肝虛證動物模型構(gòu)建現(xiàn)狀*

趙 穎 高 翔

1.湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院 (湖北 武漢, 430061) 2.湖北中醫(yī)藥大學附屬湖北省中醫(yī)院肝病研究所 3.湖北省中醫(yī)院肝病科 4.湖北省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)基礎理論研究所 5.中醫(yī)肝腎研究及應用湖北省重點實驗室

古代醫(yī)家就肝病有無補法存在著不同看法,明代醫(yī)家劉純在《醫(yī)經(jīng)小學·卷之四》提出“肝為相火,有瀉無補”[1]。許文忠[2]分析《名醫(yī)類案》《續(xù)名醫(yī)類案》8 000余醫(yī)案,未見補肝陽、少見補肝氣。隨著清代和近現(xiàn)代醫(yī)家對中醫(yī)理論的辨析,以及當代中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程的深入推進,學界對肝虛證的認識已大為不同,從氣、血、陰、陽論治肝虛證的理論探討、臨床及實驗研究也日漸豐富。在中醫(yī)現(xiàn)代化進程中,證候動物模型的創(chuàng)制成為一項關鍵工作,中醫(yī)證候動物模型對于中醫(yī)證本質(zhì)研究、中藥復方及中藥制劑的藥效和藥理學研究等工作都具有重要意義。本文總結(jié)近年來肝虛證動物模型構(gòu)建現(xiàn)狀,以期為建立更符合中醫(yī)理論及臨床實際的肝虛證動物模型提供思路。

1 陰虛證動物模型

“肝體陰用陽”是歷代醫(yī)家在陰陽學說基礎上結(jié)合臨床辨治經(jīng)驗歸納總結(jié)出的生理病理特點,肝陰和肝血是肝生理活動的物質(zhì)基礎,故“體陰”;生理功能表現(xiàn)為肝陽和肝氣,故“用陽”[3]。丹溪學派的中心學術思想是“陽有余陰不足論”,即“人受天地之氣以生,天之陽氣為氣,地之陰氣為血,故陽常有余,陰常不足,氣常有余,血常不足”[4]。古代醫(yī)家曾提出“肝為五臟之賊”,經(jīng)方大家岳美中先生也曾有“臨床所見雜病之中,肝病十居六七”之說,肝陰虛證是臨床多種病癥常見證候,不獨見于中醫(yī)肝病和現(xiàn)代醫(yī)學肝膽病。肝虛證病機在于多種原因引起津液、營血、陰精耗損,不能榮養(yǎng)臟腑經(jīng)絡,子盜母氣、累及腎臟則出現(xiàn)肝腎陰虛證。同時,津液、營血、陰精同源化生,陰虛、血虛、精虛可相互轉(zhuǎn)化、兼夾,肝陰虛可致肝血虛或精血虧虛,血虛日久也可導致肝陰虛。因此,研究者根據(jù)“體陰”的生理病理特點,創(chuàng)建了肝陰虛證、肝腎陰虛證、肝血虛證、肝腎精血虧虛等動物模型。

付曉伶等[5]通過分析1991年至2003年46篇動物陰虛證模型相關文獻,將陰虛模型制備歸納為甲狀腺激素類(單用、聯(lián)合利血平或聯(lián)合其他藥物)造模、腎上腺皮質(zhì)激素(常用氫化可的松)造模、超負荷運動(游泳或聯(lián)合番瀉葉)造模、長期激怒法造模、手術(狹窄左腎動脈)造模、特殊環(huán)境(濕熱人工氣候室)造模、高鹽飲食造模、化學性肝損傷聯(lián)合溫燥性中藥造模、大腸桿菌內(nèi)毒素造模。但是46篇陰虛證模型文獻中報道的臟腑定位并不統(tǒng)一,大多為腎陰虛;同時也存在同樣造模方法被不同研究者分別歸結(jié)為腎陽虛、腎陰虛。文獻中僅歐陽取長[6]采用化學性肝損傷聯(lián)合溫燥性中藥造模后認為其模型為肝陰虛證大鼠,方法為40%四氯化碳(CCl4)花生油0.3 ml/100 g皮下注射2次/周,5周后改為1次/周,同時第5、6周聯(lián)合附子、肉桂、干姜復方(1∶1∶1,生藥18 g/kg/d)灌胃1次/d。余下研究中,除任小巧等[7]、樊蔚虹等[8]以長期激怒法造模,并認為模型屬于大鼠肝腎陰虛證模型外,其他研究者或?qū)⒛Ｐ蜌w屬于腎陰虛證,或未言明臟腑定位。

1.1 肝陰虛證動物模型 近10年以來,文獻報道的肝陰虛證動物模型均采用化學性肝損傷聯(lián)合其他藥物或情志刺激建立。

黃雪檸[9]采用CCl4橄欖油溶液聯(lián)合甲狀腺片混懸液制備肝陰虛模型,分別給予實驗小鼠20%、10%、5% CCl4橄欖油溶液腹腔注射和甲狀腺片混懸液灌胃以確定CCl4最佳劑量,并通過血清、肝臟代謝物多元統(tǒng)計分析鑒定肝陰虛潛在生物標記物。研究發(fā)現(xiàn),CCl4最佳劑量為20%;模型小鼠血清ALT、AST、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、cAMP/環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)比值、TNF-α、IL-6顯著升高,IL-10降低,cGMP、SOD顯著降低;肝陰虛潛在生物標記物包括252個血清差異代謝物和229個肝臟差異代謝物,涉及核苷酸代謝、嘌呤代謝、類固醇激素生物合成、嘧啶代謝、初級膽汁酸生物合成、花生四烯酸代謝等代謝等通路。李麗等[10]、高晶等[11]采用腹腔注射20% CCl4橄欖油溶液聯(lián)合甲狀腺片灌胃制備肝陰虛證大鼠模型,通過測量大鼠體質(zhì)量、肛溫、舌面干濕度、攝食量、攝水量,觀察動物易激惹程度、毛發(fā)光澤度、小便顏色、大便顏色及質(zhì)地等指標并進行評分,綜合評定肝陰虛證模型大鼠證候表征。研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠體質(zhì)量降低、肛溫升高、24 h攝食量增加,白芍總苷、白芍多糖能夠調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸含量、雌二醇(E2)和皮質(zhì)類固醇水平以及能量代謝,研究者認為這在一定程度上揭示了白芍養(yǎng)肝陰的科學內(nèi)涵[11]。

賈嵐等[12,13]采用文獻[6]慢性肝損傷聯(lián)合溫燥性中藥造模方法復制大鼠肝陰虛證模型,以大鼠體質(zhì)量、易激惹程度、毛發(fā)光澤度、小便顏色、大便顏色質(zhì)地、肛溫等作為肝陰虛證候指標,研究發(fā)現(xiàn)白芍多糖能夠改善模型大鼠大便干燥程度,白芍總苷能夠明顯改善模型大鼠體征評分、顯著提高大鼠體質(zhì)量。研究者認為,白芍總苷抗炎、減輕微循環(huán)障礙、調(diào)節(jié)細胞因子IL-6和IL-10平衡可能是白芍養(yǎng)肝陰的物質(zhì)基礎[13]。

賈嵐等[14]采用Lieber-DeCarli酒精液體飼料加甲狀腺激素灌胃制備小鼠酒精性肝損傷肝陰虛證模型,模型小鼠體重明顯減輕、體溫升高、心率加快、毛發(fā)無光澤,出現(xiàn)疲倦易困、煩躁易怒等肝陰虛證候。白芍水提液灌胃(4.3 g/kg)能夠改善模型小鼠肝功能、降低肝組織脂質(zhì)占比、改善肝細胞壞死程度,療效機制可能與調(diào)節(jié)cAMP/cGMP水平及細胞因子水平、恢復肝細胞功能與代謝平衡、增強肝臟乙醇代謝關鍵酶及抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化反應、減少脂質(zhì)沉積有關。

1.2 肝腎陰虛動物模型 肝腎陰虛證是臨床常見中醫(yī)證型,研究者開展了多種疾病肝腎陰虛證模型的建立和研究工作。

任小巧等[7]以慢性激怒應激法制造大鼠肝腎陰虛證模型,發(fā)現(xiàn)肝腎陰虛證大鼠促甲狀腺激素釋放激素分泌增加,垂體、血清促甲狀腺激素降低,血清游離甲狀腺素降低而反三碘甲狀腺原氨酸增高,加味一貫煎能夠影響模型大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸,改善上述指標。樊蔚虹等[8]進行了長期激怒法與化學藥物法、溫燥藥法所制造肝腎陰虛模型進行對比研究,發(fā)現(xiàn)長期激怒法大鼠體重增長緩慢,飲水量、尿量減少而體溫相對恒定,血漿cAMP下降,E2與睪酮(T)比值升高。研究者提出,長期激怒法所造模型無人為所致內(nèi)分泌紊亂,更接近臨床實際,是肝腎陰虛證的最佳造模方法。

俸道榮等[15]模擬高脂血癥及中醫(yī)肝腎陰虛證的病因,采用高脂飲食聯(lián)合長期激怒建立高脂血癥大鼠肝腎陰虛證動物模型。模型大鼠出現(xiàn)明顯消瘦、活動減少、豎毛少澤、食欲減少、弓背、扎堆等現(xiàn)象,血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白-膽固醇顯著升高,血漿cAMP含量升高、E2和E2/T比值顯著升高。研究者認為該模型大鼠表現(xiàn)出高脂血癥肝腎陰虛證的癥狀、體征,實驗室檢測指標符合臨床實際。劉文蘭等[16]采用100% CCl4腹腔注射1次聯(lián)合長期激怒法建立急性肝損傷肝腎陰虛證病證結(jié)合大鼠模型,并從一般狀態(tài)、飲水量、進食量、游泳時間、肛溫、唾液酸堿度、體重減輕、肝臟系數(shù)、肝功能、肝臟形態(tài)、肝組織病理等方面對模型進行評價,發(fā)現(xiàn)該模型具有形體消瘦等陰虛證典型特征,同時具備肝損傷顯著、抗疲勞能力降低等肝的定位癥狀和虛損、尿液異常等腎的定位癥狀,研究者認為該模型是理想的肝腎陰虛證病證結(jié)合動物模型。黃志強等[17]采用左甲狀腺素鈉灌胃(150 μg/kg)聯(lián)合夾尾法情志刺激建立肝腎陰虛證候小鼠模型,模型小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、大便干硬、小便發(fā)黃、自主活動增加、易激惹、反應活躍、喜冷怕熱等虛熱癥狀。

吳智春等[18]利用晚期自發(fā)性高血壓大鼠(SHR),根據(jù)大鼠辨證方法學將四診信息轉(zhuǎn)化為具有同等意義的一般行為學指標,認為SHR大鼠午后肛溫較高、舌色偏紅、前爪抓握能力及肌力較差、學習記憶能力減退、血清T水平偏低及E2/T比值較高等特征基本符合肝腎陰虛證的表現(xiàn),提出晚期SHR屬于肝腎陰虛證候。

艾浩等[19]采用腹腔注射化療藥順鉑(CDDP,3 mg/kg)建立卵巢功能早衰肝腎陰虛證小鼠模型,發(fā)現(xiàn)腹腔注射CDDP后小鼠體重減輕,進食、飲水均減少,尿量減少,體溫升高,血漿cAMP含量升高;血清E2和孕酮水平降低,促卵泡生成激素和黃體生成素水平升高,卵巢排卵功能明顯受到抑制。研究者認為模型小鼠生物學行為接近于臨床實際,內(nèi)分泌功能和生化指標變化特征與臨床相似,是系統(tǒng)研究卵巢功能早衰肝腎陰虛證的適宜造模方法。

1.3 肝血虛證動物模型 血虛證動物模型多以化學藥物誘發(fā)溶血或減少血容量的方式建立,但現(xiàn)有研究均未談及臟腑定位,肝血虛證研究報告均為臨床研究,臟腑定位為肝的血虛證動物模型報道極少。

賁長恩等[20]早在1981年開展了乙?；诫?APH)誘導血虛動物模型的實驗研究,探討皮下注射與腹腔注射對模型大鼠溶血和自然恢復情況的影響,由此開創(chuàng)了化學藥物誘導血虛動物模型的實驗方法。近年來,研究者在化學藥物的選擇、給藥劑量和方式上開展實驗研究,張文卓等[21]、李朝政等[22]、馮偉科等[23]采用APH/環(huán)磷酰胺(CTX)復合因素建立血虛證動物模型,李浩等[24]、張小勇等[25]采用CTX誘導血虛證,任德旺等[26]采用腹腔注射鹽酸苯肼建立了小鼠血虛證模型。錢宏梁等[27]復制APH誘導血虛證小鼠模型探討血虛證模型小鼠的證候物質(zhì)基礎,發(fā)現(xiàn)模型小鼠呈現(xiàn)虛弱征象,脾臟代償性增大、胸腺明顯萎縮,血液紅細胞形態(tài)異常、正常紅細胞數(shù)量減少、白細胞代償性增多,骨髓成熟的環(huán)狀核細胞減少,血清皮質(zhì)酮含量明顯升高;脾臟腫大、腎臟Epo基因代償性高表達以及繼發(fā)腎上腺皮質(zhì)功能虛性亢奮是該證候最突出的特征。

王平等[28]首次采用較長時間放血與饑餓相結(jié)合的方法建立了家兔血虛模型,通過血液流變學和微循環(huán)、心鈉素等指標結(jié)合補血中藥療效判定,該模型是一種簡便、客觀、定量、可重復的血虛證模型。許安萍等[29]、徐敏等[30]、王心怡等[31]均采用上述方法復制家兔血虛證模型進行針刺療效研究,王偉等[32]、肖敏佳等[33]參考上述方法建立了大鼠血虛證模型進行針刺療效研究,研究者均利用外周血象指標進行療效評價。郭平等[34]采用3.5 Gy60Co源γ射線全身一次性照射制備小鼠血虛證模型,以骨髓集落培養(yǎng)計數(shù)粒細胞-巨噬細胞集落形成單位、紅細胞集落形成單位、爆裂型紅細胞集落形成單位、混合集落形成單位作為血虛證模型小鼠療效評價指標。

林臘梅[35]報道了肝切除聯(lián)合睡眠剝奪建立的肝血虛失眠模型,模型大鼠表現(xiàn)為精神萎靡,易受驚,活動量少,目光呆滯,雙目、口唇呈蒼白色,皮毛重度枯槁蓬亂、呈黃色,爪甲粗糙,抓取時無力反抗;中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)異常,下丘腦、腦干內(nèi)5-羥色胺和γ-氨基丁酸含量降低,多巴胺、去甲腎上腺素和谷氨酸含量升高。李瀚旻等[36]采用乳鼠皮下注射左旋谷氨酸單鈉聯(lián)合70%肝臟切除建立肝腎精血虧虛大鼠,模型大鼠肝再生度、肝細胞分裂指數(shù)、肝重/體重比值、骨髓有核細胞增生度、外周血紅細胞計數(shù)和血紅蛋白均顯著下降,給予左歸丸補益肝腎精血則上述指標顯著改善,研究結(jié)果表明肝再生能力可作為觀察肝腎精血虧虛證的客觀化指標。

2 陽虛證動物模型

明代及金元時期多有醫(yī)家認為肝無氣虛、陽虛之證,但早在《靈樞·本神》有云:“肝氣虛則恐,實則怒”,肝氣虛證與情志密切關聯(lián)。氣屬陽,肝氣虧虛、虛損嚴重則進展為肝陽虛。肝氣虛是指肝氣升發(fā)之力不足,溫煦、調(diào)暢之力下降所引起的一系列證候表現(xiàn),而肝陽虛則是在肝氣虛的病理基礎上發(fā)生肝陽漸衰之證,歷代醫(yī)典中已收錄并闡述其證候表現(xiàn)及治法[37]。然而,受丹溪學派影響,宋金元時期之后醫(yī)家鮮少提及肝氣虛、肝陽虛,并提出“肝常有余”、“肝無補法”等說法。直至清代、近代,補肝法重新涵蓋補肝氣、補肝陽,張錫純在醫(yī)案中明確記載肝氣虛證,提出“補肝氣非黃芪不能”的觀點[38]。

肝陽虛證、氣虛證動物模型研究極少,僅見包祖曉等[39]報道聯(lián)合應用利血平注射液腹腔注射與氫化可的松注射液肌肉注射建立肝腎陽虛型抑郁大鼠模型,觀測大鼠體重、攝食量、飲水量、抓力、敞箱水平穿越數(shù)和垂直運動次數(shù)、腋溫等,以體重、糖水攝入量、血清cAMP含量、cAMP/cGMP比值等作為肝腎陽虛證量化指標。采用圖像處理軟件選取爪、尾照片特定區(qū)域提取色度R、G、B,根據(jù)公式r=R/(R+G+B)計算r值以進行計量化辨證,評估模型大鼠陽熱、氣虛、陰虛和血虛程度。研究者依據(jù)利血平藥性為寒涼、歸肝經(jīng)的理論探討[40],以及小鼠皮下注射后出現(xiàn)體重逐漸減輕、活動減少、畏寒、拱背、便溏等陽虛癥狀的研究報告[41],提出利用利血平所制作的動物模型屬肝陽虛。

綜上所述,肝虛證動物模型構(gòu)建和研究工作均有待進一步推進和完善。內(nèi)經(jīng)描述了五臟之中肝的位置、大小,與現(xiàn)代解剖學之肝臟基本一致,而肝體、肝用之說則反映了氣、血、陰、陽等物質(zhì)基礎是發(fā)揮生理功能的載體。因此,借助現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究技術構(gòu)建中醫(yī)證候動物模型,以解剖學肝臟作為肝藏象物質(zhì)基礎研究的切入點,闡釋氣、血、陰、陽等物質(zhì)基礎的生物學本質(zhì)及其承載“肝用”的科學內(nèi)涵,對于推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程具有積極意義。