酶法制備植源性生物活性肽及其生理活性的研究進(jìn)展

孟 燁，昝麗霞，2，3，張文夷，高 寧，杜小平，4

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省四主體一聯(lián)合茶產(chǎn)業(yè)校企聯(lián)合研究中心，陜西 漢中 723000；3.陜西理工大學(xué)茶葉種植與加工研究所，陜西 漢中 723000；4.安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西 安康 725028）

生物活性肽Bp（Bioactive peptides）是由2～20 個(gè)氨基酸組成的序列，分子量＜6 kDa，是源于蛋白質(zhì)的功能性化合物[1]，其內(nèi)含有人體自身無(wú)法合成的8種氨基酸，比例接近于FAO/WHO 的推薦模式，可供人體直接所吸收，具有抗氧化、降血壓、降血脂、增強(qiáng)免疫力等功能，有助于維持機(jī)體健康和預(yù)防慢性疾病[2]。Bp 來(lái)源主要分為內(nèi)源性Bp 和外源性Bp，內(nèi)源性Bp 是由組織內(nèi)特異性蛋白水解酶作用于各種功能性組織蛋白而產(chǎn)生的，是許多哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)系統(tǒng)的介質(zhì)；外源性Bp 是指人體以外的肽類物質(zhì)，主要從食物中獲取，在進(jìn)入人體后先通過(guò)胃酸和胃蛋白酶將蛋白質(zhì)分解成片段，然后在小腸中進(jìn)一步分解為氨基酸和2～6個(gè)殘基的寡肽，再經(jīng)特異的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞，從而釋放到血液中[3-4]。目前Bp 的制備方法有酶解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)水解法三大類，不同的制備方法得到的肽的純度、理化性質(zhì)和功能活性不同，其中酶法制備的多肽易被人體消化吸收，且生產(chǎn)條件溫和、易控制，因此最為常用。

食品加工行業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)品，如小麥經(jīng)加工制粉后的副產(chǎn)物麥麩、大豆制油后的豆粕或茶飲品加工后的茶渣等，這些副產(chǎn)物中都含有較高的膳食纖維、多糖和蛋白等功能成分，若將其當(dāng)成飼料或廢物處理，不僅資源浪費(fèi)，還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染[5-7]，而利用酶解法可將食品加工行業(yè)的副產(chǎn)品制作成植物活性肽。因此，探討植物活性肽的制備技術(shù)十分重要?；诖?，本文在介紹酶法制備植物活性肽傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，討論了酶法制備植物活性肽的技術(shù)改進(jìn)，并對(duì)生物活性肽的生理活性研究最新進(jìn)展進(jìn)行了概述。

1 酶法制備植物活性肽的傳統(tǒng)方法

酶法水解是目前提取植物多肽最常用的方法，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，具有高效、安全和酶解過(guò)程可調(diào)控性的優(yōu)點(diǎn)。酶法水解常用的蛋白酶有堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等，不同活性位點(diǎn)的蛋白酶對(duì)酶解速率、產(chǎn)物的生理活性及穩(wěn)定性影響很大。如喬楊波等[8]用酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶分別對(duì)蠶豆蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶水解產(chǎn)物的得率最高、菠蘿蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有良好的降血糖活性，而酸性蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有良好的清除DPPH自由基效果。

酶法水解具體流程為原料處理、酶解反應(yīng)、分離純化和產(chǎn)品制備4步。原料處理是指清洗、破碎、浸泡等，目的是為了使材料成為更適合酶解的狀態(tài)；酶解反應(yīng)是酶解過(guò)程的核心，不同的材料都有其不同的酶解工藝，包括但不限于酶解溫度、時(shí)間、酶用量等，反應(yīng)結(jié)束要對(duì)其進(jìn)行水浴滅酶處理；分離純化是酶解工藝的重要步驟,其目的是將酶解產(chǎn)物與原料分離開來(lái)，并去除雜質(zhì)；產(chǎn)品制備是將分離純化后的酶進(jìn)行濃縮、干燥、包裝制成產(chǎn)品等。

在分離純化過(guò)程中，Wasana Wongngam 等[9]就用超濾、粒徑排除層析和反相層析分離玉米蛋白粉酶解產(chǎn)物，共發(fā)現(xiàn)了KLPPVGYP、QLVELLR、DLLGCS、AGCGAAVGTLQ、LSNPY、DPNTY 和LDDGAAKYPY 7 個(gè)新多肽。

2 酶法制備植物活性肽的技術(shù)改進(jìn)

2.1 超聲輔助蛋白酶解

超聲波是指頻率高于人類能聽到的聲音頻率范圍的機(jī)械波，頻率＞20 kHz，輸出源通常是一個(gè)振動(dòng)體，并將機(jī)械振動(dòng)轉(zhuǎn)化為超聲波能量，這些超聲波能量以波的形式在液體、固體和氣體等不同介質(zhì)中傳播。在對(duì)水解材料進(jìn)行超聲預(yù)處理或水解過(guò)程中使用高強(qiáng)度超聲時(shí)，超聲波的振動(dòng)會(huì)通過(guò)影響液體中的氫鍵和疏水作用，間接地促使空化效應(yīng)的產(chǎn)生。這些空化效應(yīng)可能會(huì)進(jìn)一步對(duì)蛋白質(zhì)的疏水相互作用產(chǎn)生影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)形態(tài)的改變，而這些改變可能更易于蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)被水解酶識(shí)別和結(jié)合，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)。Shanfen Huang 等[10]在玉米蛋白粉酶解時(shí)，引入了發(fā)散型超聲和能量聚集型超聲預(yù)處理方法，發(fā)現(xiàn)用頻率為40 kHz 的發(fā)散型超聲預(yù)處理1 h 比能量聚集型超聲預(yù)處理得到的產(chǎn)物ACE 抑制活性更高，苦味肽濃度更低。陳妍等[11]采用超聲聯(lián)合堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白，結(jié)果表明超聲處理增加了酶的速率常數(shù)，且產(chǎn)物具有較好的乳化活性和抗氧化活性。

2.2 微波輔助蛋白酶解

該法常常用于和蛋白酶一起提取植物多肽，當(dāng)微波輻射通過(guò)樣品中的溶劑時(shí)，水分子之間的摩擦和碰撞開始加劇，溶劑中的溫度迅速升高，熱能會(huì)傳遞到蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，其氫鍵、非共價(jià)鍵等結(jié)構(gòu)會(huì)受到熱能的影響發(fā)生破壞，易于蛋白質(zhì)裂解位點(diǎn)的暴露，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的快速分解[12]。于麗娜等[13]以冷榨花生蛋白粉為原料，優(yōu)化了微波輔助酶解提取α-葡萄糖苷酶抑制肽的工藝，結(jié)果表明在微波功率為1 000 W、底物濃度9.77%、加酶量0.94%、溫度59 ℃、pH 值為9.0 的條件下α-葡萄糖苷酶抑制率最高。Tian Shuangqi 等研究了微波輔助酶解制備的小麥胚芽多肽的理化性質(zhì)和功能特性，表明微波輔助提高了體系反應(yīng)速率，增加了多肽的產(chǎn)率和溶解度，且具有清除自由基的抗氧化功能。

2.3 高靜水壓輔助蛋白酶解

高靜水壓（HHP）輔助制備Bp，該法涉及對(duì)裝載液體或固體食品的軟包裝材料施加適宜壓力，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)展開，暴露出更多的活性位點(diǎn)，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解過(guò)程[14]。然而，加壓和減壓過(guò)程中會(huì)引發(fā)變形和復(fù)性等復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或影響酶的活性和水解能力，而不能產(chǎn)生水解產(chǎn)物。Yu XinXin 等[15]在高壓靜水處理乳清蛋白對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響研究中就很好的證實(shí)了這一點(diǎn)，研究表明低壓下表面游離SH 含量沒有明顯變化，壓力上升到400～600 MPa時(shí)，表面游離SH 含量急劇增加，而在壓力超過(guò)300 MPa時(shí)，總游離SH 含量顯著下降，這說(shuō)明了HHP 處理誘導(dǎo)的乳清蛋白結(jié)構(gòu)改變可能涉及多種變性機(jī)制，包括展開和聚集。因此，HHP 參數(shù)及酶種類特性的不同都會(huì)對(duì)蛋白的水解度、Bp 的分子量分布極其功能特性具有一定影響。Muhammad Amer Nazir等[16]在不同高壓靜水條件下用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和Alcalase 制備甘薯血管緊張素I 轉(zhuǎn)換酶抑制肽，在MW＜3 kDa 的肽段中，100 MPa 下Alcalase 制備的多肽比例最高，并從中鑒定出了5 個(gè)具有良好ACE 抑制活性的肽段。由于用HHP輔助蛋白酶解不需要使用高溫或有機(jī)溶劑等對(duì)環(huán)境有害的條件，降低了生產(chǎn)成本和廢物產(chǎn)生。已經(jīng)發(fā)展為一種新穎、有效、環(huán)保的生物活性肽制備技術(shù)。

2.4 脈沖電場(chǎng)輔助蛋白酶解

脈沖電場(chǎng)輔助提取Bp 需要對(duì)樣品施加短時(shí)高強(qiáng)度的電場(chǎng)，使細(xì)胞膜發(fā)生電穿孔，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，包括酶的進(jìn)入和目標(biāo)生物活性肽的釋放。同時(shí)極化蛋白質(zhì)分子、破壞蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)中的非共價(jià)鍵來(lái)改變蛋白的構(gòu)象，增強(qiáng)生物活性肽的產(chǎn)生[17]。脈沖電場(chǎng)參數(shù)的選擇會(huì)直接影響到電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞膜的作用強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，進(jìn)而影響生物活性肽的釋放和提取效果。適當(dāng)選擇和優(yōu)化脈沖電場(chǎng)參數(shù)可以在不損害樣品的情況下提高生物活性肽的提取效率并增強(qiáng)多肽的活性。Zhang Shuyu 等[18]從松子蛋白中提取了RGAVLH 多肽，用脈沖電場(chǎng)處理松子肽RGAVLH，并與未處理的RGAVLH 相比，RGAVLH 的β-折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，暴露了活性位點(diǎn)，從而提高了免疫調(diào)節(jié)活性。Wang Ke等[19]以抗氧化活性為指標(biāo)用響應(yīng)面優(yōu)化了脈沖電場(chǎng)處理10～30 kDa玉米肽的工藝條件，在電場(chǎng)強(qiáng)度15 kV/cm，脈沖頻率為2 000 Hz的條件下，樣品的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)都發(fā)生了改變，抗氧化活性提高了32.1%。

3 生物活性肽的生理活性

3.1 抗氧化

人體在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，活性氧的過(guò)量產(chǎn)生或清除能力不足可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的累積，進(jìn)而引發(fā)炎癥、細(xì)胞損傷、組織衰老和器官功能下降。目前，抗氧化劑能在一定程度上幫助中和活性氧并減少氧化應(yīng)激的損害，但長(zhǎng)期或過(guò)量使用抗氧化劑會(huì)帶來(lái)一些其他潛在危害。而生物活性肽中的氨基酸殘基能夠捕捉自由基，穩(wěn)定其電子，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，因此，抗氧化肽作為天然抗氧化劑因其安全性高、吸收好、來(lái)源廣泛而備受關(guān)注。

Shi Hui 等[20]從牛蒡中分離鑒定出了D2-G1S-1 和G2-G1S-2 兩條多肽，均表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化活性，將其在秀麗隱桿線蟲進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明這兩條肽段均能在不以降低生物體生長(zhǎng)為代價(jià)的前提下延長(zhǎng)氧化應(yīng)激抗性，減少脂肪、ROS 和脂褐素的積累，并能通過(guò)調(diào)節(jié)IGF-1 信號(hào)延長(zhǎng)線蟲的壽命。李琳等[21]研究了英國(guó)紅蕓豆抗氧化肽組分（BRKBPAPC）在斑馬魚體內(nèi)的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)的CAT、SOD 等多種抗氧化活性酶活力都得到了顯著提高。高劑量的BRKBPAPC 還對(duì)AAPH 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激起到到了改善作用。這些研究結(jié)果為抗氧化肽在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的開發(fā)研究提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

3.2 降血壓

近年來(lái)，心血管疾病的死亡率急劇上升，而高血壓期間血壓升高被確定為是與心血管疾病密切相關(guān)的因素，因此，改善高血壓成了降低心血管疾病相關(guān)死亡率的關(guān)鍵目標(biāo)。人體內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RSA）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）是調(diào)節(jié)血壓的主要途徑，其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）是高血壓發(fā)病的主要介質(zhì)，主要功能是將血管緊張素I（Ang-I）轉(zhuǎn)化為血管緊張素II（Ang-II）。Ang-II 能夠收縮血管，增加血管阻力，導(dǎo)致血壓升高[22]。而這些抗氧化肽肽對(duì)ACE 具有靶向作用，從而起到延緩血壓升高的作用。Lu Xiang等從大蒜蛋白中提取出兩條肽段（MGR 和HDCF）并在大鼠探究了兩條肽段對(duì)RAS 的調(diào)控機(jī)制，結(jié)果表明MGR 和HDCF 可以抑制ACE-AngII-AT1 軸的新生激活，從而減少Ang-I 和Ang-II 的過(guò)量產(chǎn)生和血壓升高。何海艷等[23]的研究表明，低于1 kDa 南瓜籽肽具有較好的降血壓活性，對(duì)大鼠灌胃6 h 后能有效的降低收縮壓21.42 mmHg左右，是一種良好的降血壓功能食品原料。

3.3 降血糖

降血糖肽與α-葡萄糖苷酶作用的實(shí)質(zhì)是通過(guò)多肽分子對(duì)多糖與酶之間的結(jié)合產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，降低酶與多糖之間的結(jié)合率。從而減少葡萄糖的降解，達(dá)到降低血糖的作用。馮雪等人將提取的桑葉多肽喂養(yǎng)代謝紊亂的大鼠，通過(guò)測(cè)量血糖含量證實(shí)了其具有良好的降血糖效果。趙婉宏等[24]用以玉米蛋白粉為原料提取分離出的不同超濾組分的玉米肽喂養(yǎng)斑馬魚，在斑馬魚組織中BCA 含量、葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、高低密度脂蛋白的含量后發(fā)現(xiàn)＜1 ku 的組分對(duì)糖尿病斑馬魚糖脂指標(biāo)改善效果最好，且該組分里具有調(diào)節(jié)血糖作用的亮氨酸和谷氨酸含量最高。

3.4 降尿酸

尿酸是人體內(nèi)嘌呤代謝的產(chǎn)物，含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致痛風(fēng)、腎臟疾病等各種疾病的發(fā)生。其產(chǎn)生機(jī)制是人體代謝產(chǎn)物中的次黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶（XO）氧化為黃嘌呤，進(jìn)而氧化為尿酸。降尿酸肽又稱為黃嘌呤氧化酶抑制肽，可以通過(guò)抑制XO 的活性來(lái)降低黃嘌呤的氧化速率，達(dá)到降低尿酸含量的目的。Li Qingyong等[25]從核桃粕中提取出了WMH 和DWMH 兩條新型降尿酸肽，DWMH 在大鼠體內(nèi)與別嘌呤醇具有相似的降尿酸作用，且兩條肽能促進(jìn)腎功能衰竭的改善。降尿酸肽的相關(guān)研究起步較晚，且大多集中在魚類，植源性食品中降尿酸肽的相關(guān)研究更是少之又少，這也為該領(lǐng)域的研究提供了機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

3.5 降血脂

血脂是機(jī)體代謝的能量來(lái)源，但當(dāng)機(jī)體代謝出現(xiàn)異常時(shí)會(huì)引起血脂含量升高，并伴隨多種并發(fā)癥。膽固醇在肝中降解產(chǎn)生的膽汁酸有助于脂質(zhì)在腸道的吸收，而Bp 能與膽汁酸結(jié)合，進(jìn)而有效減少膽固醇的吸收。白寶清等[26]使用堿性蛋白酶對(duì)紫蘇籽粕蛋白進(jìn)行酶解，分離出3 個(gè)組分，用G2 組分灌胃高脂模型組小鼠，結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)的TC（總膽固醇）、TG（甘油三酯）和LDL-C（低密度脂蛋白膽固醇）含量明顯降低，表明紫蘇籽粕活性肽G2具有降血脂的功效。周亭屹等[27]將酶解的西蘭花肽進(jìn)行分離純化和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選，將效果較好的凝膠分離組分G15-II 進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高劑量組肽段G15-II 能降低大鼠血液TC 和TG 含量水平，同時(shí)提高HDL-C含量，可見西蘭花肽具有明顯的輔助降血脂作用。

4 結(jié)語(yǔ)

植物是生物活性肽提取的天然寶庫(kù)，植源性生物活性肽因其特有的氨基酸組成將成為一類非常具有發(fā)展?jié)摿Φ幕衔?。采用酶法制備植物多肽的好處不僅僅在于條件溫和、安全性高，更重要的是不同的酶解條件可以產(chǎn)生不同的植物功能多肽并具有不同的產(chǎn)品性質(zhì)。而酶法制備技術(shù)的創(chuàng)新更是提高了小分子多肽的得率，能有效增強(qiáng)植物多肽的功能活性。目前，在植源性生物活性肽的研究中，制備技術(shù)、結(jié)構(gòu)鑒定和活性測(cè)定的方法相對(duì)成熟，且主要集中在體外活性測(cè)定和細(xì)胞內(nèi)活性研究，植物活性肽在體內(nèi)的作用機(jī)制和人體臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的研究還不夠，無(wú)法將其作為功能性食品和藥物進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。未來(lái)的研究其功能活性和人類健康的關(guān)系上，提高生物活性肽的利用率。