農(nóng)貿(mào)市場食品來源大腸埃希菌的耐藥性及其ESBL耐藥基因的研究

摘 要：目的：調(diào)查云南省保山市農(nóng)貿(mào)市場售賣畜禽肉蛋和蔬菜超廣譜β- 內(nèi)酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamase，ESBL）大腸埃希菌污染情況，研究樣品分離獲得的大腸埃希菌ESBL耐藥基因類型。方法：收集農(nóng)貿(mào)市場食品樣本，分離鑒定樣品中的大腸埃希菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，擴(kuò)增大腸埃希菌的ESBL基因，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和同源性比對分析。結(jié)果：245份食品樣本中分離獲得大腸埃希菌75株，其中產(chǎn)ESBL大腸埃希菌25株。對ESBL耐藥基因測序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)耐藥基因?yàn)镃TX-M型，CTX-M-15序列有9株，占比為36%；CTX-M-14有16株，占比為64%。結(jié)論：肉類和蔬菜攜帶ESBL大腸埃希菌，多重耐藥菌及其耐藥基因可能通過食品在社區(qū)傳播。

關(guān)鍵詞：食品；大腸埃希菌；多重耐藥菌；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；耐藥基因

Study on the Resistance of Escherichia coli from Food Sources in Agricultural Markets and Its ESBL Resistance Genes

ZHENG Yue， CAI Peng*， LI Yan， ZHANG Yunxia， WU Zhiyun， WANG Xuelong

（Baoshan College of Traditional Chinese Medicine， Baoshan 678000， China）

Abstract： Objective： To investigate the contamination of ESBL in Escherichia coli sold in livestock and poultry meat， eggs and vegetables in Baoshan city， Yunnan province， and to study the types of extended-spectrum β-lactamase （ESBL） resistance genes of Escherichia coli isolated from the samples. Method： Food samples were collected in Baoshan farmers’ market， and Escherichia coli was isolated and cultured for identification and drug susceptibility test， and ESBL gene was amplified by PCR， sequenced and analyzed for homology comparison. Result： A total of 75 strains of Escherichia coli were isolated from 245 food specimens， including 25 strains of ESBL E. coli. Phylogenetic analysis of the sequencing results of ESBL resistance genes showed that the drug resistance genes were CTX-M type， and there were 9 strains in the CTX-M-15 group， accounting for 36%. There were 16 strains in the CTX-M-14 group， and the detection rate was 64%. Conclusion： Meat and vegetables carry ESBL Escherichia coli， and multidrug-resistant bacteria and their resistance genes may be transmitted in the community through food.

Keywords： food; Escherichia coli; multidrug-resistant bacteria; extended-spectrum β-lactamase; resistance gene

β-內(nèi)酰胺類抗生素是一種廣譜抗生素，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamase，ESBL）是一組酶，可以水解多種β-內(nèi)酰胺類抗生素，包括第四代頭孢菌素，對其他抗生素類別（如喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和磺胺類藥物）具有一定耐藥性。ESBL的擴(kuò)散是全世界主要公共衛(wèi)生問題之一[1]。大腸埃希菌是人畜腸道正常菌群，也是養(yǎng)殖動(dòng)物腹瀉和社區(qū)尿路感染主要的病原菌[2]。流行病學(xué)研究表明，由質(zhì)粒介導(dǎo)ESBL在各種革蘭氏陰性桿菌中傳播速度非?？?，產(chǎn)ESBL大腸埃希菌是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的重要致病菌之一，臨床治療難度高，死亡率比感染普通大腸埃希菌明顯增加[3-4]。

人類接觸或食用未經(jīng)高溫處理的食物，耐藥細(xì)菌通過食物從環(huán)境轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，感染或攜帶ESBL大腸埃希菌的健康人群不會有任何臨床癥狀，但會提高社區(qū)感染耐藥菌風(fēng)險(xiǎn)。畜禽類在養(yǎng)殖過程中大量使用或?yàn)E用抗生素，提高了養(yǎng)殖畜禽類動(dòng)物攜帶細(xì)菌的耐藥性，因此畜禽類產(chǎn)品所攜帶的耐藥細(xì)菌一直是細(xì)菌耐藥監(jiān)測追蹤的熱點(diǎn)。相比而言，研究者們對蔬菜被產(chǎn)ESBL大腸埃希菌污染情況的關(guān)注度較低，但隨著素食主義的興起，生食蔬菜逐漸流行。蔬菜可能在種植過程中被灌溉水、動(dòng)物糞便等污染源污染，也可能在收獲、加工、儲存或運(yùn)輸?shù)入A段被環(huán)境和工作人員攜帶的耐藥細(xì)菌污染，這些都可能使新鮮蔬菜成為傳播產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的媒介。

本研究調(diào)查云南保山地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場售賣肉類和蔬菜的ESBL大腸埃希菌污染情況，分析大腸埃希菌對臨床常用抗生素耐藥情況以及大腸埃希菌ESBL耐藥基因的類型，以期為了解產(chǎn)ESBL大腸埃希菌及耐藥基因在該地傳播和擴(kuò)散的情況提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本

2021年9月—2022年9月，收集云南省保山市隆陽區(qū)農(nóng)貿(mào)市場食品樣本共245份，包括肉類110份（雞肉50、豬肉60）、蔬菜110份（生菜50、黃瓜20、韭菜20、豆芽20）、雞蛋25份。新鮮樣品裝入無菌采樣袋，置于消毒低溫箱內(nèi)保存，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 材料與試劑

ss培養(yǎng)基、EC肉湯、MH瓊脂培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌生化微量鑒定管，購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏紙片，購自溫州市康泰生物科技有限公司；亞胺培南，購自英國oxoid公司；PCR Master Mix、DNA Marker，購自上海擎科生物技術(shù)有限公司；PCR引物由上海擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本處理

無菌稱取25 g新鮮肉類和蔬菜樣品（表面），用滅菌剪刀切碎，加入225 mL EC肉湯中，36 ℃搖瓶增菌培養(yǎng)18～24 h。劃線接種到含有頭孢呋辛（32 μg·mL-1）的ss平板和普通ss平板中。

使用無菌濕潤棉簽涂抹整個(gè)雞蛋樣品表面后，將棉簽頭放入225 mL EC肉湯中，36 ℃搖瓶增菌培養(yǎng)18～24 h。劃線接種到含有頭孢呋辛（32 μg·mL-1）的ss平板和普通ss平板中。

1.3.2 大腸埃希菌的分離鑒定

ss平板36 ℃培養(yǎng)18～24 h，優(yōu)先挑取含有頭孢呋辛ss平板上邊緣整齊、光滑濕潤的粉紅色單菌落，每個(gè)樣本挑選1株，使用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管鑒定。如果含有頭孢呋辛ss平板上沒有目標(biāo)細(xì)菌生長，則隨機(jī)挑取不含頭孢呋辛ss平板邊緣整齊、光滑濕潤的粉紅色單菌落，使用細(xì)菌生化微量鑒定管進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（2020年），采用紙片擴(kuò)散法檢測亞胺培南等抗生素對分離獲得的大腸埃希菌抑菌圈的大小，以大腸埃希菌ATCC 25922作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果用敏感（S）、中敏（I）和耐藥（R）報(bào)告，對3類及以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的菌株記為多重耐藥菌。

1.3.4 ESBL大腸埃希菌表型確證實(shí)驗(yàn)

按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)，用頭孢他啶（CAZ）與頭孢他啶/克拉維酸（CCV）、頭孢噻肟（CTX）與頭孢噻肟/克拉維酸（CTC）兩組紙片同時(shí)檢測，將兩組中任何一組藥物加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌環(huán)直徑相比，差值≥5 mm則判斷為產(chǎn)ESBL菌株。以肺炎克雷伯菌ATCC 700603作為陽性對照，大腸桿菌ATCC 25922作為陰性對照。

1.3.5 耐藥基因的擴(kuò)增和測序

挑取單菌落作為模板進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：根據(jù)張青青等[5]提出的方法合成blaCTX-M、blaSHV、blaTEM耐藥基因引物序列。PCR反應(yīng)體系（30 μL）：H2O 13.8 μL，PCR Master Mix 15 μL，上、下游引物各0.6 μL。變性溫度為95 ℃，退火溫度根據(jù)擴(kuò)增基因的不同各有差異（表1），延伸溫度為

72 ℃，30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠，100 V進(jìn)行電泳檢測。將CTX-M陽性的耐藥基因擴(kuò)增產(chǎn)物送上海擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。

1.3.6 耐藥基因系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對，分析耐藥基因的型別。使用MEGA11進(jìn)行多序列比對分析，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定耐藥基因的類型和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用WHONET 5.6軟件對藥敏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌分離鑒定結(jié)果

經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選及微量生化管鑒定，從245份樣本中分離篩選出75株符合大腸埃希菌培養(yǎng)特征的菌株。肉類樣品中分離出45株大腸埃希菌，其中50份雞肉樣本中分離出17株，分離率為34.00%；60份豬肉樣品中分離出28株，分離率為46.67%。蔬菜樣品共分離獲得26株大腸埃希菌，分離率為23.64%。雞蛋外殼分離到4株大腸埃希菌，分離率為16.00%。

2.2 臨床常見抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

75株非重復(fù)大腸埃希菌對臨床常見抗生素的耐藥情況如圖1所示（本實(shí)驗(yàn)將雞肉和雞蛋中分離的大腸埃希菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果合并統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)稱為雞類）?？梢钥闯觯u類、豬肉和蔬菜3類樣品中分離出的大腸埃希菌對甲氧芐啶/磺胺甲噁唑的耐藥率最高，分別為85.71%、75.00%和76.92%；對亞胺培南的耐藥率最低，說明大腸埃希菌對亞胺培南敏感。

所有樣本分離獲得的大腸埃希菌中，ESBL大腸埃希菌共25株，占比33.33%；多重耐藥菌共有31株，占比41.33%。不同樣本產(chǎn)ESBL大腸埃希菌和多重耐藥菌的分離情況見圖2。

2.3 產(chǎn)ESBL大腸埃希菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果和耐藥基因類型

25株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對亞胺培南敏感，三代頭孢類抗生素頭孢噻肟和頭孢曲松耐藥率高達(dá)100%。ESBL耐藥基因全部為blaCTX-M，未檢測到blaTEM和blaSHV。將PCR擴(kuò)增結(jié)果測序后在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示CTX-M-15序列有9株，占比為36%（9/25）；CTX-M-14有16株，占比為64%（16/25）。25條CTX-M基因序列的系統(tǒng)發(fā)育、藥敏試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

3 討論與結(jié)論

本研究調(diào)查了保山市農(nóng)貿(mào)市場售賣食品被產(chǎn)ESBL大腸埃希菌污染的情況，在市中心城區(qū)主要農(nóng)貿(mào)市場采集樣本共245份，分離獲得大腸埃希菌75株，分離率最高的是豬肉樣品（分離率為46.67%），其次為雞肉（分離率為34.00%）。有研究顯示，北京雞肉樣品中大腸埃希菌分離率為77.38%，豬肉樣品中該菌分離率為42.86%[6]；廣州雞肉樣品中該菌分離率為16.9%，豬肉樣品中該菌分離率為83.1%[7]；新疆豬肉樣品中該菌分離率為56.0%，雞肉樣品中該菌分離率為33.3%[8]，地域差異明顯。畜禽肉類樣品在處理、運(yùn)輸和售賣過程中動(dòng)物糞便污染程度和肉類的新鮮程度是大腸埃希菌分離率不同的主要原因。

本次研究結(jié)果顯示，不同樣品分離大腸埃希菌差異明顯。蔬菜種植過程中較少涉及抗生素的直接使用問題，其表面大腸埃希菌污染主要來源于種植場所受動(dòng)物糞便污染的土壤和水，以及種植、采摘、運(yùn)輸和售賣環(huán)節(jié)工作人員或其他環(huán)境污染。本次研究中，蔬菜中大腸埃希菌分離率為24.5%，比學(xué)者研究的揚(yáng)州蔬菜樣品中大腸埃希菌的分離率（13.82%）高[6]，其原因可能是城市集約化種植肥料使用和蔬菜處理流程更規(guī)范，而農(nóng)村散戶種植使用動(dòng)物糞便作為肥料或使用被糞便污染的水進(jìn)行簡單清洗以便售賣，使得更多的蔬菜樣品中分離出大腸埃希菌。雞蛋表面光滑，水分容易流失，如果放置時(shí)間較長，耐干燥能力弱的大腸埃希菌因缺水死亡而無法被成功分離，所以本次研究中雞蛋表面的大腸埃希菌分離率最低，25份樣品中僅分離出4株大腸埃希菌。

研究大腸埃希菌對臨床常見抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平均耐藥率最高的是磺胺類代表藥物甲氧芐啶/磺胺甲噁唑，耐藥率為75.36%，其次是四環(huán)素，耐藥率為72.10%，與其他學(xué)者的研究結(jié)果差別不大[5，7-10]。但三代頭孢類抗生素耐藥率地域差異明顯，有研究人員發(fā)現(xiàn)，廣州肉類樣品中分離大腸埃希菌對三代頭孢類抗生素的耐藥率不超過5%[7]、烏魯木齊肉類樣品分離大腸埃希菌對三代頭孢類抗生素的平均耐藥率不超過8%[8]，山東雞肉樣品中分離大腸埃希菌對頭孢噻肟的耐藥率為51.7%，豬肉樣品中分離大腸埃希菌對頭孢噻肟的耐藥率為20.4%[10]。本研究中，雞肉樣品中分離出的大腸埃希菌對頭孢噻肟和頭孢曲松耐藥率均為47.26%，對頭孢他啶的耐藥率為23.81%；豬肉中分離出的大腸埃希菌對頭孢噻肟和頭孢他啶的耐藥率分別為42.85%和17.86%。雞肉類中分離出的大腸埃希菌對大多數(shù)抗生素的耐藥率較其他樣品高，與上述研究結(jié)果一致。禽類養(yǎng)殖密度高、時(shí)間短，養(yǎng)殖過程中需要使用大量抗生素防治細(xì)菌感染和傳播。禽類樣品中能分離到更多耐藥細(xì)菌，分離到的細(xì)菌耐藥率也更高。養(yǎng)殖場養(yǎng)殖方式和抗生素的使用以及ESBL耐藥基因流行情況如何影響細(xì)菌三代頭孢耐藥率的地區(qū)差異，有待后續(xù)研究跟進(jìn)。

蔬菜樣品中分離出大腸埃希菌可能與被動(dòng)物糞便污染的土壤和水，處理、售賣過程中，工作人員攜帶大腸桿菌或被環(huán)境中少量目標(biāo)菌污染有關(guān)，蔬菜樣品的大腸埃希菌分離率較低，分離獲得的大腸埃希菌對臨床常見抗生素的耐藥率較肉類樣品中分離的大腸埃希菌低。

研究結(jié)果顯示，雞肉類產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的分離率為17.3%、豬肉為12%、蔬菜為4%，與其他研究人員的結(jié)果類似[9，11-12]。以上研究數(shù)據(jù)表明，食品攜帶ESBL大腸埃希菌、多重耐藥菌可能通過食物鏈傳播。

ESBL耐藥基因主要有3個(gè)類型，TEM、SHV和CTX-M。CTX-M可有效水解頭孢噻肟，是目前全球最流行的ESBL基因類型。根據(jù)序列同源性差異，CTX-M基因分為CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25 5個(gè)大組，超過200種變體或亞型，1組包括CTX-M-1、CTX-M-3、CTX-M-15等變體，2組包括CTX-M-2、CTX-M-4、CTX-M-7等變體，9組包括CTX-M-13、CTX-M-14、CTX-M-16等變體[13]。本研究分離到25株ESBL大腸埃希菌，耐藥基因均為CTX–M，其中CTX-M-15有9條，CTX-M-14有16條。有研究人員從四川食品動(dòng)物源分離123株ESBL大腸埃希菌[11]，CTX-M耐藥基因占比91.9%，其中CTX-M-55最多，占比40%左右。還有研究發(fā)現(xiàn)山東禽畜肉源分離大腸埃希菌ESBL耐藥基因以blaCTX-M-9組為主，占比20.4%[10]。以上結(jié)果表明食品分離ESBL大腸埃希菌耐藥基因變體類型分布存在地域差異。

產(chǎn)ESBL大腸埃希菌是抗生素抗性基因的存儲庫，是影響人體和畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物健康的危險(xiǎn)因子，耐藥細(xì)菌及其耐藥基因通過食物鏈直接或間接傳播是復(fù)雜且影響深遠(yuǎn)的過程[14]。本次研究結(jié)果表明，多種食品被ESBL大腸埃希菌污染，其耐藥基因以CTX-M為主。食品是助推多重耐藥菌在社區(qū)擴(kuò)散的潛在媒介，為降低社區(qū)健康人群感染多重耐藥菌風(fēng)險(xiǎn)，相關(guān)部門需要加強(qiáng)相關(guān)檢測，以更好地了解和有針對性地控制ESBL細(xì)菌在社區(qū)傳播。

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基金項(xiàng)目：云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目“食源標(biāo)本分離多重耐藥菌及其耐藥基因的研究”（2021J1137）。

作者簡介：鄭月（1979—），女，四川宜賓人，碩士，講師。研究方向：微生物耐藥。

通信作者：蔡鵬（1982—），男，回族，云南保山人，本科，講師。研究方向：分子遺傳學(xué)。E-mail：407086943@qq.com。