HPLC同時(shí)測(cè)定竹筍中8種酚酸類物質(zhì)含量的方法研究及其應(yīng)用

摘要：【目的】為實(shí)現(xiàn)竹筍中3，4-二羥基苯乙酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲醛、丁香醛、阿魏酸、3-羥基肉桂酸等8種酚酸類化合物的快速檢測(cè)，建立一種基于高效液相色譜-二極管陣列（HPLC-PDA）檢測(cè)方法。【方法】采用Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈和乙酸-水（體積比0.5∶99.5）為流動(dòng)相，在流速1.0 mL/min、進(jìn)樣量10 μL和柱溫30 ℃的條件下梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。【結(jié)果】8種酚酸的分離度均在1.5以上，在1.0～50.0 μg/mL的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R≥0.999 0，檢出限[信號(hào)強(qiáng)度（S）與噪聲強(qiáng)度（N）之比（S/N）為3]為0.12～0.69 μg/mL，定量限（S/N=10）為0.36～2.08 μg/mL，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，加標(biāo)回收率為80.99%～129.12%，RSD均小于5%。應(yīng)用該方法，檢測(cè)了苦竹（Pleioblastus amarus）和苦籬竹（Arundinaria acerba）竹筍中酚酸類物質(zhì)的含量，8種酚酸總量為（9.35±0.08）～（38.60±0.12）mg/kg；比較了自然生長(zhǎng)和避光處理生長(zhǎng)條件下苦竹筍中酚酸含量的變化，發(fā)現(xiàn)避光處理的竹筍中6種酚酸含量顯著降低，總含量下降達(dá)46.2%?！窘Y(jié)論】HPLC-PDA檢測(cè)方法簡(jiǎn)單方便，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，適用于竹筍中酚酸類物質(zhì)的測(cè)定；避光處理可以有效降低苦竹筍樣品中酚酸類物質(zhì)的含量。

關(guān)鍵詞：竹筍；酚酸類物質(zhì)；高效液相色譜；苦竹；苦籬竹；避光處理

中圖分類號(hào)：S718 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

文章編號(hào)：1000-2006（2024）03-0237-08

Simultaneous determination of eight phenolic acids in bamboo shoots by HPLC and its applications

HUANG Yongjian， XUN Hang， ZHANG Bao，YOU Junhao， YAO Xi， TANG Feng^*

（International Center for Bamboo and Rattan， Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration/Beijing for Bamboo and Rattan Science and Technology， Beijing 100102， China）

Abstract：【Objective】Phenolic acids are present in almost all plant-derived foods， and are associated with the organoleptic and nutritional properties of foods. A high-performance liquid chromatography-photo-diode array （HPLC-PDA） method was established for the simultaneous detection of eight phenolic acids in bamboo shoots： 3，4-dihydroxyphenylacetic acid， 4-hydroxybenzoic acid， vanillic acid， caffeic acid， 4-hydroxybenzaldehyde， syringaldehyde， ferulic acid and 3-hydroxycinnamic acid. 【Method】Eight phenolic acids were separated on a Symmetry C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）. Acetonitrile （phase A） and 0.5% acetic acid solution （phase B） were used as the mobile phase， the injection volume was 10 μL， and the detection wavelength was 275 nm. The analysis was performed at 30 ℃ with a flow rate of 1.0 mL/min. 【Result】Eight phenolic acids were successfully separated （resolutiongt;1.5）， and had a good linear relationship （R ≥ 0.999 0） with a linear range of 1.0-50.0 μg/mL. The detection limits （S/N=3） were 0.12-0.69 μg/mL and the quantification limits （S/N=10） were 0.36-2.08 μg/mL. Precision， repeatability， and stability tests yielded relative standard deviations （RSD） of lt;5%. Additionally， the recoveries of phenolic acids were 80.99%-129.12%， and the RSD values associated with the recoveries were also lt;5%. The phenolic acid contents in the actual samples of Pleioblastus amarus bamboo shoots and Arundinaria acerba bamboo shoots were determined using an established method. The contents of eight phenolic acids in the actual bamboo shoots samples varied from （9.35±0.08）to （38.60±0.12） mg/kg. A comparative analysis of phenolic acids in P. amarus bamboo shoots grown under a shading treatment and normal conditions was conducted based on this method. Compared to the shoots grown under normal conditions， the contents of six phenolic acids in P. amarus bamboo shoots grown under the shading treatment were lower， and the content of total detected phenolic acids decreased by 46.2%.【Conclusion】The method developed here is simple， sensitive， accurate and reliable， and is suitable for determining phenolic acids in bamboo shoots. The results showed that a shading treatment downregulated the accumulation of phenolic acids in P. amarus bamboo shoots.

Keywords：bamboo shoots; phenolic acids; HPLC; Pleioblastus amarus; Arundinaria acerba; shading treatment

竹筍是一種富含膳食纖維、高蛋白、低脂肪的天然食品。在我國(guó)可食用竹筍資源非常豐富，并具有悠久的食用歷史?？喙S是一類具有苦味的竹筍統(tǒng)稱，例如苦竹屬（Pleioblastus）苦竹（Pleioblastus amarus）的竹筍和青籬竹屬（Arundinaria）苦籬竹（Arundinaria acerba）筍等。苦筍具有清熱祛濕利尿等功效^[1]，是營(yíng)養(yǎng)豐富并具有明確藥用價(jià)值的可食用竹筍。

不同竹種竹筍的口感和營(yíng)養(yǎng)存在明顯差異?？嘀窆S等很多竹筍都有一定程度的苦澀味，澀味主要來(lái)源是單寧、草酸等，而苦味物質(zhì)主要包括苦味氨基酸、氰苷、總黃酮、總生物堿等^[2-3]。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)苦味物質(zhì)代謝途徑的解析可知，竹筍的苦味與L-苯丙氨酸、L-酪氨酸等苦味氨基酸相關(guān)代謝途徑有著密切的聯(lián)系^[4-5]。由于L-苯丙氨酸、L-酪氨酸是植物苯丙烷代謝通路和酪氨酸代謝通路的核心起點(diǎn)，一系列酚酸類物質(zhì)的生物合成自然與此關(guān)系密切，并成為多種植物食品、飲品的苦澀滋味來(lái)源。酚酸在植物中以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)兩種形式存在，普遍認(rèn)為植物源食物中的游離態(tài)酚酸更易于被人體吸收和被味覺系統(tǒng)感知^[6-7]。通過(guò)食物攝入的酚酸類物質(zhì)，對(duì)人體具有抗氧化、抗癌、降血糖以及減肥等多種生理功能^[8]。但是，過(guò)于強(qiáng)烈的苦澀味，會(huì)嚴(yán)重影響竹筍的食用口感。因此，竹筍特別是苦竹筍的苦味物質(zhì)含量檢測(cè)與調(diào)控受到關(guān)注。

國(guó)內(nèi)外對(duì)蕎麥（Fagopyrum esculeatum）、檸檬（Citrus limon）、丹參（Salvia miltiorrhiza）等植物產(chǎn)品中酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)研究較多^[9-11]，多采用高效液相色譜（HPLC）、超高效液相色譜（UPLC）和超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）等檢測(cè)方法，由于UPLC和UPLC-MS法的設(shè)備比較昂貴，HPLC法仍是檢測(cè)酚酸類物質(zhì)有效實(shí)用的方法。但有關(guān)竹筍中多種酚酸類物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)鮮見研究報(bào)道。本研究選擇與L-苯丙氨酸、L-酪氨酸等苦味氨基酸代謝通路相關(guān)的3， 4-二羥基苯乙酸等8種酚酸類物質(zhì)，采用反相高效液相色譜法，建立了一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法。同時(shí)，采用該方法比較了自然生長(zhǎng)和避光處理的苦竹筍中酚酸類物質(zhì)的含量。以期為優(yōu)良筍用竹品種的選育、定向培育的相關(guān)檢測(cè)提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦竹筍，采自四川省宜賓市長(zhǎng)寧縣（自然生長(zhǎng)和避光處理兩種生長(zhǎng)條件，避光處理：對(duì)未出土的竹筍采取4 d的套袋處理后進(jìn)行采集）、樂(lè)山市夾江縣、福建省南平市建甌市；苦籬竹筍，采自廣東省肇慶市廣寧縣。

試劑：乙腈和甲醇（色譜純），默克生物科技有限公司；甲醇（分析醇），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；3， 4-二羥基苯乙酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲醛、丁香醛、阿魏酸、3-羥基肉桂酸（純度≥98％）8種標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)室用水為自制超純水。

儀器：2996高效液相色譜系統(tǒng)、Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），美國(guó)Waters公司；DC-0506恒溫水浴鍋，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；BP221S電子天平，德國(guó)Sartorius公司；KQ-800E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Cascada An超純水儀，美國(guó)Pall公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取3，4-二羥基苯乙酸等8種標(biāo)準(zhǔn)品約5 mg，用甲醇溶解，定容至5 mL，配制質(zhì)量濃度為1.06 mg/mL的3， 4-二羥基苯乙酸、1.10 mg/mL的對(duì)羥基苯甲酸、1.04 mg/mL的香草酸、1.00 mg/mL的咖啡酸、0.94 mg/mL的對(duì)羥基苯甲醛、1.02 mg/mL的丁香醛、1.04 mg/mL的阿魏酸和1.05 mg/mL的3-羥基肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封置于4 ℃冰箱中保存。

酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精確移取上述8種酚酸類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配置成混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，密封置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 工作曲線溶液的配制

精確移取不同體積的混合標(biāo)品母液，置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于4 ℃冰箱中保存，檢測(cè)前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.3 竹筍樣品提取

分別稱取粉碎后的竹筍樣品50.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)85%甲醇溶液300 mL，在水浴中加熱回流提取2 h，趁熱過(guò)濾，得到提取液，重復(fù)提取3次，合并提取液，濃縮并定容至10 mL，置于4 ℃冰箱保存。檢測(cè)前過(guò)0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣量為10 μL。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和檢測(cè)限、定量限測(cè)定

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以信號(hào)強(qiáng)度（S）比噪聲強(qiáng)度（N）等于3（S/N=3）的方法計(jì)算檢測(cè)限，以信號(hào)強(qiáng)度（S）比噪聲強(qiáng)度（N）等于10（S/N=10）的方法計(jì)算定量限。

1.4.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率測(cè)定

將同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算8種組分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察檢測(cè)方法的精密度。

準(zhǔn)確稱取6份采自四川宜賓的苦竹筍樣品50.0 g，提取并進(jìn)樣檢測(cè)，考察檢測(cè)方法的重復(fù)性。

在24 h內(nèi)，將加標(biāo)后四川宜賓的苦竹筍提取液樣品，放置不同時(shí)間（0、2、4、6、8、12、24 h）后，進(jìn)樣檢測(cè)，考察樣品的穩(wěn)定性。

以采自四川宜賓的苦竹筍為試樣，準(zhǔn)確稱取50.0 g樣品，分別加入8種酚酸類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，添加量分別為1.00、2.00、4.00 mg/kg，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，計(jì)算8種組分的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5 HPLC檢測(cè)

Waters 2996高效液相色譜系統(tǒng)，具二極管陣列檢測(cè)器；Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；采用雙流動(dòng)相（A、B）進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為乙酸-水（體積比為0.5∶99.5）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；柱溫30 ℃。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)使用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，后通過(guò)Origin 2018繪圖軟件進(jìn)行液相色譜圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件的優(yōu)化

分別以甲醇-水、甲醇-0.5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.5%乙酸水溶液等為流動(dòng)相，分析8種酚酸類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果（表1）。

分離度即兩個(gè)組分保留值之差與其平均峰寬值之比，是液相色譜方法中的一個(gè)重要的參數(shù)，用來(lái)描述色譜圖中兩個(gè)相鄰峰之間的分離程度。分離度越高，表示兩個(gè)組分之間的分離越好，峰的重疊越少，從而可以更準(zhǔn)確地定量和定性。分離度值大于等于1.5通常被認(rèn)為是兩個(gè)峰良好分離的標(biāo)準(zhǔn)。由表1可見，甲醇-水和甲醇-0.5%乙酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，分離效果較差，香草酸和咖啡酸兩個(gè)物質(zhì)之間的分離度分別是0.60和0.75，表明這兩個(gè)物質(zhì)保留時(shí)間相近，未能完全分離。采用乙腈-水做為流動(dòng)相時(shí)，8種酚酸類物質(zhì)能達(dá)到較為理想的分離效果，香草酸和咖啡酸實(shí)現(xiàn)了較好的分離，實(shí)際樣品檢測(cè)同樣達(dá)到理想的分離效果。使用乙腈-0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，待測(cè)物保留時(shí)間更短，峰型更好。

高效液相色譜梯度洗脫流動(dòng)相占比見表2。8種酚酸類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖見圖1。

洗脫梯度對(duì)于液相色譜的分離起到核心作用，液相洗脫梯度優(yōu)化結(jié)果表明：在開始的5 min內(nèi)，以5%流動(dòng)相A（乙腈）和95%流動(dòng)相B（0.5%乙酸水）進(jìn)行洗脫，酚酸類物質(zhì)能與苦竹筍中極性較大的共提物有很好的分離；5～10 min，將流動(dòng)相A的比例從5%逐漸加大到10%，在10～25 min，以10%流動(dòng)相A和90%流動(dòng)相B進(jìn)行洗脫，可以使3，4-二羥基苯乙酸等前5種酚酸類物質(zhì)達(dá)到很好的分離效果；然后，逐漸加大A相的比例，丁香醛等后3種酚酸類物質(zhì)也能夠均勻分開；在洗脫45 min后將流動(dòng)相A和B的體積比調(diào)整回至5∶95，并保持至程洗脫序結(jié)束，以清洗色譜柱為下一次進(jìn)樣做好準(zhǔn)備。

2.2 檢測(cè)方法驗(yàn)證

2.2.1 線性方程考察以及檢出限、定量限測(cè)定結(jié)果

將質(zhì)量濃度1.0～50.0 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣檢測(cè)，得到每種酚酸類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R≥0.999 0。供試酚酸類成分的檢出限（S/N=3）范圍為0.12～0.69 μg/mL，定量限（S/N=10）范圍為0.36～2.08 μg/mL，表明此方法靈敏度較高（表3）。

2.2.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率

方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果見表4。酚酸類物質(zhì)的添加回收結(jié)果見表5。

由表4可見，10 μg/mL的混合標(biāo)品連續(xù)進(jìn)樣6次，8種組分的精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為0.44%～2.51%，表明儀器精密度良好；苦竹筍樣品重復(fù)提取6次并進(jìn)樣，7種組分的重復(fù)性的RSD值為1.18%～4.38%，表明方法重復(fù)性好；對(duì)加標(biāo)后的待測(cè)樣品在24 h內(nèi)間隔不同時(shí)間進(jìn)樣檢測(cè)（0、2、4、6、8、12、24 h），8種組分的穩(wěn)定性RSD值為1.51%～4.90%，表明樣品提取溶液在24 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

由表5可知，添加8種酚酸類物質(zhì)含量分別為1.00、2.00和4.00 mg/kg時(shí)，8種組分的添加回收率在80.99%～129.12%，RSD值為1.20%～4.76%，滿足檢測(cè)要求。

2.3 竹筍樣品檢測(cè)結(jié)果

竹筍實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果見圖2和表6。

結(jié)果表明，采自四川的苦竹筍樣品中檢出7種酚酸類成分，福建的苦竹筍樣品和廣東的苦籬竹筍樣品中，分別檢出6種和5種酚酸類物質(zhì)。檢出酚酸類物質(zhì)總量最高是四川樂(lè)山的苦竹筍，酚酸類物質(zhì)總檢出量達(dá)38.60 mg/kg，其余依次為：苦竹筍（福建南平，21.38 mg/kg）＞苦籬竹筍（廣東肇慶，17.89 mg/kg）＞苦竹筍（四川宜賓，16.94 mg/kg）。表明所構(gòu)建的方法適用于不同竹筍樣品中8種酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)。

2.4 生長(zhǎng)期避光處理對(duì)苦竹筍中酚酸含量的影響

避光處理對(duì)苦竹筍中酚酸含量的影響見表7。

在實(shí)際生產(chǎn)和相關(guān)研究中，人們發(fā)現(xiàn)通過(guò)覆土、套袋（管）等避光栽培措施，可以有效降低竹筍的苦味，使竹筍食用口感更好^[12-14]，然而避光對(duì)竹筍中具體苦味物質(zhì)積累的影響，目前尚缺乏了解。因此，采用構(gòu)建的檢測(cè)方法，比較了自然生長(zhǎng)（CK）和避光處理?xiàng)l件下苦竹筍中的酚酸類物質(zhì)的含量，結(jié)果表明，避光處理的苦竹筍與酪氨酸代謝通路相關(guān)的酚酸類物質(zhì)中，對(duì)羥基苯甲醛含量降低85.9%、丁香醛含量降低68.1%、對(duì)羥基苯甲酸含量降低19.8%，而香草酸含量上升了68.7%；與苯丙氨酸代謝通路相關(guān)酚酸類物質(zhì)含量均降低，3-羥基肉桂酸降低30.5%，阿魏酸降低22.7%，咖啡酸降低2.5%；總含量下降了46.2%。

3 討 論

目前，竹筍的研究多集中在其營(yíng)養(yǎng)組成方面，如蛋白、可溶性膳食纖維、多糖等化學(xué)成分以及生物活性^[15-17]，關(guān)于小分子化合物的研究極少。研究表明，酚酸類物質(zhì)可能是竹筍中主要生物活性物質(zhì)之一^[18-19]。另一方面，酚酸類物質(zhì)是食品苦味的重要貢獻(xiàn)者。如對(duì)羥基苯甲酸是苦味西葫蘆中最主要的活性成分^[20]；對(duì)羥基苯甲醛是熱加工燕麥中主要的苦味物質(zhì)^[21]；羥基肉桂酸及其衍生物是白葡萄酒中主要的苦味物質(zhì)^[22]；阿魏酸也具有苦味^[23]。對(duì)苦竹筍來(lái)說(shuō)，苦味也是苦竹筍獨(dú)特的風(fēng)味特征，但苦味過(guò)強(qiáng)則會(huì)嚴(yán)重影響食用口感。目前竹筍中主要活性物質(zhì)的研究多采用分光光度法，如總黃酮、總生物堿等化合物的含量檢測(cè)^{[2-3，24-25]}，但這些方法均不能明確是哪些物質(zhì)導(dǎo)致竹筍的苦味口感。因此，亟須建立檢測(cè)與苦味緊密相關(guān)的酚酸類的方法。同樣，目前對(duì)竹筍中酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)多采用分光光度法，通過(guò)測(cè)定總酚含量進(jìn)行表征^[26]，但不能夠反映主要酚酸的種類及其含量。本研究成功構(gòu)建了竹筍中8種酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)方法，并通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法簡(jiǎn)單方便、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，適用于竹筍中酚酸類物質(zhì)的測(cè)定。

光照對(duì)于酚酸類化合物的生成有著顯著的促進(jìn)作用^[27]，避光處理則不利于酚酸類物質(zhì)的積累。在咖啡、茶葉和釀酒葡萄的栽培中，適當(dāng)遮陰可以有效調(diào)控植物中酚酸類物質(zhì)的含量，改善產(chǎn)品的口味^[28-30]。本研究通過(guò)比較自然生長(zhǎng)和避光處理的苦竹筍中酚酸類物質(zhì)的含量，得到了類似的結(jié)論，即避光處理抑制了苦竹筍中部分酚酸類物質(zhì)的生成，降低了苦竹筍中與苯丙烷代謝通路及酪氨酸代謝通路相關(guān)的酚酸類物質(zhì)的含量。研究結(jié)果為有效調(diào)控苦竹筍中酚酸含量提供了支撐。

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（責(zé)任編輯 李燕文）