梯度洗脫LC-ICP/MS法測定5種硒形態(tài)

摘 要：建立一種梯度洗脫液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，LC-ICP/MS）分析硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根5種硒形態(tài)。樣品通過Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱，分別以流動相A 40 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）和流動相B 60 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）梯度洗脫5種硒形態(tài)，流速為1.0 mL·min-1，切換時間分別為3.0 min和6.4 min，ICP/MS檢測，外標法定量。5種硒形態(tài)在8.5 min內(nèi)檢測完畢；0.5～200.0 μg·L-1相關(guān)系數(shù)r＞0.999，最低檢測質(zhì)量濃度為0.10～0.39 μg·L-1。相較于《生活飲用水標準檢驗方法 第 6 部分：金屬和類金屬指標》（GB/T 5750.6—2023）硒形態(tài)分析法，該方法將分析時間縮短了46.8%，5種形態(tài)峰分離度更好、靈敏度更高。

關(guān)鍵詞：硒形態(tài)；液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法；梯度洗脫

Determination of 5 Selenium Species by Gradient Elution LC-ICP/MS

CHEN Siyi， TANG Qiong， HUANG Li， SHI Xiangdong， FAN Yunyan*

（Nanning Center for Disease Control and Prevention， Nanning 530023， China）

Abstract： A gradient elution liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma-mass spectrometry （ICP/MS） method was established for determination of SeCys2， MeSeCys， Se（Ⅳ）， SeMet and Se（Ⅵ）. 5 selenium species samples were separated using a Hamilton PRP-X100 anion exchange column， with mobile phase A 40 mmol·L-1 （NH4）2HPO4+5 mmol·L-1 C6H8O7·H2O （pH=4.6） and mobile phase B 60 mmol·L-1 （NH4）2HPO4+5 mmol·L-1 C6H8O7·H2O （pH=4.6） at flow rate of 1.0 mL·min-1， and the mobile phase switching times were"3.0 min and 6.4 min， respectively， they were determined by ICP/MS and quantified with external standard calibration method. 5 selenium species were detected within 8.5 min. In the concentration range of 0.5～200.0 μg·L-1， the correlation coefficients （r） of the 5 selenium species were greater than 0.999. The limits of detection of the method were 0.10～0.39 μg·L-1. Compared with the method in GB/T 5750.6—2023， the analysis time of this method was shortened by 46.8 %， and the resolutions and sensitivities of 5 selenium species were better.

Keywords： selenium species; liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry; gradient elution

硒是人體的必需微量元素，與健康密切相關(guān)，在抗氧化、抗炎、增強免疫力、預防癌癥等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。硒的安全濃度范圍很小，缺硒會引發(fā)克山病、地方性心肌炎等疾病，但攝入過量又會增加Ⅱ型糖尿病風險，甚至導致硒中毒[3-4]。硒分為無機硒和有機硒形態(tài)，在土壤與環(huán)境中主要以無機硒形式存在，而在經(jīng)生物體轉(zhuǎn)換后的富硒食品中多以有機硒形式存在[5]。飲用水是人體攝入硒的重要來源之一，2023年10月1日實施的《生活飲用水標準檢驗方法 第6部分：金屬和類金屬指標》（GB/T 5750.6—2023）中，增加了亞硒酸根Se（Ⅳ）、硒酸根Se（Ⅵ）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代蛋氨酸（SeMet）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）5種硒形態(tài)的液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，LC-ICP/MS）檢測方法，是我國第一個同時定量分析5種硒形態(tài)的國家標準，為我國飲用水中硒形態(tài)的存在形式和存量檢測提供了依據(jù)。但國標法分析時間較長，硒代蛋氨酸靈敏度不足，本研究擬用不同流動相梯度洗脫對該法進行優(yōu)化，以縮短分析時間，降低檢出限。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

按GB/T 5750.2—2023要求采集末梢水、江河水源水和瓶裝純凈水，以及經(jīng)過鏈蛋白酶消化的食品處理液。

磷酸氫二銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸（色譜純，天津市光復精細化工研究所）；亞硒酸根溶液標準物質(zhì)GBW10032、硒酸根溶液標準物質(zhì)GBW10033、硒代蛋氨酸溶液標準物質(zhì)GBW10034、硒代胱氨酸溶液標準物質(zhì)GBW10087、甲基硒代半胱氨酸溶液標準物質(zhì)GBW10088（中國計量科學研究院）；實驗用水均為超純水。

LC300-ICPMS NexION5000G液相聯(lián)用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國鉑金埃爾默股份有限公司）；Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱（美國哈密爾頓公司）；ADVANCED-I-12艾柯實驗室超純水機（成都艾柯水處理設(shè)備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

稱取適量的SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）標準物質(zhì)，用水配制成1.0 mg·L-1的混合標準溶液，再用水逐級稀釋至濃度為0.5～200.0 μg·L-1的混合標準溶液系列。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱：Hamilton PRP-X100陰離子交換色譜柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；分別以不同流動相、流速、洗脫時間分離50.0 μg·L-1的5種硒形態(tài)混合標準溶液，并以保留時間、峰面積、分離度等參數(shù)為指標優(yōu)化色譜條件；進樣體積：100 μL。

1.2.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜條件

用ICP/MS調(diào)諧液調(diào)諧優(yōu)化儀器參數(shù)。射頻功率：1 600 W；霧化器氣流量：0.91 L·min-1；稀釋氣流量：0.15 L·min-1；補償氣流量：1.15 L·min-1；氦氣碰撞氣流量：3.5 L·min-1；檢測質(zhì)量數(shù)：78 amu；蠕動泵轉(zhuǎn)速：60 r·min-1。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Clarity軟件對圖譜進行鑒定分析，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel和GraphPad 8.0分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度磷酸氫二銨對不同硒形態(tài)分離的影響

按標準法以1.2 mL·min-1的流動相流速，比較40 mmol·L-1、50 mmol·L-1、60 mmol·L-1磷酸氫二銨對5種硒形態(tài)保留時間的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的磷酸氫二銨僅對Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）2種無機硒形態(tài)的保留時間影響較大，隨著濃度增加，其保留時間變短。當磷酸氫二銨濃度為40 mmol·L-1時，Se（Ⅵ）的保留時間為15.296 min；濃度為60 mmol·L-1時，Se（Ⅵ）的保留時間為8.877 min，分析時間整體縮短。當磷酸氫二銨濃度為60 mmol·L-1時，MeSeCys和Se（Ⅳ）的分離度只有1.416，未完全分離，濃度為40 mmol·L-1時前3個峰的分離度更好。綜上，分離SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）選用40 mmol·L-1磷酸氫二銨作為流動相，分離SeMet、Se（Ⅵ）選用60 mmol·L-1磷酸氫二銨作為流動相。

2.2 不同濃度檸檬酸對不同硒形態(tài)分離的影響

在眾多以Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱為分析柱研究硒形態(tài)分離的研究中，常以磷酸氫二銨、檸檬酸為流動相，還未有研究使用兩種鹽作為流動相。本研究在40 mmol·L-1磷酸氫二銨（pH=6.0）的基礎(chǔ)上加入不同濃度的檸檬酸（并檢測加入檸檬酸后的pH值），以縮短Se（Ⅵ）的保留時間。結(jié)果顯示，檸檬酸對Se（Ⅵ）保留時間影響較大，隨著加入的檸檬酸濃度增加，其保留時間減小，見圖1。以上試驗中，5種硒形態(tài)的分離度均＞1.5，檸檬酸加入濃度為

5 mmol·L-1時，分析時間9 min與8 mmol·L-1檸檬酸時間相當，但分離度稍好（分離度＞2.0）。比較不同檸檬酸濃度分離峰的峰面積，結(jié)果顯示，除Se（Ⅳ）外，4種硒形態(tài)峰面積隨著檸檬酸濃度的增大而增大；在加入檸檬酸濃度≥5 mmol·L-1時，MeSeCys和SeMet峰面積顯著增大（P＜0.05）；加入濃度為8 mmol·L-1時，峰面積與5 mmol·L-1無顯著性差異，見圖2。說明檸檬酸有促進色譜柱保留分離硒形態(tài)的作用，一定程度上增強了分離效果，進而降低了檢出限，尤其是提高了MeSeCys和SeMet的靈敏度。為了減少進入ICP/MS的鹽分，綜合考慮選取40 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）作為分離SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）的流動相。

不同字母表示組間具有顯著性差異，P＜0.05。

2.3 不同流動相流速對不同硒形態(tài)分離的影響

分別用1.2 mL·min-1、1.0 mL·min-1、0.8 mL·min-1的流動相流速分析5種硒形態(tài)，結(jié)果顯示，隨著流速的降低，5種形態(tài)的峰面積都有不同程度的增加；峰面積組間比較均具有顯著性差異（P＜0.05）。說明流速為0.8 mL·min-1時，色譜柱的柱效最好，對5種形態(tài)的保留與分離效果最佳。從分析時間看，流速為1.2 mL·min-1時，總分析時間為9.0 min；流速為1.0 mL·min-1時，總分析時間為10.7 min；流速為0.8 mL·min-1時，總分析時間為13.4 min。雖然使用0.8 mL·min-1流動相分析效果最佳，但分析時間長，綜合考慮選用1.0 mL·min-1流速進行分析。

2.4 梯度流動相切換時間

以40 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）為流動相A，1.0 mL·min-1的流速分析5種硒形態(tài)，在4.0 min已經(jīng)分析完前3種形態(tài)，SeMet和Se（Ⅵ）的保留時間相隔較遠，使用梯度分離減小Se（Ⅵ）的保留時間。為保證柱子平衡，基線平穩(wěn)，梯度流動相只增加磷酸氫二銨的濃度，即使用

60 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）為流動相B。用流動相B分析5種硒形態(tài)，發(fā)現(xiàn)Se（Ⅵ）出現(xiàn)裂峰，因此Se（Ⅵ）由流動相A分離。經(jīng)過驗證，0～3 min使用流動相A，3.0～6.4 min使用流動相B，6.4 min以后再切換回流動相A至分析完畢，分離效果最好，分析時間為8.5 min，色譜圖見圖3（a）。國家標準使用40 mmol·L-1磷酸氫二銨（pH=6.0）為流動相，流速為1.2 mL·min-1，進行5種硒形態(tài)的色譜分離，分析時間為16 min，色譜圖見圖3（b）。相較于國家標準方法，本方法分析時間縮短了46.8%。

2.5 方法線性范圍及檢出限

對優(yōu)化色譜條件后的方法進行方法學驗證，結(jié)果顯示，在0.5～200.0 μg·L-1，5種硒形態(tài)相關(guān)系數(shù)均＞0.999。以3倍基線噪聲時的硒形態(tài)濃度為檢出限，10倍基線噪聲時的硒形態(tài)濃度為定量限，確定SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）的檢出限分別為0.06 μg·L-1、0.07 μg·L-1、0.06 μg·L-1、0.21 μg·L-1、0.10 μg·L-1，定量限分別為0.20 μg·L-1、0.24 μg·L-1、0.22 μg·L-1、0.69 μg·L-1、0.32 μg·L-1，結(jié)果見表1。

2.6 回收率與精密度

對末梢水、江河水源水、瓶裝純凈水以及經(jīng)過鏈蛋白酶消化的食品處理液分別進行低、中、高3個濃度水平（5 μg·L-1、25 μg·L-1、50 μg·L-1）的加標回收實驗，每個濃度水平制備6個平行樣品，計算加標回收率和相對標準偏差。瓶裝純凈水中5種硒形態(tài)的平均加標回收率為97.0%～103.0%，RSD為0.78%～3.97%；末梢水中5種硒形態(tài)的平均加標回收率為96.0%～104.2%，RSD為0.77%～5.48%；水源水中5種硒形態(tài)的平均加標回收率為92.0%～102.6%，RSD為0.47%～3.99%；經(jīng)鏈蛋白酶消化后的食品處理液中5種硒形態(tài)的平均加標回收率為89.4%～104.3%，RSD為1.32%～6.85%；可見方法精密度和準確度均達到標準要求。

3 結(jié)論

本文對GB/T 5750.6—2023中10.5液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測5種硒形態(tài)的方法進行優(yōu)化，樣品通過Hamilton PRP-X100陰離子色譜交換柱，分別以流動相A 40 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）和流動相B 60 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）進行梯度洗脫5種硒形態(tài)，流速為1.0 mL·min-1，切換時間分別為3.0 min和6.4 min，ICP/MS檢測，外標法定量。本方法分析時間僅為8.5 min，較國家標準法（16 min）縮短了近一半的時間，最低檢測質(zhì)量濃度（即定量限）降低了2/3，使用的流動相鹽離子總量減少了41.3%，增強了儀器的穩(wěn)定性和耐用性。本實驗室用該法檢測生活飲用水及食品消化液，精密度及準確度均滿足要求。

參考文獻

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基金項目：廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會自籌經(jīng)費科研課題（Z20200530，Z20200394）；廣西衛(wèi)生應(yīng)急技能培訓中心2022年度開放課題項目（HESTCG20225）；南寧市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（ZC20223240）。

作者簡介：陳思伊（1987—），女，廣西南寧人，碩士，副主任技師。研究方向：食品及水質(zhì)理化檢測。

通信作者：范云燕（1981—），女，廣西桂林人，碩士，主任技師。研究方向：食品及水質(zhì)理化檢測。E-mail：jiandan162@163.com。