視網膜中央動脈阻塞動物模型的研究進展

雷震，張歡，吳松笛，2，3

視網膜中央動脈阻塞（central retinal artery occlusion，CRAO）是一種嚴重危害視力的急性缺血性眼病，因血栓形成或栓子栓塞等原因導致視網膜內層血供障礙，被視為“視網膜卒中”[1-2]。CRAO的發(fā)病率約為1/10 000，多發(fā)生于具有心腦血管疾病危險因素的中老年人群，僅有極少數患者在自發(fā)狀態(tài)下能獲得功能性視力恢復[1，3]。CRAO可分為4種類型[1]：非動脈炎性CRAO、保留睫狀動脈的非動脈炎性CRAO、動脈炎性CRAO和短暫性視網膜缺血發(fā)作。睫狀動脈對視網膜循環(huán)具有一定的保護作用。有研究表明，除保留睫狀動脈的CRAO外，CRAO持續(xù)約4 h會導致嚴重的不可逆的視網膜損傷，且CRAO時間越長，不可逆損傷的范圍越廣泛[4]。目前使用的CRAO動物模型的造模方法主要包括光化學法、高眼壓法、血管結扎法、血管收縮劑法和介入栓塞法等，各具特點也均有一定的局限性[5]。本文綜述了CRAO動物模型的造模方法和研究進展，以期為CRAO發(fā)病機制和病理生理機制研究以及臨床治療方法探索提供參考。

1 實驗動物的選擇

用于構建CRAO動物模型的動物主要有嚙齒動物、靈長類動物和其他哺乳類動物。嚙齒動物中鼠類的應用較為廣泛，常用的品系有Wistar大鼠、SD大鼠和C57BL/6小鼠，其視網膜供血情況和血管分布與人類較為相似，且成本低、繁殖周期短；不足之處在于眼球較小，實驗操作較難。靈長類動物（如恒河猴）的視網膜及血管結構與人類極為相似，在研究CRAO視覺功能方面具有較高的生物學相關性和疾病預測性，但實驗成本高，且受到相關倫理問題限制，實驗動物應用有限[6]。豬的視網膜解剖結構與人類的視網膜相似，具有視桿細胞、視錐細胞、中央凹和雙重血液供應。與人類不同的是，豬眼的血液供應來自頸外動脈，而不是頸內動脈[7]。兔眼主要依賴脈絡膜動脈維持視網膜代謝，與人類視網膜供血情況不同，實驗中應用較少[8]。

2 動物模型的造模方法

2.1 光化學法 孟加拉紅是一種光敏染料，在激光照射下釋放活性氧，導致血管內皮損傷、血小板活化，隨后在光照部位形成腔內血栓。通過靜脈注射孟加拉紅，然后使用氬綠色激光或YAG激光照射視盤處的視網膜中央動脈（central retinal artery，CRA），術后視網膜及周圍部位變白并水腫表明造模成功[9-11]。Zhang等[10]建立了一種模擬人類CRAO臨床特征的CRAO大鼠模型。激光參數如下：直徑75 μm，波長532 nm，功率0.1 W。激光照射后視網膜變白、水腫，3 h后視網膜分支動脈出現再灌注現象，24 h后幾乎無分支動脈阻塞；TUNEL檢測：6 h后，CRAO大鼠眼中視網膜神經節(jié)細胞（retinal ganglion cell，RGC）和內核層（inner nuclear layer，INL）凋亡細胞數量明顯增多，外核層（outer nuclear layer，ONL）凋亡細胞被首次觀察到；24 h后，RGC、INL和ONL的凋亡細胞數量達到峰值。Kramer等[11]分析了誘導小鼠CRAO模型后視網膜和血清中細胞因子的變化。激光參數如下：波長514 nm，光斑大小200 μm；0.1 W誘導“中度”CRAO，0.15 W誘導“重度”CRAO；分別采用反轉錄PCR和Wester n Blot檢測巨噬細胞炎癥蛋白-2（m a c r o p h a g e inflammatory protein-2，MIP-2）、IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平，ELISA法檢測血清細胞因子水平。在視網膜中，MIP-2和IL-6的mRNA表達在誘導CRAO后3 h時下降，隨后上升，并在12～24 h時達到峰值，7 d時顯著降低，TNF-α的mRNA表達在3 h時增加，7 d時下降到對照組水平；在蛋白水平上，所有細胞因子都與各自的基因表達有著相似的規(guī)律。在血清中，MIP-2和TNF-α較早達到峰值，在12 h時下降到對照組水平，IL-6在3～12 h時升高，在24 h時下降。

光化學法可以較精準地控制阻塞血管的位置和程度，實現局部、可重復的血管阻塞，提高實驗結果的可比性和可靠性。相較于其他方法，光化學法誘導的血栓形成較慢，實驗過程中通過調整光敏劑的量和激光參數來加快血栓形成的速率，但實驗中引入了光敏劑和光照刺激損傷血管內皮等非生理因素，影響實驗結果的解釋。激光參數過高也會損害視網膜層和脈絡膜，造成血管通透性下降，導致動脈閉塞不全[12-13]。

2.2 高眼壓法 高眼壓法通過向前房注射液體引起短暫性視網膜動脈阻塞，通過調整輸液瓶高度實現眼內壓可控調節(jié)，其病理特征與CRAO患者的病理特征幾乎相似[14]。Russo等[15-16]將生理鹽水注入小鼠右眼前房使眼壓達到90～120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）持續(xù)1 h，可觀察到視網膜對紅光反射消失，虹膜變白。熒光顯微鏡觀察到自噬反應主要發(fā)生在視網膜內層，6 h時自噬受體水平顯著降低，24 h后觀察到自噬體積累；缺血后采用Western Blot檢測到Akt激酶在Thr308上的磷酸化水平顯著降低，再灌注1 h和6 h后，Akt激酶的磷酸化水平持續(xù)升高，這一結果可能與體內系統(tǒng)中細胞凋亡相關。San Cristóbal Epalza等[17]在大鼠眼前房插入導管，另一端連接裝有生理鹽水的壓力袋，用于提高眼壓至150 mmHg，持續(xù)1 h，在缺血期間，每10 min采用直接檢眼鏡檢查CRA變白情況，血壓恢復后再灌注1 h，視網膜組織學評估顯示視網膜組織損傷、細胞質腫脹。

高眼壓法是誘導動物視網膜缺血的常用方法，相較于其他造模方法操作相對簡單、易于重現，不涉及化學物質和復雜的手術，實驗中可相對容易地控制高眼壓的程度和持續(xù)時間。高眼壓法主要集中于眼部，難以模擬全局性缺血條件，病理機制更類似于急性青光眼，且CRAO后伴隨著視網膜血管破裂、RGC的死亡等，導致神經元細胞的機械損傷，對實驗結果有一定影響[17]。

2.3 血管結扎法

2.3.1 視網膜中央動脈結扎法 對動物進行側眼眶切開手術，在視神經入口附近，剝離CRA、靜脈和視神經鞘，用尼龍線結扎CRA，持續(xù)一段時間后解除結扎，熒光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）結果顯示視盤蒼白化，視網膜層發(fā)生了明顯的形態(tài)學變化[18]。Hayreh等[19]建立了結扎CRA的恒河猴模型，對恒河猴進行側眼眶切開手術，在視神經入口附近，剝離CRA、靜脈和視神經鞘，用血管鉗夾持CRA，97～300 min后解除結扎，眼底照相和FFA結果顯示，閉塞時間與視網膜神經纖維層能見度下降和視盤蒼白度升高顯著相關。Prasad等[20]對大鼠CRA結扎誘導視網膜缺血，剝離結膜和外直肌后，鈍性剝離暴露左側視神經，剪刀縱向切開包圍視神經的視神經鞘，暴露中央動脈，用10-0尼龍縫線結扎CRA，缺血30 min和90 min后解除結扎；缺血再灌注后3 h～7 d，大部分視網膜層發(fā)生了明顯的形態(tài)學變化；再灌注12 h時，RGC明顯缺失；再灌注24～48 h時，INL細胞大量丟失；7 d后視網膜厚度減少，可見明顯的視網膜退行性變。反轉錄PCR結果顯示，再灌注時間至12 h后，Akt1、Akt3、caspase-3、caspase-9等凋亡相關基因顯著激活。

視網膜中央動脈結扎（central retinal artery ligation，CRAL）模型可以在不考慮眼壓增加的影響下評估視網膜缺血，更接近于人類CRAO后生物學特征。實驗過程中可通過精確控制結扎的位置和時間，使實驗具有可控性和重復性。在Kwon等[21]的研究中，CRAL后，89%的眼睛在血管造影中顯示出不同數量的殘余視網膜循環(huán)；閉塞少于100 min，只產生很少或沒有產生明顯的視網膜損傷；閉塞105～240 min，產生不同程度損傷；閉塞超過240 min產生不可逆的永久性神經損傷。多個再灌注期CRAL后的組織學檢查顯示，相較于其他模型，CRAL后觀察到的視網膜變性更緩慢[22]。

2.3.2 翼腭動脈和頸外動脈同時結扎法 翼腭動脈是頸內動脈的分支之一，僅結扎翼腭動脈或頸外動脈不能有效阻斷視網膜血液灌注，而同時結扎翼腭動脈和頸外動脈會阻斷眼動脈血液供應，影響視網膜血液循環(huán)[23-24]。翼腭動脈和頸外動脈同時結扎法的大致步驟如下：暴露小鼠頸總動脈，分離并結扎頸外動脈，阻斷眼動脈和頸外動脈血管網的吻合，切開頸內動脈，尼龍線結扎翼腭動脈，一段時間后解除結扎，顯微鏡下可觀察到眼底變白，CRA閉塞[25]。Ogishima等[26]同時結扎小鼠的翼腭動脈和頸外動脈誘導短暫性局部視網膜缺血，缺血3 h、5 h后，解除結扎，激光散斑血流成像結果顯示，缺血3 h、5 h，眼部血流量分別減少39%和61%；眼底照相結果顯示小鼠眼底動脈和靜脈血管明顯變窄，幾乎無動脈血流；視網膜電圖（electroretinogram，ERG）結果顯示，a波、b波和振蕩電位振幅以缺血時間依賴性方式顯著降低。Lelong等[27]建立了一個短暫性視網膜缺血模型，缺血15 min、30 min或60 min后解除結扎。熒光顯微鏡檢測顯示，CRA及其分支無血流；ERG結果顯示，術后28 d，缺血30 min導致a波和b波振幅顯著減小；反轉錄PCR結果顯示，Hsp 70的mRNA水平在再灌注1 h后升高至3.4倍，28 d后，Hsp 70的mRNA水平減半。該動物模型具有重現性和可逆性，不會造成血眼屏障破裂、視網膜機械性損傷和對側眼病變，引起類似于頸動脈疾病的視網膜組織學損傷和功能缺陷[28]。

2.3.3 單側頸總動脈結扎法 單側頸總動脈結扎法的優(yōu)勢在于，結扎單側頸總動脈，引起相應側的眼部缺血。實驗過程中可以使用同一動物的左眼和右眼進行比較，減少動物視網膜循環(huán)條件的變化和個體間的差異。單側頸總動脈結扎法的大致步驟如下：麻醉小鼠，切開小鼠頸部皮膚，鈍性分離肌肉組織，游離出單側頸總動脈并結扎[29]。Lee等[30-31]研究非諾貝特對小鼠眼缺血模型中視網膜功能的保護作用，術前小鼠口服非諾貝特，每天1次，連續(xù)4 d，術后2 d一次；神經膠質纖維酸性蛋白抗體標記檢測顯示，未給藥組14 d后右側視網膜膠質細胞增生；TUNEL檢測顯示，右側視網膜在第7天檢測到凋亡細胞；光學相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）檢測結果顯示，給藥組14 d后視網膜厚度無明顯變化；ERG結果顯示，給藥組7 d后可抑制b波下降，且在12 d后有明顯的保護作用，a波上升；Western Blot檢測結果顯示，非諾貝特可輕微抑制視網膜突觸素下降，但是沒有明確闡明突觸素的表達減少會直接導致視網膜功能障礙。

2.3.4 雙側頸總動脈結扎法 雙側頸總動脈結扎是誘發(fā)慢性眼缺血的一種方法。結扎雙側頸總動脈，部分來自椎動脈的血液可通過Willis環(huán)彌補視網膜供血不足。雙側頸總動脈結扎法的大致步驟如下：矢狀切開大鼠頸部，暴露雙側頸總動脈，分離周圍的迷走神經和伴行靜脈，尼龍線結扎雙側頸總動脈；顯微鏡下可觀察到視網膜血流減慢，視網膜各組織層變??；ERG結果顯示b波振幅明顯降低[32]。Qin等[33]建立大鼠雙側頸總動脈結扎模型，觀察視網膜功能和形態(tài)變化，眼底照相和FFA結果顯示，視網膜動脈硬化，靜脈輕度擴張，7 d后視網膜血液循環(huán)速度減慢；ERG結果顯示，7 d后a波、b波振幅顯著降低；視網膜損傷評估結果顯示，視網膜各組織層變薄，RGC出現凋亡現象。Lee等[34]構建了瞬時雙側頸總動脈阻塞小鼠視網膜缺血模型，結扎右側頸總動脈，對左側頸總動脈采用血管鉗夾持2 s。ERG結果顯示，右眼第3、第7天的b波振幅明顯降低，a波振幅無明顯變化，左眼無a波和b波振幅變化；OCT檢測結果顯示，結扎14 d后，右眼視網膜變厚，左眼視網膜厚度與對照組相比無差異。

頸總動脈結扎引起全腦的血液供應減少，包括眼和腦部的供血，使用此方法需要考慮全腦效應。永久性雙側頸總動脈結扎適用于誘導大鼠眼缺血模型。大鼠Willis環(huán)結構良好，而小鼠Willis環(huán)內缺乏后交通動脈，會造成小鼠較高的死亡率[35]。誘導小鼠瞬時雙側頸總動脈結扎，閉塞時間直接關系到實驗小鼠的存活率。小鼠品系是誘導瞬時雙側頸總動脈結扎致視網膜缺血的另一重要因素，應用其他品系小鼠時需對血管閉塞時間進行調整。

2.4 血管收縮劑法 內皮素-l（endothelin-1，ET-1）是一種有效的血管收縮肽，對包括人類在內的各種物種的血管有收縮作用[36]。Takei等[37]研究ET-1對視網膜收縮的劑量-反應關系和視網膜血管短暫性完全阻塞時ERG的變化，ET-1劑量為0.1 nmol是引起兔眼視網膜動脈阻塞的閾值，注射1 nmol后熒光檢測結果顯示阻塞時間為50～70 min。ERG結果顯示，a波振幅不受影響，b波振幅上升，振蕩電位振幅下降，這種現象說明視網膜缺血是由血管收縮引起的而非脈絡膜缺血所致，該模型適用于研究內皮素受體在眼內循環(huán)中的調控機制。相較于其他模型，血管收縮劑法的操作相對簡單，可通過精確地控制收縮劑的濃度和注射速度提高實驗的可控性。然而，該方法引入了外源性藥物，帶入一些非生理性因素，將影響研究結果的解釋。

2.5 介入栓塞法 以往采用玻璃或乳膠微球注入動物頸動脈栓塞CRA，但這些模型無法很好地模擬人類疾病。Morén等[38]經豬股動脈插管至頸外動脈后，采用兩種不同的閉塞方法，一種是球囊導管引入眼動脈后采用充氣球囊暫時性阻塞睫狀動脈，多焦視網膜電圖記錄結果顯示，N1波和P1波振幅下降，潛伏期延長；另一種是注射導管引入睫狀動脈或視網膜動脈，注射非黏性液體栓塞劑實現永久性阻塞，多焦視網膜電圖記錄結果顯示，N1波和P1波振幅顯著下降，間接檢眼鏡檢查結果顯示兩種方法均可觀察到視網膜動脈和視網膜變白。

介入栓塞法通過引入血栓來模擬CRAO，有助于研究與CRAO相關的生物學效應。實驗過程中可以控制栓塞物質的類型、大小、注射速度等參數，以提高實驗的可控性。然而該方法手術較為復雜，需要高水平的血管神經介入技能。隨著神經介入技術的快速發(fā)展，這一造模方法將可能會得到更多應用。

3 總結

CRAO動物模型的構建對研究疾病的發(fā)病機制和評估有效的治療策略均具有重要意義。理想的CRAO動物模型應包含人類CRAO所具有的特征，但由于人與動物在血管解剖學上的差異，以及模型動物還缺少CRAO患者相關的一些臨床合并癥等不足，目前的CRAO動物模型存在一定的局限性。研究者需要根據研究目的和實驗室條件等綜合因素，選擇和建立適合的實驗動物模型，包括動物選擇、造模方法及相關表征等。近年來，隨著研究者對疾病認識的不斷深入和血管神經介入技術水平的提升，CRAO動物模型的構建有望被進一步推動和優(yōu)化，從而為嚴重危害視力的血管神經眼科疾病的診治提供更多依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。