終得出最佳的水解條件為溫度45 ℃，pH值10.0，加酶量2 000 U·g-1、水解120 min、底物濃度30 g·L-1，該條件下水解度為20.13%。

參考文獻(xiàn)

[1]余莎，甘國(guó)超，陳雪婷，等.涼山苦蕎麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及苦蕎涼面的開(kāi)發(fā)前景研究[J].現(xiàn)代食品，2023，29（3）：55-58.

[2]李楠，楊婷.不同干燥方式對(duì)萌芽苦蕎功能成分及抗氧化活性的影響[J].運(yùn)城學(xué)院學(xué)報(bào)，2023，41（3）：41-45.

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[5]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定：

GB 5009.5—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[6]楊文博，張英華.蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定方法研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2014（3）：88-90.

基金項(xiàng)目：四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目“苦蕎米抗性淀粉的影響因素及機(jī)理研究”（SZ22ZZ01）；西昌學(xué)院科研項(xiàng)目“苦蕎脂質(zhì)分解相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)和酶活性特征研究”（YBZ202212）。