基于瘦素介導(dǎo)的PI3K/AKT通路探討二甲雙胍對腦卒中相關(guān)性肺炎大鼠肺損傷的作用機制

李彩艷 王東枝 張冰 蘇學(xué)勇 王東姝

摘要 目的： 探究二甲雙胍對腦卒中相關(guān)性肺炎大鼠肺損傷的作用及其對瘦素介導(dǎo)的磷脂酰肌醇3.激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路的影響。 方法： 無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠85只，隨機選取12只作為假手術(shù)組，其余73只進行模型制備，其中1只造模失敗，剩余72只隨機分為模型組、瘦素組、瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組、二甲雙胍組、二甲雙胍＋瘦素組、二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組，每組12只。測定大鼠動脈血氧分壓（PaO 2），計算氧合指數(shù)（OI）；測定各組大鼠血清瘦素、支氣管肺泡灌洗液腫瘤壞死因子.α（TNF.α）、白細胞介素.1β（IL.1β）、C反應(yīng)蛋白（CRP）水平；計算大鼠右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量；觀察大鼠左肺組織病理；測定肺組織PI3K/AKT通路蛋白水平。 結(jié)果： ?與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺部損傷加重，PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、 CRP水平，右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量，大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT升高（ P ＜0.05）。與模型組比較，瘦素組大鼠 肺部損傷加重，PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、CRP水平，右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量，大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT 升高（ P ＜0.05）；二甲雙胍組大鼠肺部損傷減輕，PaO 2、OI水平升高（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、CRP水平，右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量，大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT降低（ P ＜0.05）。與瘦素組比較，瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組、二甲雙胍＋瘦素組大鼠肺部 損傷減輕，PaO 2、OI水平升高（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、CRP水平，右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量，大鼠 肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT降低（ P ＜0.05）。與二甲雙胍組比較，二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組大鼠肺部損傷加重，PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、CRP水平，右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量，大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT升高（ P ＜0.05）。 結(jié)論： 二甲雙胍對腦卒中相關(guān)性肺炎大鼠肺損傷有保護作用，可能是通過抑制瘦素介導(dǎo)的PI3K/AKT通路實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 ?腦卒中相關(guān)性肺炎；肺損傷；瘦素；二甲雙胍；磷脂酰肌醇3.激酶/蛋白激酶B通路

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.09.011

Effect of Metformin on Lung Injury in Rats with Stroke.related Pneumonia Based on Leptin.mediated PI3K/AKT Pathway

LI Caiyan， WANG Dongzhi， ZHANG Bing， SU Xueyong， WANG Dongshu

Second People′s Hospital of Hengshui City， Hengshui 053000， Hebei， China， E.mail： ldjckw@163.com

Abstract Objective： To explore the effect of metformin on lung injury in rats with stroke.related pneumonia and its effect on leptin.mediated phosphatidylinositol 3.kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT） pathway. ?Methods： A total of 85 male SD rats without specific pathogen（SPF） were randomly divided into sham operation group，model group，leptin group，leptin＋PI3K/AKT inhibitor group，metformin group，metformin＋leptin group，metformin＋PI3K/AKT activator group，with 12 rats in each group，and 1 rat failed to be modeled.Arterial partial oxygen pressure（PaO 2） was measured and oxygenation index（OI） was calculated.The levels of serum leptin，tumor necrosis factor.α（TNF.α），interleukin.1β（IL.1β） and C.reactive protein（CRP） in bronchoalveolar lavage fluid were determined in each group.The wet/dry mass of the right lung was calculated.The left lung tissue pathology was observed.PI3K/AKT pathway protein levels were determined in lung tissue. ?Results： Compared with sham operation group，the lung injury of model group aggravated，the levels of PaO 2 and OI decreased（ P ＜0.05），the levels of serum leptin，TNF.α，IL.1β，and CRP，the wet/dry mass of right lung，the p.PI3K/PI3K and p.AKT/AKT of lung tissue increased（ P ＜0.05）.Compared with model group，the lung injury of rats in leptin group were aggravated，the levels of PaO 2 and OI decreased（ P ＜0.05），the levels of serum leptin，TNF.α，IL.1β，and CRP，the wet mass/dry mass of right lung，the p.PI3K/PI3K and p.AKT/AKT in lung tissue of rats increased（ P ＜0.05）.Compared with leptin group，the lung injury of rats in leptin＋PI3K/AKT inhibitor group and metformin＋leptin group reduced，the levels of PaO 2 and OI increased（ P ＜0.05），the levels of serum leptin，TNF.α，IL.1β，and CRP，the wet/dry mass of right lung decreased，p.PI3K/PI3K and p.AKT/AKT decreased in lung tissue of rats（ P ＜0.05）.Compared with metformin group，metformin＋PI3K/AKT activator group increased lung injury，PaO 2 and OI levels decreased（ P ＜0.05），serum leptin，TNF.α，IL.1β and CRP levels，wet/dry mass of right lung，p.PI3K/PI3K and p.AKT/AKT increased in lung tissue of rats（ P ＜0.05）. ?Conclusion： Metformin has a protective effect on lung injury in rats with stroke.related pneumonia，which may be achieved by inhibiting leptin.mediated PI3K/AKT pathway.

Keywords ?stroke.related pneumonia; lung injury; ?leptin; metformin; phosphatidylinositol 3.kinase/protein kinase B pathway

腦卒中相關(guān)性肺炎的發(fā)生是腦卒中病人預(yù)后不良的重要因素，增加腦卒中的治療難度，加重病人及家庭的經(jīng)濟負擔(dān)，且病人極難通過治療受益。因此，探尋治療有效藥物對保護病人肺功能、神經(jīng)功能成為研究熱點 ?［1］ 。瘦素是由脂肪組織分泌的激素，可參與內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié) ?［2.3］ 。劉志敏等 ?［4］ 研究顯示，慢性阻塞性肺疾?。–OPD）急性加重期病人血清瘦素水平與病人肺功能、營養(yǎng)狀況密切相關(guān)；李俊等 ?［5］ 研究顯示，瘦素在肥胖成年人哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用；瘦素可激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路 在兒童變應(yīng)性鼻炎中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用 ?［6］ ，且PI3K/AKT 通路在肺炎的發(fā)病機制中至關(guān)重要 ?［7］ 。二甲雙胍是治療2型糖尿病的常用藥物，對腦卒中具有一定的保護作用 ?［8］ ，且二甲雙胍可治療2型糖尿病并發(fā)肺炎，可有效降低血清炎性因子水平，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，縮短肺炎持續(xù)時間，降低重癥轉(zhuǎn)化率 ?［9］ 。此外，二甲雙胍對矽肺大鼠肺炎與肺纖維化均有干預(yù)作用 ?［10］ ，可降低重癥新型冠狀病毒肺炎病死率 ?［11］ 。本研究將基于瘦素介導(dǎo)的PI3K/AKT通路展開二甲雙胍對腦卒中相關(guān)性肺炎肺損傷作用的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠85只，體質(zhì)量200～260 g，購于吉林大學(xué)，許可號：SYXK（吉）2021.0003）。外源性重組瘦素

購自美國sigma公司；LY294002（S1105）、740 Y.P（S7865）購自selleck公 司；血清瘦素、腫瘤壞死因子.α（TNF.α）、白細胞介素.1β （IL.1β）、C反應(yīng)蛋白（CRP）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物；蘇木精.伊紅（HE）染 色試劑盒購自上海碧云天公司；磷酸化的PI3K ?（p.PI3K）、PI3K、磷酸化的AKT（p.AKT）、AKT、甘油醛.3. 磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、羊抗兔二抗均購自abcam公司。血氣分析儀（Premier3500）購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠造模及分組

取73只SD大鼠進行腦卒中相關(guān)性肺炎模型制備。首先使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥位固定，頸中線開1 cm切口，分離頸總動脈，用棉線制備1 cm頸總動脈線環(huán)，將切口縫合，將大鼠移至立體定位儀，俯臥位沿枕骨下背中造1 cm切口，在大鼠第1頸椎橫突翼小孔插入注射器針頭，損傷椎動脈（至鮮血溢出），止血，縫合切口，術(shù)后注射青霉素防感染。24 h后在頸部缺口處再次打開，夾閉雙側(cè)頸動脈，15 min后打開恢復(fù)血流。另選取12只大鼠僅暴露頸椎與總頸動脈，作為假手術(shù)組。造模成功標(biāo)志為造模48 h后大鼠進食減少，眼球渾濁，呼吸不暢，可見肺雜音 ?［12］ 。造模成功大鼠72只，造模成功率為98.63%（72/73）。將成功造模大鼠隨機分為模型組、瘦素組、瘦素＋PI3K/AKT 抑制劑組、二甲雙胍組、二甲雙胍＋瘦素組、二甲雙胍＋ PI3K/AKT激活劑組。瘦素組大鼠給予50 μg/kg外源性重組瘦素腹腔注射 ?［13］ ；瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組大鼠除給予50 μg/kg外源性重組瘦素腹腔注射外，尾靜脈注射0.3 mg/kg的LY294002 ?［14］ ；二甲雙胍組大鼠給予400 mg/kg二甲雙胍灌胃 ?［10］ ；二甲雙胍＋瘦素組大鼠給予400 mg/kg二甲雙胍灌胃，50 μg/kg外源性重組瘦素腹腔注射；二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組大鼠給予400 mg/kg二甲雙胍灌胃，50 mg/kg 740 Y.P尾靜脈注射 ?［15］ ；模型組與假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.2 大鼠動脈血氧分壓（PaO 2）測定

采集大鼠右側(cè)股動脈血2 mL，血氣分析儀分析大PaO 2，計算氧合指數(shù)（OI）。

1.2.3 ELISA法檢測大鼠血清瘦素水平

采集大鼠股靜脈血1 mL，離心后獲得上清液，通過ELISA試劑盒檢測大鼠血清瘦素水平。

1.2.4 ELISA法測定支氣管肺泡灌洗液炎性因子水平

末次給藥后，對所有大鼠左肺行支氣管肺泡灌洗，共洗滌5次，收集肺泡灌洗液，3 000 r/min離心15 min，獲得上清液，通過試劑盒檢測TNF.α、IL.1β、CRP水平。

1.2.5 大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量

處死大鼠，取右肺下葉濾紙擦拭至表面干燥，稱重，視為濕質(zhì)量；烘干后再次稱質(zhì)量，視為干質(zhì)量，計算大鼠右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值。

1.2.6 HE染色觀測大鼠肺組織病理改變

取大鼠左肺，分為兩部分，一部分常規(guī)制備肺部石蠟切片，通過HE試劑盒進行染色，封片后顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理變化；另一部分進行蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗。

1.2.7 Western Blot法測定肺組織PI3K/AKT通路蛋白水平

取大鼠部分肺部組織，勻漿，12 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)十二烷基硫酸鈉.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS.PAGE）電泳，將一定量蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，封閉，加一抗p.PI3K（1：1 000）、PI3K（1∶1 000）、p.AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、 GAPDH（內(nèi)參，1∶5 000），孵育過夜，加入二抗（1∶5 000）， 電化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色液顯色，分析p.PI3K、PI3K、p.AKT、AKT蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ?± s ）表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步兩組間比較行SNK. q 檢驗。以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況觀察

假手術(shù)組大鼠皮毛水滑，精神狀態(tài)較好，飲水、飲食正常，體質(zhì)量增長正常，有活力；模型組大鼠皮毛干枯灰色，眼睛渾濁，進食減少，飲水增多，口鼻眼分泌物增多，呼吸頻率高，出現(xiàn)肺啰音；瘦素組大鼠較模型組癥狀更為明顯；瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組較瘦素組癥狀緩解；二甲雙胍組較模型組癥狀改善；二甲雙胍＋瘦素組較瘦素組癥狀改善；二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組較二甲雙胍組癥狀改善顯著。

2.2 各組大鼠PaO 2、OI比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05）；與模型組比較，瘦素組大鼠PaO 2、OI水平降低，二甲雙胍組大鼠PaO 2、OI水平升高（ P ＜0.05）； 與瘦素組比較，瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組、二甲雙胍＋ 瘦素組大鼠PaO 2、OI水平升高（ P ＜0.05）；與二甲雙胍組比較，二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組大鼠PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05）。詳見表1。

2.3 各組大鼠血清瘦素比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清瘦素升高（ P ＜0.05）；與模型組比較，瘦素組大鼠血清瘦素升高（ P ＜0.05），二甲雙胍組大鼠血清瘦素降低（ P ＜0.05）；與瘦素組比較，瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組、二甲雙胍＋瘦素組大鼠血清瘦素降低（ P ＜0.05）；與二甲雙胍組比較，二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組大鼠血清瘦素升高（ P ＜0.05）。詳見表2。

2.4 各組大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP水平升高（ P ＜0.05）；與模型組比較，瘦素組大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP水平升高（ P ＜0.05），二甲雙 胍組大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP水平降低（ P ＜0.05）； 與瘦素組比較，瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組、二甲雙胍＋瘦素組大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP降低（ P ＜0.05）；與二甲雙胍組比較，二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組大 鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP升高（ P ＜0.05）。詳見表3。 2.5 各組大鼠右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量升高（ P ＜0.05）；與模型組比較，瘦素組大鼠右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量升高（ P ＜0.05），二甲雙胍組大鼠右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量降低（ P ＜0.05）；與瘦素組比較，瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組、二甲雙胍＋瘦素組大鼠右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量降低（ P ＜0.05）；與二甲雙胍組比較，二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組大鼠右肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量升高（ P ＜0.05）。詳見表4。

2.6 各組大鼠肺組織病理

假手術(shù)組大鼠肺部切片肺泡結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺組織切片有血管擴張，肺泡腔內(nèi)有炎性細胞浸潤，肺泡壁變厚；與模型組比較，瘦素組大鼠肺組織肺泡腔更為狹窄，炎性細胞浸潤更明顯，二甲雙胍組病理減輕；與瘦素組比較，瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組、二甲雙胍＋瘦素組大鼠肺部病理減輕；與二甲雙胍組比較，二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組大鼠肺部病理加重。詳見圖1。

2.7 各組大鼠肺組織PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、 p.AKT/AKT升高（ P ＜0.05）；與模型組比較，瘦 素組大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT升高（ P ＜ ?0.05），二甲雙胍組大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT降低（ P ＜0.05）；與瘦素組比較，瘦素＋PI3K/AKT 抑制劑組、 二甲雙胍＋瘦素組大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT ?降低（ P ＜0.05）；與二甲雙胍組比較，二甲雙胍＋ PI3K/AKT 激活劑組大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT 升高（ P ＜0.05）。詳見圖2、表5。

（A為假手術(shù)組；B為模型組；C為瘦素組；D為瘦素＋PI3K/AKT抑制劑組；E為二甲雙胍組；F為二甲雙胍＋瘦素組；G為二甲雙胍＋PI3K/AKT激活劑組）

3 討 論

腦卒中相關(guān)性肺炎是指未行機械通氣的腦卒中病人在發(fā)病7 d內(nèi)出現(xiàn)的肺炎，此肺炎的出現(xiàn)與腦卒中病人機體功能障礙相關(guān)，肺炎的炎癥反應(yīng)會進一步加劇腦卒中后腦損傷，且會引發(fā)膿毒癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，是造成腦卒中病人預(yù)后不良的重要原因，增加病人治療難度，縮短病人生存期。因此，減輕肺損傷是治療腦卒中相關(guān)性肺炎的重點。

本研究構(gòu)建腦卒中相關(guān)性肺炎大鼠模型，造模48 h 后造模大鼠出現(xiàn)進食減少，眼球渾濁，呼吸不暢的現(xiàn)象，且可聞及肺雜音，表明大鼠出現(xiàn)明顯肺部損傷，造模型成功；此外，HE染色證實大鼠肺組織血管擴張，肺泡腔內(nèi)有炎性細胞浸潤，肺泡壁變厚，PaO 2、OI水平降低，血清TNF.α、IL.1β、CRP升高，從多方面再次驗證造模成功。瘦素在動物組織與血清中含量成正比，由脂肪組織產(chǎn)生，可作用于中樞神經(jīng)細胞受體調(diào)控機體新陳代謝 ?［16］ 。瘦素除在脂肪代謝中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用外，也是一種應(yīng)急類激素，出現(xiàn)感染后，瘦素應(yīng)激性增加，感染期產(chǎn)生的TNF.α、IL.6等會刺激脂肪組織釋放瘦素 ?［17］ 。Rebello等 ?［18］ 研究顯示，肥胖人群新型冠狀病毒肺部感染病人的高死亡率與循環(huán)瘦素介導(dǎo)的免疫有關(guān)；陶梅梅等 ?［19］ 研究發(fā)現(xiàn)，老年細菌性肺炎病人血清瘦素與肺炎的嚴(yán)重程度相關(guān)。在本研究模型大鼠血清瘦素水平升高，提示瘦素與腦卒中相關(guān)性肺炎的發(fā)生 有關(guān)。瘦素可參與對PI3K/AKT通路的調(diào)控，而PI3K/AKT 激活在腦卒中相關(guān)性肺炎中發(fā)揮促進作用 ?［20］ 。本研究瘦素處理模型大鼠后，發(fā)現(xiàn)大鼠肺部損傷、炎癥水平進一步加重，且PI3K/AKT通路被激活，此作用可被PI3K/AKT抑制劑削弱，提示瘦素可介導(dǎo)PI3K/AKT通路活化，可加重腦卒中相關(guān)性肺炎的肺部損傷。

二甲雙胍是常見的高效降糖藥物，常應(yīng)用在神經(jīng)保護、抗炎癥方面有應(yīng)用 ?［21］ 。研究顯示，二甲雙胍可降低2型糖尿病并發(fā)肺炎病人的乳酸和CRP水平 ?［22］ ；二甲雙胍可通過激活線粒體活性氧物，介導(dǎo)對軍團菌肺炎的保護作用 ?［23］ ；二甲雙胍可降低矽肺大鼠肺纖維化 ?［10］ 。二甲雙胍在腦卒中相關(guān)性肺炎的肺損傷中是否發(fā)揮作用仍未可知。在本研究中，二甲雙胍可降低模型大鼠肺組織p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT水平，抑制炎癥反應(yīng)，減輕肺損傷，提示二甲雙胍在腦卒中相關(guān)性肺炎中發(fā)揮的作用可能與其他類型肺炎的作 用一致，均可減輕肺損傷，且其作用機制可能與PI3K/AKT 通路有關(guān)。為驗證二甲雙胍能否作用于PI3K/AKT通路發(fā)揮作用，本研究在二甲雙胍基礎(chǔ)上加入PI3K激活劑，發(fā)現(xiàn)激活劑可減輕二甲雙胍加重的肺炎的肺保護 作用。此外，與瘦素激活的肺炎組比較，二甲雙胍可減 輕瘦素加重的肺損傷情況，并可降低瘦素誘導(dǎo)的PI3K/AKT ?激活。以上結(jié)果均提示二甲雙胍對腦卒中相關(guān)性肺炎大鼠肺損傷具有干預(yù)作用，且可能是通過抑制PI3K/AKT 通路實現(xiàn)的。

綜上所述，二甲雙胍可發(fā)揮對腦卒中相關(guān)性肺炎大鼠肺損傷的保護作用，可能是通過抑制瘦素介導(dǎo)的PI3K/AKT通路實現(xiàn)的。但二甲雙胍對腦卒中相關(guān)性肺炎大鼠肺損傷的保護作用，也可能涉及其他信號通路，尚需深入研究。

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（收稿日期：2022.05.17）

（本文編輯 鄒麗）