聚羥基脂肪酸酯生產菌種及發(fā)酵工藝研究進展

摘 要：首先對聚羥基脂肪酸酯（PHAs）發(fā)酵菌種的選育情況及發(fā)酵特性進行比較全面的介紹，對已報道過的發(fā)酵工藝進行系統(tǒng)性綜述、比較及分析。最后，歸納目前利用微生物發(fā)酵生產PHAs存在的問題，并對PHAs發(fā)酵菌種及工藝的未來發(fā)展趨勢及重點研究方向進行展望。

關鍵詞：聚羥基脂肪酸酯；菌種選育；發(fā)酵工藝；高效率；低成本；研究進展

中圖分類號：Q939.97 " " " 文獻標志碼：A

0 引 言

隨著社會經濟的發(fā)展，塑料制品被廣泛應用到日常生產生活中，給人們生活帶來便利的同時，也對環(huán)境造成了不可逆轉的“白色污染”，并且傳統(tǒng)石油基塑料的自然降解過程十分緩慢，一般需要幾十甚至上百年，嚴重影響物質循環(huán)及自然生態(tài)系統(tǒng)，甚至威脅到人類健康。人類對塑料的需求居高不下，預計到2030年，塑料的消耗量將超過7億噸，屆時環(huán)境面臨的壓力會更大［1］。利用綠色環(huán)保的生物可降解塑料來替代傳統(tǒng)石化塑料，是目前解決相關環(huán)境問題的重要途經之一。與傳統(tǒng)塑料相比，生物可降解塑料最明顯的特點是在達到一定使用壽命后，其在自然環(huán)境中可被分解為無污染的H2O、CO2和CH4等小分子物質［2］，從而減少“白色污染”，改善人類生活環(huán)境。

聚羥基脂肪酸酯（polyhydeoxyalkanoates，PHAs）是一種由微生物在細胞內合成的顆粒狀結構的聚合體，其在機體中的作用是儲存能量和充當碳源。作為一種可生物降解和生物兼容性的新型生物材料，PHAs具有氣體阻隔性能好、物理化學性質穩(wěn)定、力學性能和水蒸氣滲透性優(yōu)良等優(yōu)點，因此被廣泛應用于生物醫(yī)療、塑料包裝等各個領域［3］。目前已報道的PHAs類型多達150種以上，豐富的結構類型使PHAs的材料性質復雜多變，如含3～5個碳原子單體的短鏈PHAs（scl-PHAs）具有質地堅硬、易碎、結晶度高、熔點高、玻璃化溫度高等特點；而含6～14個碳子單體的中長鏈PHAs（mcl-PHAs）由于結晶度、熔點和玻璃化溫度均較低、彈性較好，更易于加工應用；部分長鏈PHAs（lcl-PHAs）的單體碳原子數量可達15個以上，其結晶度低、熱穩(wěn)定性高，更適用于高溫加工應用；另外，部分短鏈和中長鏈的共聚物既有短鏈又有中長鏈，因而得到廣泛的應用及研究，如P（HB-co-HV）、P（HB-co-HP）、P（HB-co-HHx）等［4］。

國內外對采用生物工藝合成PHAs的文獻報道較多，技術上也取得了長足的進步，其中有些甚至已進行小規(guī)模的工業(yè)化生產［5］，但缺乏優(yōu)良的發(fā)酵菌種及高效、低成本的發(fā)酵工藝仍是目前制約PHAs規(guī)?；a的重要因素。為了使PHAs生產成本及其生產效率得以改善，研究人員通過自然篩選、誘變、基因工程等育種手段進行優(yōu)良菌種的選育，并對多種發(fā)酵工藝及模式進行探索，并已取得了一定進展［6］。本文對目前主要的發(fā)酵產PHAs菌種及其來源、發(fā)酵特性進行系統(tǒng)地歸納和介紹，并對現有發(fā)酵工藝進行綜述、比較及分析，總結和展望PHAs未來的發(fā)展趨勢和與之相關的關鍵研究方向。

1 PHAs高產菌株選育

為開發(fā)高產PHAs的發(fā)酵菌種，目前研究人員主要通過自然篩選、誘變及基因工程等手段進行優(yōu)良菌種的選育。

1.1 自然篩選

自Lemoigne［7］于1926年首次在巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）中發(fā)現PHAs積累以來，微生物法合成PHAs不斷被研究報道，目前已發(fā)現約有95屬500余種微生物具有PHAs合成能力，其中大多數是從自然界中篩選得到的。這些從自然界篩選得到的菌種表現出不錯的產PHAs能力，如表1所示。其中產堿桿菌屬、甲基桿菌屬、固氮菌屬、假單胞菌屬等屬中表現良好的菌種已被用于工業(yè)生產，但這些微生物菌種均存在一些缺陷，使之發(fā)酵成本一直居高不下。為了降低PHAs的發(fā)酵成本、簡化生產工藝、提高PHAs產品品質、擴大菌種資源來源，目前研究人員主要從以下方面進行研究。

1.1.1 利用廉價碳源產PHAs菌種的篩選

目前產PHAs的微生物大都需要以精制糖（如葡萄糖等）為碳源進行PHAs合成，成本較高。因此，為降低PHAs發(fā)酵成本，研究人員從自然界中篩選能夠利用廉價碳源合成PHAs的野生型菌株。如Chaudhry等［8］從土壤中篩選獲得一株能夠利用相對廉價的玉米油為唯一碳源發(fā)酵產PHAs的野生型假單胞菌（Pseudomonas sp. 1.1），其發(fā)酵時PHAs含量占細胞干重（CDW）的35.36%（質量分數）。Aljuraifani等［16］從土壤中分離的Pseudomonas sp. P 16菌株能分別以大豆糖蜜、米糠為原料合成PHAs，細胞內PHAs含量最高分別可達CDW的91.6%和90.9%。Gowda等［17］利用蘇云芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis IAM 12077）直接以來源穩(wěn)定的淀粉為碳源，獲得的PHAs占CDW的72.8%。Dietrich等［18］以木質纖維素水解液為碳源發(fā)酵來源于甘蔗地的蔗糖伯克霍爾德氏菌（Paraburkholderia sacchari IPT 101 LMG 19450）合成的PHAs產量達到34.5 g/L，產率為0.72 g/L/h。然而，以糖蜜、米糠為碳源存在原料來源不穩(wěn)定的問題，而以玉米油、淀粉為碳源生產PHAs則存在與人爭糧的問題。相對來說，利用來源廣泛且價格低廉的可再生木質纖維素材料（如農作物秸稈和林業(yè)廢棄物）作為生產PHAs的碳源具有廣闊的前景。

1.1.2 高鹽耐受性產PHAs菌種的篩選

PHAs生產過程中的無菌操作增加了生產工藝的復雜性及成本，為了減少工藝的復雜性及降低微生物合成PHAs的無菌操作及高淡水消耗成本，研究人員通過篩選能耐受高鹽、高滲透壓的嗜鹽菌來生產PHAs。由于大部分微生物無法在高鹽環(huán)境下生存，因此嗜鹽菌可在非無菌操作的高鹽環(huán)境下合成PHAs，這將極大地簡化工藝、減少染菌及降低成本。如陶觀寶等［19］在27.5 g/L的NaCl濃度下，采用分批補料策略發(fā)酵中度嗜鹽菌Salinivibrio sp. TGB10獲得的PHAs濃度達27.36 g/L。此外，Park等［20］分離的Halomonas sp. YLGW01菌株在鹽含量為8%的培養(yǎng)基中進行非無菌發(fā)酵，合成的PHAs高達CDW的95.26%，是報道過的耐鹽細菌中PHAs含量最高的菌種。嗜鹽菌能夠在高鹽非無菌條件下生產PHAs而不被雜菌污染，是工業(yè)生產中有前途的候選菌種之一。

1.1.3 不含外膜脂多糖（LPS）產PHAs菌種的篩選

目前通過自然選育獲得了大量PHAs合成菌株，但其中大部分為含外膜脂多糖（LPS）內毒素的革蘭氏陰性菌，LPS的存在限制了PHAs產品在醫(yī)藥、食品包裝領域的應用，因此不含LPS的革蘭氏陽性菌在PHAs生產上更受青睞。一些革蘭氏陽性菌（如芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、紅球菌屬（Rhodococcus）等）均可合成PHAs，尤其是其中的芽孢桿菌因其較強的PHAs合成能力而常被用作優(yōu)良的發(fā)酵菌種［21］。如Mohapatra等［22］從紅樹林中篩選的B. megaterium OUAT 016以葡萄糖為碳源時獲得的PHAs達到62%。此外，來源于紅蟻腸道的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis A102）以蔗糖和酵母浸膏為底物時合成的PHAs達到CDW的87.4%［10］。不含外膜脂多糖（LPS）產PHAs微生物菌種的篩選能夠減少健康安全風險，更有利于PHAs產品在醫(yī)藥、食品包裝領域的應用。

1.1.4 產PHAs真菌的篩選

目前已報道的PHAs生產菌主要為細菌、古生菌，產PHAs的真菌報道相對較少。但自從Desuoky等［23］于2007年首次報道真菌界的小紅酵母（Rhodotorula minuta RY4）具有PHAs合成能力以來，真菌合成PHAs的研究也逐漸被人們關注。如禾本紅酵母（Rhodotorula graminis TISTR 5124）在限制氮、磷供應條件下，合成的PHAs含量最終能夠達到CDW的54.4%［24］。此外，Ojha課題組［10］從海藻中分離出多株合成PHAs的酵母菌，當以香蕉皮為原料時，其中一株畢赤酵母（Pichia kudriavzevii VIT-NN02）積累了含量高達79.68%的PHAs。盡管真菌合成PHAs的報道較少，但其在利用廉價原料合成PHAs方面表現出了一定的潛力，有望成為生產PHAs的候選菌株。

1.2 誘變育種

自然篩選菌株的PHAs產量較低，通常難以直接用作規(guī)?；a的菌種。采用物理法、化學法、物理-化學法對野生型菌株進行誘變可獲得優(yōu)良高產PHAs的發(fā)酵菌種。如Aravind等［25］分別對鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus nectar）和中間克魯瓦氏菌（Kluyvera intermedia）進行紫外誘變、熱誘變及化學誘變，結果顯示化學誘變劑吖啶藍蛋白和溴脲嘧啶處理的菌株積累的PHAs更多。這可能是紫外線的穿透性差、誘變效果不佳，而化學誘變劑與DNA分子間的化學反應可提高基因突變率，增強了誘變效果。此外，物理-化學法復合誘變亦可提高PHAs產量。如Sangkharak等［26］采用紫外線和N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（NTG）復合誘變處理地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis PHAs-007），并以棕櫚油廠的廢水為碳源合成的PHAs產量達19.55 g/L，較野生型提高了3.18倍，PHAs含量達到CDW的88.64%。誘變育種不僅能提高微生物菌種的PHAs產量，還能提升PHAs產品品質。如De Paula等［27］利用紫外誘變處理潘多拉菌（Pandoraea sp. MA03）獲得的P（3HB-co-3HV）結晶度較低且彈性較大。采用誘變方法育種能提高PHAs產量、提升PHAs產品品質，但一般來說篩選的工作量較大，且提升幅度一般都不大，難以達到生產需求。

1.3 基因工程育種

1.3.1 PHAs合成途徑

合成PHAs的菌株中含有與PHAs合成相關的酶，PHA合成酶（PhaCs）作為天然合成途徑中的關鍵酶被廣泛研究。目前已有14條PHAs合成途徑被報道，主要的3條分別為三步合成途徑、脂肪酸β-氧化途徑及脂肪酸從頭合成途徑［28］。豐富的PHAs合成途徑和PhaCs的特異性使PHAs的結構類型更加復雜多變。如三步合成途徑中的短鏈phaC主要控制scl-PHAs的合成：兩個乙酰-CoA依次由β-酮酸硫解酶（PhaA）和乙酰乙酰-CoA還原酶（PhaB）轉化為羥基丁?；?CoA，再由短鏈PhaC聚合成短鏈PHAs，如PHB、PHBV、P（3HB-co-4HB）等［29］。而脂肪酸β-氧化途徑的中長鏈phaC則催化合成mcl-PHAs：脂肪酸β-氧化的中間產物在烯酰-CoA-水合酶（PhaJ）作用下轉換成（R）-3-羥基丁酰輔酶A，再在中長鏈PhaC作用下被催化成mcl-PHAs，如3HHx、3HHp、3HD等［30］。另一條途徑則是：脂肪酸從頭合成的中間產物（R）-3-羥基酯酰ACP經3-羥基脂酰ACP-CoA?；D移酶（PhaG）轉化為（R）-3-羥基酯酰輔酶A，最后在PhaC作用下合成PHAs。研究報道指出，PhaC61-3、PhaC21317是將scl-PHAs與mcl-PHAs結合成共聚物的兩種關鍵聚合酶［31］。

1.3.2 代謝工程調控育種

基因工程技術為降低PHAs生產成本、提高生產效率打開了新思路，并被廣泛用于合成PHAs的基因工程菌株的構建。為提高PHAs產量、獲得優(yōu)良的菌種資源，研究人員根據已掌握的PHAs代謝途徑對合成PHAs菌種及非合成PHAs菌種的代謝途徑進行了改造。

1）代謝工程改造合成PHAs的菌種

目前研究人員對產PHAs微生物的代謝途徑進行了改造，通過將代謝流引向PHAs合成、增加底物利用率及擴大微生物積累PHAs的空間來提高PHAs產量。如凌晨等［32］通過阻斷電子轉移黃素蛋白操縱子（etf）操縱子編碼的電子轉移黃素蛋白亞基α和β電子傳遞途徑將代謝流引向PHAs的合成，使得PHAs的胞內積累量達到CDW的90%。調控PHAs合成相關基因能提高PHAs產量，但通常不利于細胞生長。而陳勇等［33］利用具有Pporin-194啟動子的藍嗜鹽單胞菌（Halomonas bluephagenesis TY194）進行研究發(fā)現，異檸檬酸裂解酶基因（icl）和琥珀酸脫氫酶組裝因子（sdhE）敲除株的細胞生長、PHAs產量明顯提高，且CDW達到6.3 g/L。此外，Harada等［34］構建的Asp171Ser、Asn149Gly雙突變體增強了PHAs合成酶（PhaCAC NSDG）識別3HHx的能力，促進了PHAs合成。對PHAs積累空間和粒徑相關功能的基因進行改造能促進菌株胞內PHAs積累。如王建莉［35］構建的Pseudomonas putida KT2442脂多糖（LPS）精簡工程菌株，增大了菌株細胞的體積，并將PHAs含量約提高25倍，占CDW的82.4%。

2）代謝工程改造非PHAs合成菌種

為了獲得高產PHAs菌種，研究人員向不含PHAs降解酶（PhaZ）的非PHAs生產微生物體內引入PHAs異源合成路徑，從而便于菌株細胞內PHAs的高濃度積累。如文獻［36］向不含phaZ基因的大腸桿菌中引入PHAs合成基因操縱子（phaCAB），利用CRISPRi系統(tǒng)調控phaC基因活性，最終將PHAs產量控制在約75.21%。而文獻［37］在構建的工程菌株中引入phaCAB操縱子的同時，分別過表達phaA、phaB、phaC基因，其結果表明過表達phaB基因更利于PHAs合成，且產量達16.8 g/L，占CDW的74%。

2 PHAs發(fā)酵性能評價

2.1 純菌發(fā)酵

研究PHAs合成的工藝眾多，但工業(yè)上主要利用純菌進行發(fā)酵。為了探究PHAs規(guī)?；a的可能性，研究人員對產PHAs微生物進行了搖瓶、發(fā)酵罐及中試規(guī)模實驗的研究，如表2所示，搖瓶發(fā)酵門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina PSU）獲得的PHAs含量達到CDW的79.7%［38］。鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator）、真氧產堿桿菌（Ralstonia eutropha）副球菌（Paracoccus sp. LL1）在發(fā)酵罐中發(fā)酵合成的PHAs含量均達70%以上［39-41］。此外，Schmid等［42］利用B. megaterium在生物反應器中發(fā)酵合成的PHAs產量和CDW分別為12 g/L和20.4 g/L，在中試規(guī)模實驗中的PHAs產率達0.2 g/（L·h），證明了工業(yè)生產的可能性。Cupriavidus sp. USMAA1020在供氧充足的中試規(guī)模下發(fā)酵，合成了6.5 g/L的PHAs，占CDW的63%［43］。純菌發(fā)酵在搖瓶、生物反應器及中試規(guī)模的PHAs合成實驗為大規(guī)模生產提供了一定的工藝參數，并顯示了各菌種在工業(yè)生產中的潛力。

2.2 混合菌種發(fā)酵

利用混合菌種進行發(fā)酵能降低雜菌污染風險、擴大碳源選擇范圍，是高效、低成本合成PHAs的重要策略。利用菌株間的共生或互生關系構建混合菌發(fā)酵體系，可克服中間產物積累過盛造成的終產物積累少的問題。為獲得高產PHAs的混合菌發(fā)酵模式，研究人員對以下幾種發(fā)酵模式進行了研究。

2.2.1 PHAs合成菌種互相組合發(fā)酵

目前，研究最多的混合菌模式是產PHAs菌株的相互組合。如Munir等［46］利用具有PHAs合成能力的Bacillus sp. CS8與Pseudomonas sp. ST2共培養(yǎng)，PHAs的產量和底物利用率均較單一菌種發(fā)酵合成的高。此外，由于芽孢桿菌可通過產生抗生素、抗菌劑及形成孢子的方式耐受不利條件，是混合菌發(fā)酵中的有力競爭者。如鄭冰心［47］將Bacillus sp. 1175與洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia WN-H41）在限氮條件下進行共培養(yǎng)，獲得的PHAs產量達7.668 g/L，是單一菌種發(fā)酵產量的6.15倍。

2.2.2 非PHAs合成菌種與PHAs合成菌種的混合發(fā)酵

為提高底物利用率及PHAs產量，研究人員對非PHAs合成菌種與PHAs合成菌種的混菌組合進行了研究。非PHAs合成菌株將底物轉化為PHAs合成菌株能夠利用的碳源，后者再以該碳源為原料在胞內積累PHAs。如Soto等［48］利用此模型進行混合菌發(fā)酵產PHAs，提高了麥草水解液中用于PHAs合成的糖得率，最終合成PHAs達到9.4 g/L，占CDW的83.4%。此外，研究者將惡臭假單胞菌（Pseudomoas putida KT2440）分別與大腸桿菌、釀酒酵母混合發(fā)酵，最終合成PHAs產量分別達4.81、4.57 g/L，產量均較純菌發(fā)酵的高［49］。

2.2.3 活性污泥中混合菌群發(fā)酵

為實現活性污泥的資源化利用及降低PHAs合成成本，研究人員對有機質和微生物種群豐富的活性污泥合成PHAs進行了研究。如表3所示，污泥中富集的混合菌種在限磷條件下發(fā)酵，獲得的PHAs含量達到CDW的51%［50］。此外，賈倩倩等［51］的報道指出，野生型菌團S-150在實驗室規(guī)模下利用模擬污泥液合成的PHAs含量為59.18%，而中式規(guī)模下其含量為59.47%，這顯示了混合菌規(guī)?；aPHAs的可能性。活性污泥中的混合菌群在發(fā)酵合成PHAs方面具有與純菌發(fā)酵相似或者更高的潛力。

3 PHAs發(fā)酵模式

為提高菌株發(fā)酵合成PHAs的效率、降低發(fā)酵成本，目前，國內外學者對兩步法、分批補料、充盈-饑餓交替、連續(xù)發(fā)酵、固體發(fā)酵等模式生產PHAs進行了研究。雖然這些發(fā)酵模式各具特色和優(yōu)點，但也存在一些不足，通常要根據菌株特點、發(fā)酵規(guī)模、原料底物等選擇適宜的發(fā)酵工藝。

3.1 兩步法發(fā)酵

PHAs主要是在非碳源限制條件下積累的，而營養(yǎng)限制又會影響菌體量的增長，因此采用兩步法在營養(yǎng)充足時先富集合成PHAs的菌種，當非碳源營養(yǎng)物質耗盡后，菌株再利用過剩碳源合成PHAs，以提高PHAs產量。如Fahima等［52］先富集菌體，再轉移到氮源限制條件下發(fā)酵，合成PHAs濃度達到2.9 g/L，占CDW的46%，產量較一步法的高；Saha等［53］以兩步法發(fā)酵褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum MAL-201），獲得的PHB和P（3HB-co-3HV）分別占CDW的70%和67%。為了提高PHAs產量、創(chuàng)造適宜PHAs積累的非碳源限制條件，研究人員常在第二步發(fā)酵過程中添加外源刺激物。如De Paula等［27］添加丙酸、戊酸進行兩步法發(fā)酵時，使菌株Pandoraea sp. MA03積累的PHAs產量從4.3 g/L提高到9 g/L。兩步發(fā)酵法可降低雜菌污染概率、不會產生菌種老化等問題，但存在設備利用率低、非PHAs合成時間較長的問題。

3.2 分批補料發(fā)酵

分批發(fā)酵操作簡單、在工業(yè)生產中應用廣泛，但營養(yǎng)物質（如碳源等）會隨發(fā)酵的進行而不斷被消耗，并產生大量副產物，不利于菌株積累PHAs，因此需向發(fā)酵體系中分批補充營養(yǎng)物質、排出發(fā)酵產物，以提高PHAs產量。為了提高PHAs產量、克服有機酸毒性、降低發(fā)酵成本和有毒代謝物的積累，研究人員對分批補料合成PHAs工藝進行了研究。如表4所示，李孟醒等［54］分批補充葡萄糖、木糖、阿拉伯糖提高了PHAs產量。Huschner等［55］以木質纖維素為原料制備的水解液為底物，采用分批補料策略發(fā)酵，獲得的PHAs產量達到112.4 g/L，占CDW的83.3%，并克服了水解液中有機酸的細胞毒性。Wisuthiphaet等［56］以廉價660-Brix糖漿為補料，將發(fā)酵成本降低了77%。Karasavvas等［57］補充蔗糖、硫酸銨降低體系中有毒物質（如乳酸、甲酸）的濃度。然而以葡萄糖、木糖、蔗糖等精制糖為補料，存在成本較高的問題，而利用相對廉價的60-Brix糖漿為原料，可降低生產成本。分批補料能夠減少副產物的積累、克服木質纖維素水解液中有機酸的細胞毒性、提高PHAs產量，但多次補料不利于PHAs積累，且存在一定的非PHAs積累時間和補料過程增加染菌可能性的問題。

3.3 充盈-饑餓交替發(fā)酵

在營養(yǎng)物質豐富的“充盈”模式下，產PHAs微生物消耗了大量碳源供菌體生長，隨后造成發(fā)酵體系中碳源過剩而其他營養(yǎng)物質缺乏而轉為“饑餓”模式，并在該模式下利用過剩碳源合成PHAs，當消耗一定碳源后，再向發(fā)酵體系中添加營養(yǎng)物質創(chuàng)造“充盈”環(huán)境共菌體生長，如此“充盈-饑餓”交替以提高PHAs產量。如Naresh等［62］研究發(fā)現，營養(yǎng)和氧限制的“饑餓”模式更利于PHAs的積累，其產量達到2.65 g/L，約為“充盈”模式下的10倍，且底物利用率高達83%。研究人員在“饑餓”模式下添加醋酸鹽，并限制磷供給，將PHAs的含量從60%提升到84%［63］。然而，充盈-饑餓模式存在較長的非PHAs生產時間，且對混合菌積累PHAs的促進作用較小。

3.4 連續(xù)發(fā)酵

為了獲得質量穩(wěn)定的產品、提高發(fā)酵效率及設備利用率、簡化發(fā)酵工藝，研究人員向連續(xù)發(fā)酵體系中添加營養(yǎng)物質，并以相同速度排出部分發(fā)酵液，恒定發(fā)酵液體積進行PHAs生產。將工藝設計、菌株、底物動力學特性結合可增產PHAs。如Rueda等［64］縮減生長反應器中水力停留時間（hydraulic retention time，HRT）并增加積累反應器中的HRT，顯著提高了PHAs產量。Koller等［65］采用連續(xù)發(fā)酵獲得的高結晶、高彈性PHAs彌補了分批補料產品質量不可預測、產量低的缺點。盡管嗜鹽菌在連續(xù)發(fā)酵中有一定潛力，但相關報道較少。此外，連續(xù)發(fā)酵存在菌株易退化，且底物利用率較低，后續(xù)還需進一步研究。

3.5 其他發(fā)酵方式

固體發(fā)酵是微生物在低濕環(huán)境下利用固態(tài)底物基質進行發(fā)酵的過程。利用固態(tài)發(fā)酵模式生產PHAs可降低能耗，如Mohapatra等［22］采用固態(tài)發(fā)酵巨大芽孢桿菌產PHAs，最大限度地減少了能耗，獲得的PHAs占CDW的62%，且產物韌性好、抗沖擊性強、細胞毒性極小，可適用于生物醫(yī)學。Martínez等［66］采用固態(tài)酶解處理啤酒廢谷物、葡萄廢渣、橄欖固體廢棄物為底物進行發(fā)酵，獲得PHAs分別占CDW的54%、41%和31%，均較純固體發(fā)酵的產量高。固體發(fā)酵耗能低、發(fā)酵過程容易控制、對設備要求低，將酶解和固態(tài)發(fā)酵結合可提高底物利用率及PHAs產量，但底物轉化率低及代謝熱難消除的問題限制了其應用。此外，研究人員根據產PHAs微生物自身特點，對其他發(fā)酵模式進行探究。如Fradinho等［67］提出微生物直接從陽光中獲取能量生產PHAs的光養(yǎng)混合培養(yǎng)（phototrophic mixed culture，PMC）模式。Almeida等［68］也證實了PMC產PHAs的可行性，但產物積累時間較長。此外，在好氧-厭氧動態(tài)發(fā)酵模式中：菌體在氧充足時生長，隨后在限氧條件下積累PHAs。如劉長莉等［69］通過調控氧供應，發(fā)酵合成了性能穩(wěn)定的PHAs。

4 總結與展望

PHAs作為一種應用前景廣闊的生物可降解材料，是石油基塑料的潛在替代品。但利用微生物法生產PHAs目前最大的障礙是生產成本過高，遠高于普通石油基塑料，使相應的產品缺乏市場競爭力。而其中制約PHAs生產成本最主要的兩大因素分別是缺乏優(yōu)良的發(fā)酵菌種和高效、低成本的發(fā)酵工藝，具體存在的問題有：①目前已知的大多數PHAs合成菌種產量較低，難以滿足工業(yè)生產要求；②大部分的菌種僅能利用純糖類物質來合成PHAs，難以高效利用廉價原料（如甘油、非糧淀粉、廢油脂、木質纖維素等），造成發(fā)酵成本居高不下；③純菌發(fā)酵時一般效率較低、易染菌、對原料要求較高；④混合菌發(fā)酵目前研究較多，但真正能應用于工業(yè)化生產的混合菌組合仍較少，且混菌發(fā)酵的相關機理研究較少，菌與菌之間的互作機制仍需進一步研究；⑤目前眾多發(fā)酵模式中很少是根據不同PHAs發(fā)酵菌種的特點來進行精細化設計的，這也導致很難充分發(fā)揮菌種的發(fā)酵性能。

基于目前PHAs發(fā)酵存在的這些問題，未來可從以下幾個方面加以解決：①通過自然篩選、誘變育種及基因工程等手段獲得更多的優(yōu)良菌種資源，進一步提高菌種的產量及發(fā)酵性能；②有針對性的開發(fā)能夠利用廉價原料合成PHAs的菌種資源，擴大原料利用范圍，從而降低生產成本；③易培養(yǎng)且抗染菌菌種的開發(fā)，如目前的耐高鹽環(huán)境菌種的研究是一個非常有意思的嘗試，可進一步擴大到耐高酸、堿性等極端環(huán)境的菌種資源的開發(fā)、降低染菌風險，從而實現低成本的非無菌環(huán)境培養(yǎng)；④混菌發(fā)酵具有發(fā)酵效率高、易培養(yǎng)、能利用復雜原料等優(yōu)點，具有廣闊的應用前景，今后需進一步嘗試更多組合的混菌發(fā)酵，研究混菌發(fā)酵時各菌之間的互作機制，在實踐及理論上更深一步探究；⑤根據不同PHAs發(fā)酵菌種的特點來進行精細化設計發(fā)酵模式，從而充分發(fā)揮菌種的發(fā)酵性能。通過在這些菌種及工藝方面的進一步深入研究，有望提高發(fā)酵效率、擴大可利用原料來源、降低生產成本，從而真正實現PHAs的規(guī)?；a，解決目前由石油基塑料所引起的一系列環(huán)境問題。

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RESEARCH PROGRESS OF STRAINS PRODUCTED POLYHYDEOXYALKANOATES （PHAs） AND

FERMENTATION TECHNOLOGY

Long Tingting1，Zhuang Xinshu2，Zhou Guixiong1，Weng Qingbei1，Fang Zheng1，Wu Qingshan1

（1. School of Life Sciences， Guizhou Normal University， Guiyang 550025， China；

2. Guangzhou Institute of Energy Conversion， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510640， China）

Abstract：Firstly， this article comprehensively describes the breeding and fermentation characteristics of Polyhydroxyalkanoates （PHAs） fermentation strains， and then provides a systematic summary， comparison and analysis of reported fermentation processes. Finally， the issues concerning microbial fermentation for PHAs production were summarized， and the future development trends and key research directions regarding PHAs fermentation strains and processes were prospected.

Keywords：polyhydeoxyalkanoates； strain breeding； fermentation technology； high efficiency； low-cost； research progress