免疫細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)用質(zhì)粒生產(chǎn)質(zhì)量管理指南

（2023-05-10發(fā)布2023-06-01實施）

前言

本文件按照GB/T 1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

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本文件由上海藥品審評核查中心提出。

本文件由上海醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會歸口。

本文件起草單?。荷虾Ｋ幤穼徳u核查中心、江蘇省藥品監(jiān)督管理局審核查驗中心、上海市生物醫(yī)藥科技發(fā)展中心、上海藥明生基醫(yī)藥科技有限公司、上海醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會。

本文件主要起草人：李香玉、王立新、俞佳寧、王金偉、成殷、孫程潔、宋丹、黨可純、孫祎敏、卜修民、李積宗、史彤、梁銀杏、高揚、譚建新、梁海蘭、汪偉、夷征宇、吳耀衛(wèi)、朱蓓芬。

本文件首批執(zhí)行單位：無錫生基醫(yī)藥科技有限公司、上海藥明巨諾生物科技有限公司、上?？茲扑幱邢薰?、上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司、上海邦耀生物科技有限公司、上海賽比曼生物科技有限公司、上海微知卓生物科技有限公司、南京馴鹿生物醫(yī)藥有限公司、南京傳奇生物科技有限公司、南京北恒生物科技有限公司、合源生物科技（天津）有限公司、北京藝妙神州醫(yī)藥科技有限公司。

1范圍

本文件適用于生產(chǎn)免疫細胞治療產(chǎn)品體外基因修飾系統(tǒng)用的質(zhì)粒的生產(chǎn)質(zhì)量管理。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）及其附錄

中華人民共和國藥典（2020年版）

藥品記錄與數(shù)據(jù)管理要求（試行）

無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1免疫細胞治療產(chǎn)品immune cell therapy products

指源自人體（自體屏體）細胞或人源細胞系的細胞，經(jīng)過體外操作，包括但不限于分離、純化、培養(yǎng)、擴增、誘導(dǎo)分化、活化、遺傳修飾、細胞庫（系）的建立、凍存復(fù)蘇等，再輸入或植入到患者體內(nèi)，通過誘導(dǎo)、增強或抑制機體的免疫功能而治療疾病的免疫細胞治療產(chǎn)品。

3.2質(zhì)粒plasmid

系細菌等生物中染色體以外的環(huán)狀DNA元件，具有自主復(fù)制能力，使其在子代細胞中能保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。

3.3細菌種子批bacterial bank

指通過將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)單克隆篩選及培養(yǎng)傳代后建立的種子庫。

3.4體外基因修飾系統(tǒng)ex vivo genetic manipulation system

指在人體外，將外源基因等導(dǎo)人細胞，通過添加、替代、補償、阻斷、修正特定基因從而為獲得細胞治療產(chǎn)品或細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)用種子細胞而使用的修飾系統(tǒng)。

3.5生產(chǎn)區(qū)域production area

指建筑物內(nèi)一組特定的用于生產(chǎn)操作的房間，通常配備相對獨立的空調(diào)系統(tǒng)（包括通風(fēng)、溫度和必要的濕度調(diào)節(jié)，以及必要的空氣過濾凈化）和人、物流通道。

3.6密閉系統(tǒng)closed system

指為了避免產(chǎn)品或物料暴露于室內(nèi)環(huán)境而設(shè)計和操作使用，且可經(jīng)驗證的系統(tǒng)。

4基本要求

4.1質(zhì)粒作為體外基因修飾系統(tǒng)的生產(chǎn)用起始關(guān)鍵物料，被用于將目的基因轉(zhuǎn)染到基因修飾載體中（如慢病毒載體），進一步生產(chǎn)免疫細胞治療產(chǎn)品。此類質(zhì)粒通常不直接作用于免疫細胞治療產(chǎn)品，其生產(chǎn)、檢驗和放行管理應(yīng)參考《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》及其相關(guān)附錄的要求，應(yīng)根據(jù)其使用于不同的研發(fā)階段、不同的基因修飾載體及免疫細胞治療產(chǎn)品及其不同的生產(chǎn)工藝需求，企業(yè)可以根據(jù)風(fēng)險評估的結(jié)果確定生產(chǎn)過程中適用GMP要求的符合程度。

4.2早期研發(fā)階段中應(yīng)重點關(guān)注質(zhì)粒的設(shè)計和構(gòu)建，考慮元件的功能性和安全性，一般應(yīng)避免使用B-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因，在采用土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件等有風(fēng)險的調(diào)控元件時，應(yīng)經(jīng)過充分風(fēng)險評估，在必要時進行相應(yīng)安全性改造。

4.3質(zhì)粒的生產(chǎn)應(yīng)重點關(guān)注生產(chǎn)用原材料的質(zhì)量控制、批間差異、雜質(zhì)水平、工藝中間控制、污染控制等可能影響免疫細胞治療產(chǎn)品安全性、有效性的因素；質(zhì)粒的質(zhì)量控制方面應(yīng)重點關(guān)注安全性和轉(zhuǎn)染有效性相關(guān)項目，如超螺旋比例、宿主DNA殘留、宿主RNA殘留、宿主蛋白殘留等。如果質(zhì)粒生產(chǎn)或質(zhì)量控制發(fā)生變更，應(yīng)進行充分研究和評估，關(guān)注變更對質(zhì)粒質(zhì)量的影響，也應(yīng)將對體外基因修飾系統(tǒng)及免疫細胞治療產(chǎn)品的影響納入考慮范圍。

4.4對于采用多個質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染工藝生產(chǎn)體外基因修飾載體的情形（如三質(zhì)粒或者四質(zhì)粒系統(tǒng)），質(zhì)粒分為含有目的基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和在轉(zhuǎn)染過程中發(fā)揮輔助作用的通用型輔助質(zhì)粒兩種類別，兩類質(zhì)粒的生產(chǎn)技術(shù)要求和質(zhì)量控制原則應(yīng)保持一致。

4.5藥品上市許可持有人（MAH）對質(zhì)粒的質(zhì)量負有責(zé)任。

5技術(shù)要求

5.1機構(gòu)與人員

5.1.1企業(yè)應(yīng)設(shè)置與質(zhì)粒生產(chǎn)相適應(yīng)的生產(chǎn)管理、質(zhì)量管理、供應(yīng)鏈管理等部門，參考藥品生產(chǎn)要求的質(zhì)量管理體系，各部門應(yīng)有明確的職責(zé)。

5.1.2企業(yè)應(yīng)當(dāng)配備與產(chǎn)品生產(chǎn)、檢驗與質(zhì)量管理相適應(yīng)的技術(shù)人員，具有適當(dāng)資質(zhì)和豐富實踐經(jīng)驗的操作人員和管理人員。參與質(zhì)粒生產(chǎn)和檢驗的人員應(yīng)當(dāng)具備產(chǎn)品相關(guān)知識，有書面文件明確其相關(guān)職責(zé)。

5.1.3參與質(zhì)粒生產(chǎn)和檢驗的人員應(yīng)接受相關(guān)的衛(wèi)生、病原微生物處理、無菌操作（如適用）等相關(guān)專業(yè)培訓(xùn)。

5.2廠房與設(shè)備

5.2.1生產(chǎn)用廠房設(shè)施應(yīng)根據(jù)質(zhì)粒產(chǎn)品特性，生產(chǎn)工藝流程和工藝控制要求設(shè)計，充分考慮人流、物流的合理性，盡可能減少人流和物流交叉污染的風(fēng)險，宜采用廢棄物單向流設(shè)計，確保不對質(zhì)粒產(chǎn)品造成污染。

5.2.2質(zhì)粒發(fā)酵區(qū)域作為有菌操作區(qū)應(yīng)與純化區(qū)域物理分開，宜配備獨立的空調(diào)凈化系統(tǒng)，并關(guān)注預(yù)防交叉污染的措施。

5.2.3生產(chǎn)區(qū)內(nèi)應(yīng)提供生產(chǎn)用壓縮空氣、純蒸汽、制藥用水等公用介質(zhì)，并進行定期監(jiān)測。關(guān)注工藝用水的流向設(shè)計，應(yīng)避免倒流，防止污染及交叉污染。

5.2.4生產(chǎn)的關(guān)鍵設(shè)備應(yīng)進行計量、確認與驗證，與產(chǎn)品直接接觸的設(shè)備或者耗材宜使用一次性系統(tǒng)，以有效地防止污染和交叉污染；使用非一次性系統(tǒng)，應(yīng)采取適當(dāng)措施降低污染的風(fēng)險，使用后的房間和設(shè)備需進行適當(dāng)清潔，設(shè)備清潔方法應(yīng)經(jīng)過驗證。

5.2.5對于發(fā)酵、純化等生產(chǎn)關(guān)鍵步驟，宜采用電子化系統(tǒng)控制設(shè)備，可參考《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》計算機化系統(tǒng)附錄、《藥品記錄與數(shù)據(jù)管理要求（試行）》的要求，對電子化系統(tǒng)進行多級賬號管理，并納入計算機化系統(tǒng)，以確保數(shù)據(jù)的可靠性、真實性和可追溯性。

5.2.6質(zhì)粒生產(chǎn)應(yīng)在受控環(huán)境中進行，環(huán)境需采取有效控制措施并進行日常監(jiān)測，以盡可能降低環(huán)境微生物及顆粒等對產(chǎn)品可能造成的污染，操作環(huán)境的潔凈度級別宜按照表1中的示例進行選擇。

5.3生產(chǎn)管理

5.3.1一般要求

質(zhì)粒生產(chǎn)應(yīng)依照已批準(zhǔn)的工藝規(guī)程和操作規(guī)程進行操作并有相關(guān)記錄，確保生產(chǎn)過程的有效控制，持續(xù)、穩(wěn)定地生產(chǎn)出符合質(zhì)量要求的產(chǎn)品。

5.3.2分批原則

企業(yè)應(yīng)當(dāng)建立劃分質(zhì)粒產(chǎn)品生產(chǎn)批次的規(guī)則，生產(chǎn)批次的劃分應(yīng)當(dāng)能夠確保同一批次產(chǎn)品質(zhì)量和特性的均一性。原則上來源于同一工作菌種發(fā)酵獲得菌體經(jīng)同一生產(chǎn)周期裂解、純化后的獲得質(zhì)量和特性均一的產(chǎn)品為一批。若不同批次工作菌種發(fā)酵獲得的菌體經(jīng)裂解純化步驟后合并進行分裝成最終成品的，應(yīng)評估可能存在的風(fēng)險并經(jīng)相應(yīng)的驗證。質(zhì)粒生產(chǎn)日期不得遲于產(chǎn)品分裝前經(jīng)最后混合的操作開始日期。

5.3.3工藝驗證

5.3.3.1應(yīng)基于產(chǎn)品研發(fā)階段、質(zhì)粒特點、質(zhì)粒工藝是否相同等因素結(jié)合質(zhì)量風(fēng)險管理原則進行風(fēng)險評估，確定各質(zhì)粒工藝確認或驗證的批次和方案，如工藝過程控制確認、中間產(chǎn)物貯存穩(wěn)定性研究、多批次質(zhì)量分析以及雜質(zhì)清除研究等。

5.3.3.2通常轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（含有目的基因）工藝驗證一般應(yīng)包含三個連續(xù)成功的工藝生產(chǎn)批次，如需減少輔助質(zhì)粒驗證批次，首次驗證應(yīng)根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果，選擇其中一種有代表性的質(zhì)粒進行三批次工藝驗證，其他質(zhì)粒工藝驗證可根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果制定驗證方案。商業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)進行持續(xù)的工藝確認，如因變更需要進行再次驗證時，可根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果確定合理的工藝驗證批次。

5.3.4污染和交叉污染

質(zhì)粒產(chǎn)品生產(chǎn)過程中應(yīng)當(dāng)基于產(chǎn)品特性以及工藝流程，采取有效措施防止污染和交叉污染，控制質(zhì)量風(fēng)險，如：

a）宜采用密閉系統(tǒng)進行生產(chǎn)，如發(fā)酵采用密閉式發(fā)酵罐系統(tǒng)。生產(chǎn)過程中有產(chǎn)品暴露的操作時，宜采取合理措施降低操作帶來的污染風(fēng)險，如在生物安全柜中操作等。密閉系統(tǒng)發(fā)生意外開啟或泄漏的，應(yīng)當(dāng)進行風(fēng)險評估并采取有效的應(yīng)急措施；

b）不同品種的質(zhì)粒應(yīng)采用階段性生產(chǎn)方式進行生產(chǎn)，生產(chǎn)品種輪換時應(yīng)按照批準(zhǔn)的清場操作規(guī)程進行清潔和清場，清潔程序應(yīng)經(jīng)過驗證；

c）采用密閉系統(tǒng)生產(chǎn)的，同一生產(chǎn)操作區(qū)域或同一培養(yǎng)箱內(nèi)可同時進行同一品種的不同批次品生產(chǎn)，但應(yīng)當(dāng)采取有效措施避免批間污染及混淆；

d）宜采用一次性使用系統(tǒng)進行生產(chǎn)，尤其是與產(chǎn)品直接接觸的耗材，如菌種培養(yǎng)搖瓶、管道、除菌過濾器等等。如采用重復(fù)使用的設(shè)備及物料，應(yīng)在使用后按照批準(zhǔn)的清潔程序進行清潔及適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測，清潔程序應(yīng)當(dāng)經(jīng)過驗證；

e）不同品種質(zhì)粒純化生產(chǎn)時與產(chǎn)品介質(zhì)接觸的過濾器、中空纖維柱、膜包、層析介質(zhì)等應(yīng)按照品種專用，不得共用，過濾器、中控纖維柱、膜包等一次性耗材的材質(zhì)應(yīng)經(jīng)過溶出析出評估或測試。重復(fù)裝填層析柱應(yīng)對層析柱保存、清洗、安裝工藝進行研究。層析介質(zhì)及膜包等壽命應(yīng)經(jīng)過評估或驗證；

f）含有工程菌的料液、檢測剩余的樣品及廢棄物等，應(yīng)采取適當(dāng)措施滅活后方可移出生產(chǎn)區(qū)域，防止其污染廠房、設(shè)施及產(chǎn)品；

g）采用密閉系統(tǒng)生產(chǎn)的，產(chǎn)品或物料被轉(zhuǎn)入密閉系統(tǒng)時，必須以非暴露的方式（例如通過無菌連接器或密閉轉(zhuǎn)移系統(tǒng)）進行，避免產(chǎn)品或物料暴露于室內(nèi)環(huán)境。如需打開密閉系統(tǒng)（例如進行暴露的無菌操作、安裝過濾器或進行組件連接等），在回到密閉狀態(tài)或者使用前需要進行消毒或滅菌（非無菌環(huán)境下暴露），且應(yīng)對其“回到密閉狀態(tài)”的能力進行必要的確認或驗證；

h）質(zhì)粒最終成品為無菌產(chǎn)品的，無菌生產(chǎn)工藝的驗證可參考《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》無菌藥品附錄、《無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）》的要求，確保其無菌保證水平滿足要求。如采用無菌工藝模擬試驗等方式確認質(zhì)粒無菌生產(chǎn)操作的無菌保障的有效性。

5.3.5混淆和差錯

質(zhì)粒生產(chǎn)過程中宜采取有效的措施避免物料、產(chǎn)品和廢棄物的差錯和混淆，如密封轉(zhuǎn)移、交替操作、定置管理、滅菌與消毒以及傳遞等過程中應(yīng)做好標(biāo)識管理。

5.3.6其他

質(zhì)粒的生產(chǎn)過程中，應(yīng)重點關(guān)注裂解等特殊工序的工藝時限，避免產(chǎn)生額外的殘留物或工藝雜質(zhì)、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。中間產(chǎn)物如需儲存，應(yīng)視情況開展必要的中間產(chǎn)物貯存穩(wěn)定性研究。

5.4物料管理

5.4.1質(zhì)粒生產(chǎn)用物料的管理應(yīng)遵循質(zhì)量風(fēng)險管理的原則，結(jié)合物料的預(yù)期用途、物料的質(zhì)量屬性、供應(yīng)商的資質(zhì)等制定物料風(fēng)險等級分級及控制策略。對于物料的分級，可參考《中國藥典三部》生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制通則中對生物制品原材料及輔料的分級原則，根據(jù)原材料的來源、生產(chǎn)以及對最終細胞治療產(chǎn)品潛在的毒性和外源因子污染風(fēng)險等，結(jié)合質(zhì)粒本身在細胞治療產(chǎn)品中的作用，確定生產(chǎn)用關(guān)鍵原材料的范圍及入廠檢驗和放行的要求。

5.4.2應(yīng)避免使用人源或動物源性材料。如需使用，應(yīng)開展外源因子等安全性相關(guān)的風(fēng)險評估與研究。

5.4.3生產(chǎn)過程中應(yīng)避免使用B-內(nèi)酰胺類抗生素，如需使用其他種類的抗生素，應(yīng)對抗生素的殘留量進行控制和安全性評估。

5.4.4質(zhì)粒發(fā)酵應(yīng)盡可能選擇分析純或更高級別的物料，質(zhì)粒純化及后續(xù)生產(chǎn)工序使用的物料宜選擇藥用級，對于無藥用級別的，應(yīng)參照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》對物料管理的要求，經(jīng)風(fēng)險評估后，選擇適宜級別的物料。

5.4.5下游生產(chǎn)過程中使用的與產(chǎn)品直接接觸的關(guān)鍵一次性耗材，應(yīng)進行適用性和生物安全性風(fēng)險評估，根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果來決定是否需要開展進一步研究或驗證。質(zhì)粒使用的內(nèi)包裝材料，應(yīng)對其密封性、無菌性和相容性進行評估，并考慮其可能存在的核酸酶對質(zhì)粒的影響。

5.4.6供應(yīng)商提供的研究數(shù)據(jù)可作為評估支持材料，如引用供應(yīng)商數(shù)據(jù)，須對數(shù)據(jù)的適用性進行評估。

5.4.7應(yīng)建立質(zhì)粒生產(chǎn)用原材料、內(nèi)包裝材料、關(guān)鍵一次性耗材的質(zhì)量管理流程，如供應(yīng)商質(zhì)量評估、驗收標(biāo)準(zhǔn)、入庫驗收、儲存、有效期/復(fù)驗期管理等。

5.5細菌種子批

5.5.1細菌種子批是生產(chǎn)質(zhì)粒的起始原材料，應(yīng)充分考慮宿主菌的來源、基因型、表型、既往使用經(jīng)驗和生產(chǎn)需求等因素，如使用新型菌株，需關(guān)注其可能引入的額外風(fēng)險。

5.5.2按照《中國藥典三部》生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制通則的要求完成二級或三級細菌種子批的建庫和檢定，主種子批和工作種子批建庫環(huán)境應(yīng)參照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求。對于生產(chǎn)不同質(zhì)粒使用的主種子批和工作種子管理，應(yīng)通過區(qū)分物料編號、標(biāo)簽管理、儲存管理等多種方式，避免不同細菌種子批在儲存或使用過程中發(fā)生混淆或交叉混淆。建庫過程中應(yīng)避免使用B-內(nèi)酰胺類抗生素，如需使用其他種類的抗生素，應(yīng)對抗生素的殘留量進行安全性評估或控制，應(yīng)盡量避免使用人源或動物源的材料。

5.5.3基于細菌主種子批和細菌工作種子批的制備方法，合理設(shè)定細菌種子批的檢定項目。細菌種子批檢定項目一般包括細菌形態(tài)學(xué)鑒別、染色鏡檢、生化特性分析、菌種基因型鑒定、菌種純度、抗性檢查、活菌數(shù)、質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶圖譜分析、質(zhì)粒全序列鑒定、噬菌體檢查等。檢測方法需經(jīng)過研究、確認或驗證。通過質(zhì)量控制應(yīng)確保不存在其它細菌、真菌和噬菌體的污染，以及確保目的基因序列和其他元件序列的準(zhǔn)確性。

5.5.4開展全面的傳代穩(wěn)定性研究，宜根據(jù)質(zhì)粒序列準(zhǔn)確性、質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶圖譜、質(zhì)粒保有率、質(zhì)?？截悢?shù)等研究結(jié)果明確細菌種子批的限定傳代代次。

5.5.5根據(jù)細菌種子批在貯存條件下和時長內(nèi)種子批的活菌數(shù)、質(zhì)粒保有率等研究結(jié)果制定合理的貯存條件和有效期。

5.6工藝控制

5.6.1應(yīng)當(dāng)制定質(zhì)粒生產(chǎn)工藝規(guī)程并經(jīng)過批準(zhǔn)，工藝規(guī)程中應(yīng)明確質(zhì)粒產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（如適用）、生產(chǎn)工藝流程、關(guān)鍵工藝參數(shù)和控制范圍、中間控制項目及控制標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)制定生產(chǎn)操作規(guī)程，對生產(chǎn)操作步驟等進行詳細說明，以確保生產(chǎn)過程的有效運行和有效控制。

5.6.2質(zhì)粒的生產(chǎn)通常以細菌種子批為起始原材料，其工藝分為上游工藝和下游工藝。上游工藝包括種子擴增及發(fā)酵、菌體收獲、菌體裂解等步驟；下游工藝包括層析、超濾/滲濾、除菌過濾及灌裝等步驟，最終制備成質(zhì)粒成品。典型質(zhì)粒生產(chǎn)關(guān)鍵工藝步驟和工藝控制點如下：

a）種子擴增：取工作種子批，復(fù)蘇，使用搖床或生物反應(yīng)器進行逐級擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)至細菌滿足發(fā)酵生產(chǎn)接種要求。培養(yǎng)過程中應(yīng)對培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間及細菌懸液光密度（Optical Density，OD）值等工藝參數(shù)進行監(jiān)控；

b）發(fā)酵生產(chǎn)：通常使用適當(dāng)生產(chǎn)規(guī)模的生物反應(yīng)器進行高密度細菌發(fā)酵培養(yǎng)，收獲菌體懸液。發(fā)酵過程中應(yīng)對接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、pH、溶氧量、攪拌轉(zhuǎn)速、補料培養(yǎng)基組成、補料時間和速率、收獲時間、菌體懸液OD值等工藝參數(shù)進行監(jiān)控；

c）菌體收獲及裂解：發(fā)酵菌體懸液通過高速離心或切向流過濾等方式去除培養(yǎng)上清液和菌體外雜質(zhì)，收集菌體，在一定條件下使細胞部分或者全部破碎進行菌體裂解，將質(zhì)粒、宿主DNA、宿主蛋白、細菌內(nèi)毒素等細胞內(nèi)物質(zhì)釋放到胞外。菌體處理通常采用堿裂解方式，應(yīng)對裂解過程中菌體濃度、裂解液（配方、濃度或pH值）、裂解時間、攪拌轉(zhuǎn)速（如適用）等相關(guān)參數(shù)進行關(guān)注，裂解后進行中和、沉淀（如適用）及澄清處理，去除宿主DNA、宿主蛋白、宿主RNA、細菌內(nèi)毒素等，此過程中還應(yīng)關(guān)注中和緩沖液的組成、加入時間、加入量以及中和完全程度；

d）超濾，滲濾1：對收獲的澄清液進行濃縮洗濾，進一步去除宿主DNA、宿主蛋白、宿主RNA、細菌內(nèi)毒素等。過程中應(yīng)對濃縮倍數(shù)、洗濾倍數(shù)及跨膜壓等參數(shù)進行監(jiān)控；

e）層析純化：采用多步層析步驟提純質(zhì)粒，提升超螺旋比例，去除宿主DNA、宿主蛋白、宿主RNA、細菌內(nèi)毒素等，通常選用凝膠層析、親和層析、疏水層析和離子層析等填料介質(zhì)，利用分子量、特異性結(jié)合、疏水性、電荷等方法進行雜質(zhì)去除。層析過程中應(yīng)對層析柱載樣量、線性流速、洗雜和洗脫條件（pH、鹽濃度等）、收集峰起止點進行監(jiān)控；

f）超濾，滲濾2：對層析收獲液進行超濾濃縮和換液，通過該步驟將質(zhì)粒DNA置換到質(zhì)粒保存液中，經(jīng)濃縮并調(diào)節(jié)至符合目標(biāo)產(chǎn)品濃度后，進行下一步除菌過濾和無菌灌裝。應(yīng)對置換倍數(shù)、跨膜壓、產(chǎn)品濃度等參數(shù)進行監(jiān)控；

g）除菌過濾和灌裝：采用除菌過濾器進行除菌過濾，除菌過濾后在A級環(huán)境下進行分裝。質(zhì)粒最終成品為無菌產(chǎn)品的，質(zhì)粒產(chǎn)品灌裝的全過程應(yīng)當(dāng)保證無菌和避免污染和交叉污染，并進行相關(guān)監(jiān)控，應(yīng)基于風(fēng)險評估的結(jié)果確定灌裝的生產(chǎn)形式和方式，其生產(chǎn)形式和方式應(yīng)經(jīng)過無菌工藝驗證。

5.6.3應(yīng)規(guī)定生產(chǎn)過程中各步驟的工藝時限及過程中物料、中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的儲存條件，并采取有效的管理控制措施確保符合儲存要求。物料、中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品如需轉(zhuǎn)運，應(yīng)當(dāng)對轉(zhuǎn)運條件有明確的規(guī)定，如溫度、時限等，對于有特殊溫度要求的物料、中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的轉(zhuǎn)運，在轉(zhuǎn)運過程中應(yīng)進行相應(yīng)的監(jiān)測并有記錄。

5.6.4生產(chǎn)工藝過程中任何偏離生產(chǎn)工藝規(guī)程的情況均應(yīng)當(dāng)有記錄，應(yīng)對偏差進行評估、調(diào)查并制定糾正和/或預(yù)防措施，有效防止類似偏差的再次發(fā)生。

5.7質(zhì)量控制

5.7.1企業(yè)應(yīng)當(dāng)對質(zhì)粒逐批進行檢驗。一般包括以下項目：理化（外觀、pH）、質(zhì)粒濃度或含量、鑒別（限制性內(nèi)切酶分析、序列鑒定）、純度與雜質(zhì)（A260/A280、超螺旋比例、宿主菌DNA殘留、宿主菌RNA殘留、宿主蛋白殘留、抗生素殘留（如適用）等）、無菌及細菌內(nèi)毒素等。

5.7.2應(yīng)根據(jù)質(zhì)粒在最終的免疫細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)中的功能及安全性等相關(guān)因素，經(jīng)風(fēng)險評估建立合理的質(zhì)粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；可參照《中國藥典》的相關(guān)要求，進行檢測方法的驗證或確認。

5.7.3應(yīng)對質(zhì)粒的穩(wěn)定性進行長期監(jiān)測，選擇合理、敏感的考察項目（如外觀、pH、濃度信量、純度（A2601A280）、超螺旋比例等），并根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)制定或調(diào)整質(zhì)粒的貯存條件和有效期。

5.8包裝與貯存

5.8.1企業(yè)應(yīng)有詳細的規(guī)程規(guī)定質(zhì)粒產(chǎn)品的包裝、貼簽和貯存（如適用）等操作過程，所有操作過程應(yīng)有詳細、完整的記錄。

5.8.2質(zhì)粒產(chǎn)品包裝容器和包裝形式應(yīng)當(dāng)基于風(fēng)險評估的結(jié)果確定，其安全性和密封性均應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)脑u估或驗證，避免產(chǎn)品遭受污染。

5.8.3企業(yè)應(yīng)配備專用的設(shè)備用于質(zhì)粒成品的貯存，并按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求劃分區(qū)域，按品種、批號分區(qū)存放。每個最小包裝上應(yīng)有標(biāo)簽標(biāo)識其名稱、批號、數(shù)量/體積、生產(chǎn)日期、有效期，復(fù)驗期、貯存條件等必要信息。應(yīng)當(dāng)按照有效期或復(fù)驗期貯存。貯存期內(nèi)，如發(fā)現(xiàn)對質(zhì)量有不良影響的特殊情況，應(yīng)當(dāng)進行復(fù)驗。對于貯存過程中發(fā)生的超溫、包裝破損等異常情況，應(yīng)按偏差程序進行處理和評估。

5.8.4貯存區(qū)應(yīng)當(dāng)有足夠的空間，待驗品和合格品可進行分區(qū)或用狀態(tài)標(biāo)識進行管理，放行前應(yīng)按待驗貯存，不合格和退回（如適用）品應(yīng)專區(qū)存放并有明顯的標(biāo)識。

5.8.5貯存設(shè)備應(yīng)進行溫度監(jiān)控，可配備相應(yīng)的溫度監(jiān)控系統(tǒng)。應(yīng)建立出入庫記錄，記錄應(yīng)真實、完整、準(zhǔn)確、可追溯。

5.9運輸

質(zhì)粒產(chǎn)品的運輸和轉(zhuǎn)運的方式應(yīng)有明確的操作規(guī)程進行規(guī)定，運輸?shù)姆绞綉?yīng)進行驗證和確認（如適用），整個運輸過程應(yīng)有完整的記錄。