牙髓再生中根管消毒藥物的濃度研究及進展

方 卉 李全利

2016年，美國牙髓病學者學會（American association of endodontist， AAE）將牙髓再生定義為：一種通過生物學手段替代受損牙齒結(jié)構(gòu)（如牙髓-牙本質(zhì)復合體、牙根結(jié)構(gòu)和細胞等）的治療方法。牙髓再生途徑可以分為兩類：一種是基于外源性干細胞移植技術的有細胞再生性牙髓治療，另一種是基于內(nèi)源性干細胞歸巢技術的無細胞再生性牙髓治療［1］。 其中無細胞再生性牙髓治療是目前學者們認為更有可能實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的再生方式［2］。它是通過誘導根尖周內(nèi)源性干細胞向根管內(nèi)遷移、增殖和分化，以實現(xiàn)牙髓牙本質(zhì)復合體的再生?？赡芗毎麃碓窗ㄑ浪韪杉毎╠ental pulp stem cells， DPSCs）、根尖乳頭干細胞（stem cells from apical papilla， SCAP） 和骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BM-MSCs） 等［3］。

牙髓再生治療的成功除了需要干細胞的參與外，還離不開良好的根管系統(tǒng)感染控制。但是，近年來一系列的研究顯示，高濃度的根管消毒糊劑具有明顯的干細胞毒性，會影響牙髓再生中干細胞的存活及分化［4-5］。所以為了提升牙髓再生治療的成功率，臨床亟需尋找合適的根管消毒藥物濃度。本文將對牙髓再生治療中根管消毒糊劑的濃度研究現(xiàn)狀作一綜述，并介紹部分新型抗菌策略。

1 根管消毒糊劑的種類

牙髓再生治療中應用最廣泛的根管消毒糊劑是Hoshino等［6-7］在1996年提出的三聯(lián)抗生素糊劑（triple antibiotic paste，TAP）。TAP 由甲硝唑，環(huán)丙沙星和米諾環(huán)素組成的混合物，能夠有效控制感染壞死的根管。但是由于米諾環(huán)素的存在會導致牙齒變色，所以又誕生了甲硝唑和環(huán)丙沙星組成的二聯(lián)抗生素糊劑（double antibiotic paste， DAP）［8］。此外，2012年Ruparel 在傳統(tǒng)三聯(lián)抗生素糊劑的基礎上提出使用頭孢克洛替代米諾環(huán)素，并證明其對SCAP 具有良好的生物相容性9］。此方案和后來提出的使用克林霉素替代米諾環(huán)素［10］方案均被稱為改良三聯(lián)抗生素糊劑（modified-triple antibiotic paste， mTAP）。另有一些其它研究報道使用Ca（OH）2作為血運重建步驟中的根管消毒糊劑［11］，但是Ca（OH）2抗菌活性相對較弱，無法有效清除頑固性感染根管中的糞腸球菌。所以為了提高抗菌效果，2007年Pallotta等提出將氫氧化鈣、甲硝唑及環(huán)丙沙星聯(lián)合使用，簡稱為CMC（calcium hydroxide， metronidazole and ciprofloxacin）并證實CMC對糞腸球菌、金黃色葡萄球菌和脆弱擬桿菌的抗菌效果強于氫氧化鈣的單獨應用［12］。

2 根管消毒糊劑濃度對干細胞的影響

2.1 TAP TAP 的干細胞毒性與其藥物濃度及作用時間有關［13-14］。2012年，Ruparel 等發(fā)現(xiàn)當TAP 濃度為10～100 mg/mL時，SCAP 的細胞存活率＜20%；當TAP 濃度為1 mg/mL 時細胞的存活率約為58%，且隨著藥物濃度的進一步稀釋（0.1～1 mg/mL）細胞存活率呈現(xiàn)明顯上升趨勢［9］。2014年Labban 等［15］通過乳酸脫氫酶細胞毒性檢測法（LDH 檢測法）和細胞增殖比色法（WST-1 檢測法）對不同濃度TAP 的DPSCs 細胞毒性及細胞增殖影響進行了評估；實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同濃度（5，2.5，2，1.51，1，0.5 和0.3 mg/mL）TAP 組中，當TAP 濃度高達5 mg/mL 時會對DPSCs 產(chǎn)生明顯細胞毒性且造成細胞增殖率的顯著下降。Jamshidi 等［13］對不同濃度TAP 在不同時間點對SCAP 的細胞毒性進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著TAP 濃度（0.1～100 mg/mL）上升和反應時間（24 h、48 h 和72 h）延長，SCAP 細胞存活率呈現(xiàn)下降趨勢，反應24 h 和48 h 時，10 mg/mL 和100 mg/mL TAP 組的SCAP 細胞存活率明顯低于對照組（P＜0.05）；在72 h 時，1、10 和100 mg/mL TAP 均導致SCAP 細胞存活率明顯下降。除此以外，最新研究還發(fā)現(xiàn)低濃度（0.1～0.8 mg/mL）TAP 也會對SCAP 活性及其牙源性分化潛能造成不利影響［16］，而此結(jié)論同目前AAE推薦使用的藥物濃度（1～5 mg/mL）相矛盾。所以究竟是否需要進一步降低牙髓再生中TAP 藥物濃度仍需要更多實驗來證實。

2.2 DAP 與TAP 相比較，DAP（甲硝唑+環(huán)丙沙星）的抗菌效果降低，無法消滅感染根管中的糞腸球菌［11］。但是，研究發(fā)現(xiàn)甲硝唑和阿莫西林組成的DAP 對糞腸球菌的抗菌效果和TAP 相似?？赡茉蚴前⒛髁肿饔糜诩毦募毎?，而環(huán)丙沙星是通過抑制DNA 的合成在細胞內(nèi)發(fā)揮作用，所以前者可能比后者具有更強更快的殺菌作用［17］。

DAP 的干細胞毒性與TAP 相似，具有濃度相關性。Ruparel等［9］證明DAP 以劑量依賴性的形式引起SCAP 活力降低，并且當濃度低于0.1 mg/mL 時對細胞活力沒有副作用。Jamshidi 在2021年的研究中指出當DAP 濃度≤1 mg/mL 時對SCAP 的存活沒有顯著負面影響，而相同濃度下TAP 比DAP 具有更高的細胞毒性［13］。2022年的最新研究發(fā)現(xiàn)低濃度（0.1～0.8 mg/mL）DAP對SCAP 活性及其牙源性分化潛能無不利影響［16］。甚至有學者證明低濃度抗菌藥物可能對細胞生長和增殖發(fā)揮積極影響。Khoshkhounejad 等［18］分別對7 μg/mL（最小抑菌濃度）、31 μg/mL（最小殺菌濃度）和156 μg/mL（最小生物膜抑制濃度）DAP 的干細胞毒性展開研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度DAP 對SCAP 具有增殖促進作用。 所以未來對于DAP 在牙髓再生中研究可能更傾向于在保證其細胞相容性的同時提升DAP 藥物濃度，實現(xiàn)其抗菌性和細胞相容性的兼顧。

2.3 mTAP mTAP 是針對傳統(tǒng)TAP 中米諾環(huán)素導致牙體變色問題而衍生出的一種改良三聯(lián)抗生素糊劑。Rahhal 等［19］分析了250、500 和1 000 μg/mL 三個濃度mTAP 對SCAP 的影響，發(fā)現(xiàn)所有濃度的mTAP 均導致細胞活性和分化潛能不同程度降低。其中250 μg/mL mTAP 組的細胞存活率最高（71.56%）。Ruparel等也證實100 μg/mL mTAP 對SCAP 沒有細胞毒性［9］。除此以外，Saberi 等在2019年還研究了mTAP（頭孢克洛）與氯己定混合后對SCAP 的細胞毒性影響，他們發(fā)現(xiàn)與氫氧化鈣組對比，mTAP（0.125～10 mg/mL）組細胞存活最低，且在與氯己定混合后細胞毒性顯著增加。TBE（Trypan Blue）和MTT 檢測結(jié)果顯示在使用濃度＞5 mg/mL mTAP 作為根管內(nèi)封藥時，無論是何種媒介都會造成細胞存活率下降至20% 以下［20］。所以，目前AAE 推薦在牙髓再生治療中使用1～5 mg/mL 濃度的mTAP 作為根管內(nèi)消毒藥物。

2.4 氫氧化鈣 Ca（OH）2是臨床上最常用的一種根管消毒藥物，它的抗菌活性依賴于與細菌的直接接觸。Ca（OH）2對糞腸球菌和白色念珠菌的抗菌效果較差。但是有研究發(fā)現(xiàn)，當將Ca（OH）2基化合物顆粒添加到更復雜的配方中時，它的抗菌活性得到了提升，如商品化的UltraCal 糊劑（Ultradent Products，Inc.， South Jordan， UT， USA）已經(jīng)被證實具有與TAP 一樣的殺菌能力［17］。除此以外，近期還有學者發(fā)現(xiàn)將水楊酸和氫氧化鈣混合后不僅能夠提高其抗菌性能還對DPSCs 細胞活性無影響［21］。

與TAP、DAP 以及mTAP 相比較，相同濃度的Ca（OH）2對干細胞的不良影響最低［9，13，22］。Labban 等［22］發(fā)現(xiàn)Ca（OH）2對DPSCs 無細胞毒性的最高濃度是2.5 mg/mL。Jamshidi 等［13］發(fā)現(xiàn)Ca（OH）2在任何濃度（0.1、0.5、1 和10 mg/mL）以及時間點（24、48、72 h）對SCAP 都不具有細胞及基因毒性，并且在濃度為1 mg/mL 時能有效促進細胞增殖。原因可能是低濃度Ca（OH）2上調(diào)磷酸化細胞外信號相關激酶，而這正是牙髓細胞和牙周膜干細胞的一個增殖標記。Selis 甚至提出Ca（OH）2作為臨床牙髓學根管內(nèi)用藥的金標準［23］。

3 新型根管抗菌策略

牙髓再生是一項以干細胞為基礎的治療方法，控制根管感染與創(chuàng)造干細胞再生所需微環(huán)境至關重要［24］。雖然目前臨床上提倡使用低濃度的根管消毒糊劑，但其是否實現(xiàn)了生物相容性消毒與牙本質(zhì)-牙髓復合體可預測性再生的完美結(jié)合仍具有爭議。因此，部分學者仍致力于探尋新型抗菌策略，其中就包括天然抗菌材料和人工合成抗菌材料。

3.1 天然抗菌材料

3.1.1 蜂膠 蜂膠不僅具有廣譜抗菌活性［25］，還具有抗氧化、抗齲壞和抗炎的特性［26］。早在2011年開始蜂膠樹脂材料就被提倡作為漱口水［27］、牙膏［28］的天然添加成分。研究還發(fā)現(xiàn)，蜂膠可以預防齲齒、菌斑形成［29］，可以作為牙齒撕脫后的細胞保存介質(zhì)［30］以及牙髓暴露的處理劑［31］。2023年一篇系統(tǒng)性綜述對蜂膠的抗糞腸球菌性能進行了分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蜂膠作為根管內(nèi)用藥時表現(xiàn)出比Ca（OH）2更強的抗糞腸球菌效果［33］。關于蜂膠在牙髓再生治療中的效果，有報道指出濃度≤4 mg/mL 的蜂膠對牙髓及牙周膜成纖維細胞的細胞毒性比Ca（OH）2至少低10倍［32］。當在動物體內(nèi)牙髓再生研究中使用蜂膠作為根管內(nèi)封藥時，其帶來的軟硬組織沉積效果與TAP 相似，甚至優(yōu)于TAP結(jié)果［34］。

3.1.2 殼聚糖基顆粒 殼聚糖是一種陽離子天然無毒化合物，目前已經(jīng)被廣泛用作藥物載體，具有良好的生物相容性、降解性及無毒性。一項研究中使用殼聚糖作為TAP 和Ca（OH）2顆粒的載體，當與使用生理鹽水作為載體相比較時，發(fā)現(xiàn)殼聚糖基化合物的抗菌效果明顯高于后者［35］。而這一發(fā)現(xiàn)可以通過殼聚糖分子固有的可能抗菌作用機制來解釋。因為殼聚糖中帶正電的氨基葡萄糖NH3+可能與帶負電的細菌表面成分相互作用，繼而改變細胞通透性，導致細胞死亡。Ducret 等人在體外實驗中使用新型富含殼聚糖的纖維蛋白水凝膠，發(fā)現(xiàn)殼聚糖的加入更有利于促進人牙髓組織再生，并且對牙髓細胞的形態(tài)、活力、增殖以及膠原基質(zhì)的產(chǎn)生無有害影響［36］。

3.1.3 石墨烯基材料 石墨烯是近年來發(fā)展起來的，一種由碳原子緊密堆積成的單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)的新型材料。因其獨特的機械性能、電化學物理性質(zhì)（如機械強度、高比表面積、熱穩(wěn)定性及獨特的表面特性）以及抗菌性能而具有廣泛的生物醫(yī)學應用價值［37-39］。尤其是在組織工程方面，它不但表現(xiàn)出良好的生物相容性，還能夠促進和維持干細胞生長及分化［40］。為了研究石墨烯對牙髓組織再生的影響，Rosa 等［41］對DPSCs 在氧化石墨烯基基底上的增殖和分化潛能展開了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯基組的DPSCs 表現(xiàn)出細胞牙源性基因表達上調(diào)。除此以外，近年來為了增強根管消毒能力，還在氧化石墨烯基質(zhì)上合成出了AgNPs 并證實其在抗菌活性及破壞生物膜方面都具有理想效果［42］。

3.2 人工合成抗菌材料

3.2.1 生物活性玻璃 生物活性玻璃是一種表面活性材料，具有促軟、硬組織再生的能力［43］。據(jù)統(tǒng)計，迄今為止，至少有25 種生物活性玻璃已被批準用于臨床，其用途之廣涉及骨空隙充填，牙本質(zhì)過敏，傷口敷料以及癌癥治療等［44］。其中納米生物活性玻璃因其獨特的理化性能（比表面積大，生物降解能力快，生物活性離子釋放快）以及卓越的生物活性更是引起牙齒組織再生研究的廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)納米生物活性玻璃能夠募集干細胞向牙本質(zhì)遷移并促進細胞附著、牙源性分化，最終形成牙髓-牙本質(zhì)樣組織［45］。除此以外，生物活性玻璃還可以通過添加抗菌劑和再生制劑來實現(xiàn)功能化，如一項研究成功合成了Ag-MBGs，并對其根管內(nèi)抗生物膜活性進行評估，發(fā)現(xiàn)Ag-MBGs 通過銀離子的釋放對糞腸球菌具有良好的抗菌效果［17］。而Ag-MBGs 對牙髓再生治療中干細胞的影響尚需進一步研究。

3.2.2 抗生素洗脫納米纖維 近年來，通過靜電紡絲技術，牙科領域已成功建立出含抗生素的納米纖維藥物遞送系統(tǒng)［17］。電紡納米纖維作為低濃度抗生素緩釋的載體能創(chuàng)造出更有利于組織再生的無菌環(huán)境。Bottino 等人在近期一項實驗中構(gòu)建出3D管狀TAP 洗脫納米纖維，并證實其能夠很好的適應根管形態(tài)，實現(xiàn)良好的感染控制以及促根尖愈合［46］。

4 小結(jié)與展望

目前，臨床上用于牙髓再生治療的根管消毒糊劑主要是三聯(lián)抗生素糊劑、二聯(lián)抗生素糊劑和氫氧化鈣糊劑。雖然高濃度的抗生素組合糊劑表現(xiàn)出較強的根管消毒能力，但同時也帶來了干細胞細胞毒性影響，所以AAE 更推薦使用低濃度（1～5 mg/mL）抗生素作為牙髓再生根管內(nèi)封藥。但也有研究發(fā)現(xiàn)即使是AAE 推薦的低濃度TAP 依然具有細胞毒性［16］，所以仍需更多研究確定其結(jié)論的準確性。氫氧化鈣糊劑對某些細菌的抗菌效果雖然不如抗生素糊劑，但其對干細胞的毒性較低，能促進牙本質(zhì)中重要的生物活性生長因子釋放，增強干細胞存活和增殖能力，所以近年來也被提倡應用。

然而，因為目前牙髓再生治療中，根管消毒藥物濃度對根尖乳頭干細胞的毒性影響的體外研究一直局限于生理條件下，沒有考慮到細胞在接觸抗菌藥物之前可能已經(jīng)處于被細菌副產(chǎn)物刺激的激活狀態(tài)。細菌的副產(chǎn)物，如脂多糖、脂磷壁酸，能夠激活殘余細胞導致炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，這激活的免疫反應又會對根尖乳頭干細胞的藥物毒性反應產(chǎn)生影響。如2019年Sipert 等［47］研究就發(fā)現(xiàn)，改良的環(huán)丙沙星、甲硝唑、氫氧化鈣混合物對人類根尖乳頭干細胞沒有表現(xiàn)出細胞毒性，但在糞腸鏈球菌的副產(chǎn)物—脂磷壁酸預處理后卻表現(xiàn)出了細胞毒性。因此，在今后的牙科材料細胞毒性測試研究中，我們有必要強調(diào)考慮細胞微環(huán)境的重要性。

另一方面，為了避免傳統(tǒng)根管消毒藥物對牙髓再生帶來的不利影響，大量新型根管抗菌策略相繼出現(xiàn)。它們雖然表現(xiàn)出良好的生物相容性根管消毒能力，但仍缺乏精心設計的體外和體內(nèi)研究，尤其是隨機臨床試驗。所以在尋找牙髓再生治療成功的道路上，我們依然是任重而道遠。