響應(yīng)面法優(yōu)選穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝及其抗氧化活性研究

楊紫焰 李自霖 張翠香 黃麗金 陳貴元 李雪英

摘要 為了明確大孔樹脂脫除穿心蓮多糖中色素的工藝參數(shù)，研究大孔樹脂添加量、脫色時(shí)間以及脫色溫度對(duì)穿心蓮多糖脫色效果的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)選大孔樹脂脫除穿心蓮多糖色素的工藝，并探究穿心蓮多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，穿心蓮多糖大孔樹脂最佳脫色工藝為大孔樹脂添加量3.0 g/100 mL多糖溶液，脫色溫度50 ℃，脫色2.0 h，脫色1次?；谠摴に嚄l件，穿心蓮多糖色素去除率可達(dá)81.35%，多糖保留率73.16%，穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的加權(quán)綜合評(píng)分77.25，表明該穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝穩(wěn)定，可用于穿心蓮多糖中色素脫除的生產(chǎn)實(shí)際?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，穿心蓮多糖對(duì)·OH自由基有較好的清除作用，其具有一定的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 穿心蓮多糖；大孔樹脂；響應(yīng)面法；脫色工藝；抗氧化活性

中圖分類號(hào) TS201.1；S567.219? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2024）10-0089-07

Optimization of macroporous resin for removing polysaccharide pigment from Andrographis paniculata by response surface method and its antioxidant activity

YANG Ziyan1? ? LI Ziling1? ? ZHANG Cuixiang1? ? HUANG Lijin1? ? CHEN Guiyuan1? ? LI Xueying1， 2

（1College of Basic Medicine， Dali University， Dali 671000， China;

2College of Agriculture and Biological Sciences， Dali University， Dali 671003， China）

Abstract In order to clarify the process parameters of using macroporous resin to remove pigments from Andrographis paniculata polysaccharides， the effects of resin dosage， decolorization time， and decolorization temperature on the decolorization effect of Andrographis paniculata polysaccharides were studied. The response surface methodology was used to optimize the process of using macroporous resin to remove pigments from Andrographis paniculata polysaccharides， and the antioxidant activity of Andrographis paniculata polysaccharides was investigated. The results showed that the optimal decolorization process for the polysaccharide macroporous resin of Andrographis paniculata was as follows： the amount of macroporous resin added was 3.0 g/100 mL of polysaccharide solution， decolorization temperature was 50 ℃， decolorization time was 2.0 hours， and decolorization was once. Based on this process condition， the removal rate of pigment from Andrographis paniculata polysaccharide could reach 81.35%， the retention rate of polysaccharides was 73.16%， and the weighted score of Andrographis paniculata polysaccharides pigment removal rate and polysaccharide retention rate was 77.25， which indicated that the macroporous resin decolorization process of Andrographis paniculata polysaccharides was stable and feasible which could be used for the actual production of pigment removal from Andrographis paniculata polysaccharides. The results of antioxidant experiments indicated that the polysaccharides of Andrographis paniculata had a good scavenging effect on ·OH free radicals， indicating that the polysaccharides of Andrographis paniculata had certain antioxidant activity.

Keywords? Andrographis paniculata polysaccharide; macroporous resin; response surface method; decolorization process; antioxidant activity

穿心蓮（Andrographis paniculata）又名苦膽草，為爵床科一年生植物，全草皆可入藥，主要分布在濕熱地區(qū)。穿心蓮性寒味苦，具有一定的清熱、消腫和解毒等功效[1]。穿心蓮根莖葉中均含有內(nèi)酯、皂苷、黃酮、多酚和多糖等生物活性分子[2]。關(guān)于穿心蓮多糖的提取方面的研究已有相關(guān)報(bào)道[3-4]。多糖大多為水溶性大分子，常以水作為媒介進(jìn)行提取，因此在提取多糖的時(shí)候，往往也會(huì)把水溶性色素物質(zhì)提取出來。色素物質(zhì)與多糖混在一起可能會(huì)對(duì)多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其活性等產(chǎn)生影響[5]。因此，去除多糖中的色素物質(zhì)是多糖分離純化、結(jié)構(gòu)研究和活性分析的重要環(huán)節(jié)，多糖脫色工作的開展對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和功能的研究意義重大。常用的多糖脫色方法有雙氧水氧化脫色法、活性碳吸附脫色法和大孔樹脂吸附脫色法，不同的脫色方法可能會(huì)對(duì)多糖的脫色效果、活性和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[6-8]。雙氧水的氧化性強(qiáng)，脫色條件較為嚴(yán)苛，可能會(huì)影響多糖的活性[9]?；钚蕴嘉矫撋ú僮骱唵危俏教禺愋暂^差，吸附色素的同時(shí)也會(huì)吸附多糖，造成多糖的損失，且對(duì)大分子色素物質(zhì)的吸附效果不佳[10]。大孔樹脂脫色法具有操作簡單、脫色條件溫和、重復(fù)性好且對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)及活性影響較小等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，是當(dāng)前多糖脫色較為常用的方法。采用雙氧水氧化法和活性碳吸附法脫除苦膽草多糖中的色素的研究已有報(bào)道[13-14]，采用大孔樹脂作為脫色劑脫除穿心蓮（苦膽草）多糖中色素物質(zhì)的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以FL-1型大孔樹脂作為脫色劑，考察脫色時(shí)間、大孔樹脂添加量和脫色溫度3個(gè)單因素對(duì)穿心蓮多糖中的色素物質(zhì)脫除效果的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)選穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝，探究脫色后的穿心蓮多糖的體外抗氧化活性，為穿心蓮多糖的開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

穿心蓮莖部干料購自云南大理某藥房，為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮的干燥地上部分，粉碎成60目粉末；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110833－201506）；FL-1型大孔樹脂購于上海一基實(shí)業(yè)有限公司；抗壞血酸（Vc）購于Sigma公司；水楊酸購于上海試劑一廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純（AR），購于國藥試劑公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)所用儀器有XPR204S/AC電子天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]；水浴恒溫振蕩器（上海鄆曹電子科技有限公司）；XD-52水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；TS-100C型振蕩搖床（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；UV-5100型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；KH22R型冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；LGJ-10型真空冷凍干燥機(jī)（深圳市三莉科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 穿心蓮多糖的提取? 穿心蓮多糖的提取方法參照文獻(xiàn)[3]，多糖提取液經(jīng)真空濃縮，采用Sevage法脫蛋白至280 nm 波長處無明顯吸收峰，蒸餾水稀釋無水乙醇使其最終濃度為85%，沉淀多糖12.0 h，回收乙醇，分別用丙酮、乙醚洗滌穿心蓮多糖沉淀物1次，真空冷凍干燥，得穿心蓮多糖粗品。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于105 ℃烘干至恒重，稱取100.0 mg，溶解于去離子水中，并定容至1 000 mL。參考文獻(xiàn)[15]的方法制作葡萄糖標(biāo)線，得線性回歸方程：Y=0.012 1X+0.076 9，線性擬和系數(shù)R2=0.998 9，提示在葡萄糖質(zhì)量濃度（X）為0～0.06 mg/mL時(shí)，與吸光度（Y）的線性關(guān)系較好，可用于多糖質(zhì)量濃度的測(cè)定。

1.3.3 穿心蓮多糖色素去除率的測(cè)定? 稱取0.5 g穿心蓮多糖干粉溶解于100 mL去離子水中。待充分溶解后，4 000 r/min冷凍離心5 min，收集上清液，取2 mL多糖上清液全波長掃描，在540 nm波長處穿心蓮多糖有最大吸收峰，所以選擇540 nm波長檢測(cè)穿心蓮多糖溶液的吸光度，多糖的色素去除率計(jì)算公式如下。

式（1）中，R為穿心蓮多糖色素去除率，%；A1為色素去除前穿心蓮多糖溶液的吸光度；A2為色素去除后穿心蓮多糖溶液的吸光度。

1.3.4 穿心蓮多糖保留率的測(cè)定? 參照文獻(xiàn)[16]的方法測(cè)定穿心蓮多糖的質(zhì)量濃度。按式（2）計(jì)算穿心蓮多糖的保留率。

式（2）中，K為穿心蓮多糖的保留率，%；C1為穿心蓮多糖色素去除后的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；C0為穿心蓮多糖色素去除前的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.5 穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分? 參照文獻(xiàn)[17]的方法，選取色素去除率和多糖保留率的加權(quán)評(píng)分評(píng)價(jià)大孔樹脂對(duì)穿心蓮多糖的脫色效果，設(shè)定穿心蓮多糖的保留率（K）和穿心蓮多糖色素去除率（R）兩個(gè)指標(biāo)的加權(quán)值各占50%，色素去除率和多糖保留率兩者加權(quán)的綜合評(píng)分（M）計(jì)算公式如下。

式（3）中，M為穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分，分；R為穿心蓮多糖色素去除率，%；Rmax為穿心蓮多糖色素去除率的最大值，%；K為穿心蓮多糖的保留率，%；Kmax為穿心蓮多糖保留率的最大值，%。

1.3.6 大孔樹脂的活化處理? 參照文獻(xiàn)[18]的方法活化FL-1型大孔樹脂，用5%的鹽酸和5%的NaOH溶液分別浸泡樹脂6.0 h，去離子水洗滌樹脂至pH值呈中性，然后用95%乙醇浸泡樹脂6.0 h，回收乙醇，去離子水洗滌樹脂3次，4 000 r/min冷凍離心5 min，收集樹脂備用。

1.3.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 稱取0.5 g穿心蓮多糖粉末多份，去離子水分別定容至100 mL，得到多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL的多糖供試液多份。分別考察脫色時(shí)間（A）、脫色溫度（B）和大孔樹脂添加量（C）對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率兩者加權(quán)的綜合評(píng)分（M）作為檢測(cè)指標(biāo)，按照表1設(shè)置各個(gè)因素及其水平，采用響應(yīng)面法優(yōu)選大孔樹脂脫除穿心蓮多糖中色素物質(zhì)的工藝參數(shù)。

1.5 穿心蓮多糖清除·OH自由基的作用

參照文獻(xiàn)[19]的方法，取3支潔凈試管，分別標(biāo)注測(cè)定管、空白管和本底管，分別向3支試管中加入1 mmol/L的FeSO4溶液2.5 mL。向空白管和測(cè)定管中各加入3 mmol/L的雙氧水2.5 mL，本底管中加入2.5 mL去離子水代替雙氧水；向測(cè)定管和本底管中各加入0.5 mL不同質(zhì)量濃度的穿心蓮多糖溶液，向空白管中加入0.5 mL去離子水。最后向3支管中各加入3 mmol/L的水楊酸溶液4.5 mL，混勻，37 ℃孵育15 min。以3 mmol/L的水楊酸溶液作參比調(diào)零，測(cè)定510 nm波長處的各管吸光度。選用抗壞血酸（Vc）作為陽性對(duì)照，同法操作，將測(cè)得的各管吸光度代入式（4），計(jì)算穿心蓮多糖或者Vc對(duì)·OH自由基的清除率。

式（4）中，E為穿心蓮多糖或者Vc對(duì)·OH自由基的清除率，%；A0為空白管的吸光度；A1為穿心蓮多糖或Vc測(cè)定管的吸光度；A2為穿心蓮多糖或Vc本底管的吸光度。

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各個(gè)試驗(yàn)均3次重復(fù)，各個(gè)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)均采用平均值，應(yīng)用Design-Expert 10.0開展響應(yīng)面試驗(yàn)，使用SPSS 9.0軟件對(duì)各個(gè)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色時(shí)間對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響

如圖1所示，穿心蓮多糖的色素去除率隨著脫色時(shí)間的延長而不斷增加，穿心蓮多糖的保留率則不斷下降，可能是大孔樹脂對(duì)穿心蓮多糖也具有吸附作用，導(dǎo)致多糖保留率下降。當(dāng)脫色時(shí)間達(dá)到2.0 h時(shí)，多糖色素去除率達(dá)到71.21%，多糖保留率為78.03%。當(dāng)脫色時(shí)間超過2.0 h后，穿心蓮多糖的保留率則迅速下降。考慮時(shí)間成本以及減少多糖的損失，選擇2.0 h進(jìn)行后續(xù)單因素試驗(yàn)。選擇脫色時(shí)間1.0、2.0和3.0 h這3個(gè)水平開展響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 脫色溫度對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響

如圖2所示，穿心蓮多糖色素去除率與脫色溫度的增加呈正相關(guān)，但是穿心蓮多糖的保留率則隨著脫色溫度的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)脫色溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，穿心蓮多糖色素去除率達(dá)到82.00%，多糖保留率為63.00%；當(dāng)脫色溫度超過50 ℃后，穿心蓮多糖色素去除率增加緩慢，而穿心蓮多糖的保留率下降較快，可能是溫度過高引起多糖的水解，導(dǎo)致多糖的損失。為了減少穿心蓮多糖的損失，選擇脫色溫度50 ℃開展后續(xù)試驗(yàn)。綜合考慮，選取脫色溫度40、50和60 ℃這3個(gè)水平開展響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3 大孔樹脂添加量對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響

如圖3所示，隨著大孔樹脂添加量的增加，穿心蓮多糖色素去除率也有所增加，表明穿心蓮多糖色素去除率與大孔樹脂的添加量呈正相關(guān)，但是穿心蓮多糖保留率與大孔樹脂的添加量則呈負(fù)相關(guān)，可能是大孔樹脂吸附色素物質(zhì)的同時(shí)也非特異性地吸附了穿心蓮多糖，導(dǎo)致多糖損失。當(dāng)大孔樹脂添加量達(dá)到3.0 g時(shí)，穿心蓮多糖色素去除率達(dá)到75.00%，多糖保留率為76.00%，再增加大孔樹脂添加量，穿心蓮多糖色素去除率增加趨緩，多糖保留率則呈下降趨勢(shì)，為減少穿心蓮多糖損失，選擇大孔樹脂添加量3.0 g開展試驗(yàn)，選擇大孔樹脂添加量2.0、3.0和4.0 g這3個(gè)水平開展響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)分析相關(guān)指標(biāo)對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的影響

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)? 按照Design-Expert 10.0軟件的設(shè)計(jì)方案開展響應(yīng)面試驗(yàn)，得到的試驗(yàn)結(jié)果如表2—3所示。表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Design-Expert 10.0軟件擬合分析，得到穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分（M）與脫色時(shí)間（A）、脫色溫度（B）以及大孔樹脂添加量（C）之間的二次回歸方程：M=77.76-2.33A-1.96B-0.28C+0.22AB-1.01AC-2.83BC-6.51A2-11.72B2-9.62C2。

由表3的分析結(jié)果可知，該回歸模型P值<0.000 1，失擬項(xiàng)的P值為0.157 4，提示脫色時(shí)間（A）、脫色溫度（B）、大孔樹脂添加量（C）與穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分（M）的擬合具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。擬合系數(shù)（R2）為0.991 4，校正擬合系數(shù)（R2Adj）為0.980 4，提示脫色時(shí)間（A）、脫色溫度（B）和大孔樹脂添加量（C）3個(gè)因素與穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分（M）的線性關(guān)系較好。

表3中A、B、A2、B2和C2的P值均小于0.05，提示A、B、A2、B2和C2對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分（M）的影響都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表3中BC的P值小于0.05，表明BC對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分（M）的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B和C的F值分別為25.37、18.06和0.38，提示脫色時(shí)間（A）、脫色溫度（B）和大孔樹脂添加量（C）對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分（M）影響的強(qiáng)弱順序?yàn)槊撋珪r(shí)間（A）>脫色溫度（B）>大孔樹脂添加量（C）。

2.4.2 各因素交互作用分析? 響應(yīng)曲面的陡峭程度和等高線的形態(tài)均可表示兩個(gè)因素間的交互作用是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。響應(yīng)曲面越陡峭，等高線形狀越接近橢圓，表示兩個(gè)因素的交互作用越具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；響應(yīng)曲面越平緩，等高線形狀越趨近圓形，則提示兩個(gè)因素的交互作用不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[20]。

由圖4可知，脫色時(shí)間（A）與脫色溫度（B）、脫色時(shí)間（A）與大孔樹脂添加量（C）之間的響應(yīng)曲面較為平緩，且等高線趨近圓形，提示脫色時(shí)間（A）與脫色溫度（B）、脫色時(shí)間（A）與大孔樹脂添加量（C）間的交互作用不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A—B），表明AB、AC對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分（M）的影響不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脫色溫度（B）與大孔樹脂添加量（C）間的響應(yīng)曲面較為陡峭，等高線形狀接近橢圓形，提示脫色溫度（B）與大孔樹脂添加量（C）之間的交互作用存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4C），表明BC對(duì)穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分（M）具有明顯影響。以上結(jié)果與表3中的方差分析結(jié)果基本一致。

2.4.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析? 將表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Design-Expert 10.0軟件，通過軟件預(yù)測(cè)得到穿心蓮多糖的理論最佳脫色工藝參數(shù)：100 mL穿心蓮多糖溶液中添加大孔樹脂3.05 g，脫色1.82 h、脫色溫度49.13 ℃和脫色1次，得到多糖色素去除率和多糖保留率綜合評(píng)分的預(yù)測(cè)值為78.05。考慮到生產(chǎn)實(shí)際情況，將穿心蓮多糖的最佳脫色工藝參數(shù)調(diào)整為大孔樹脂添加量3.0 g/100 mL多糖溶液，脫色溫度50 ℃，脫色2.0 h，脫色1次?；谠摴に囘M(jìn)行3次平行試驗(yàn)并計(jì)算平均值，可得穿心蓮多糖色素去除率為81.35%，多糖保留率為73.16%，綜合評(píng)分為77.25，與理論預(yù)測(cè)值78.05較為接近，表明該穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝穩(wěn)定可靠，可用于穿心蓮多糖中色素脫除的生產(chǎn)實(shí)際。

2.5 穿心蓮多糖對(duì)·OH自由基的清除作用

如圖5所示，穿心蓮多糖對(duì)·OH自由基的清除率與多糖濃度呈相關(guān)性。當(dāng)穿心蓮多糖質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH自由基的清除率可達(dá)44.64%，低于相同濃度的Vc對(duì)·OH自由基的清除率（98.42%），但穿心蓮多糖仍表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。自由基的強(qiáng)氧化性對(duì)DNA、油脂和有機(jī)物具有一定的破壞性。臨床上常用Vc作為抗氧化劑清除自由基，但是其過量使用可能會(huì)引起副作用。穿心蓮多糖屬于天然產(chǎn)物，具有副作用小的優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有作為天然抗氧化劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

本研究以穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率作為考察指標(biāo)，研究脫色溫度、脫色時(shí)間以及大孔樹脂添加量對(duì)穿心蓮多糖中色素去除的影響?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法優(yōu)選大孔樹脂脫除穿心蓮多糖色素的工藝參數(shù)。結(jié)果表明，穿心蓮多糖大孔樹脂最佳脫色工藝參數(shù)為大孔樹脂添加量3.0 g/100 mL多糖溶液，脫色溫度50 ℃，脫色2.0 h，脫色1次?；谠摴に噮?shù)開展脫色試驗(yàn)，穿心蓮多糖色素去除率可達(dá)81.35%，多糖保留率為73.16%，穿心蓮多糖色素去除率和多糖保留率的綜合評(píng)分為77.25，與理論預(yù)測(cè)綜合評(píng)分（78.05）的誤差較小，提示該穿心蓮多糖大孔樹脂脫色工藝穩(wěn)定可行，可用于穿心蓮多糖色素脫除的實(shí)際生產(chǎn)。穿心蓮多糖體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，穿心蓮多糖對(duì)·OH自由基具有一定的清除作用，質(zhì)量濃度0.6 mg/mL的穿心蓮多糖對(duì)·OH自由基的清除率可達(dá)44.64%，提示穿心蓮多糖仍具有一定的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用。

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（責(zé)編：王 菁）