貓皰疹病毒研究進(jìn)展

余紫葳,劉永相,范春艷,檀子卿

(河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北邯鄲 056038)

貓皰疹病毒(Feline herpesvirus type 1,FHV-1)是貓病毒性鼻氣管炎(Feline viral rhiontracheitis,FVR)的病原體,主要引起貓的上呼吸道疾病和眼部疾病。目前已知,FHV-1只有1種血清型,遺傳物質(zhì)為雙鏈DNA,屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬?？梢鸹钾堃钟?、發(fā)熱、打噴嚏、眼鼻漿液性分泌物增多、結(jié)膜充血等癥狀,嚴(yán)重者還會出現(xiàn)皮膚潰瘍,甚至死亡。近年來,隨著我國城市化和老齡化進(jìn)程不斷加深,飼養(yǎng)貓的家庭越來越多,貓作為伴侶動物,其健康問題也引起了人們的廣泛重視。由于 FHV-1傳播范圍廣、潛伏感染的特點(diǎn),其診療工作較為困難,這對貓科動物的健康產(chǎn)生了巨大威脅,因此加強(qiáng)對該病毒研究尤為重要。本文闡述了近年來對FHV-1的研究進(jìn)展,為該病毒的進(jìn)一步研究提供參考。

1 病原學(xué)

1.1 皰疹病毒概述

皰疹病毒為雙鏈DNA病毒,根據(jù)基因組序列差異和致病特點(diǎn)等被分為α皰疹病毒、β皰疹病毒和γ皰疹病毒三大類,其中α皰疹病毒主要有可感染人的單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus type 1/2,HSV-1/2)、水痘帶狀皰疹病毒 (Varicella-zoster virus,VZV) 和可感染動物的FHV-1、偽狂犬病病毒 (Pseudorabies virus,PRV)、雞馬立克氏病病毒 (Marek's disease virus,MDV) 等;β皰疹病毒主要是巨細(xì)胞病毒 (Human cytomegalovirus,HCMV);γ皰疹病毒主要是可感染淋巴樣細(xì)胞的EB病毒。

FHV-1作為α皰疹病毒,與其他α皰疹病毒一樣,具有其共有的增殖快、神經(jīng)嗜性、可產(chǎn)生典型細(xì)胞病變的特點(diǎn),不同的是其他α皰疹病毒宿主范圍較廣,FHV-1僅感染貓科動物。據(jù)血清學(xué)研究表明,FHV-1在世界范圍內(nèi)流行,貓科動物感染FHV-1后,80%會出現(xiàn)持續(xù)性感染,而持續(xù)性感染的貓中約有45%會由于自然壓力等原因?qū)ν馀哦?70%由于使用糖皮質(zhì)激素而對外排毒[1]。在宿主組織中的潛伏是皰疹病毒的關(guān)鍵特征。在初次感染期間,FHV-1病毒粒子侵入宿主組織內(nèi)三叉神經(jīng)的感覺神經(jīng)末梢并傳播到三叉神經(jīng)節(jié),三叉神經(jīng)節(jié)位于顱底中顱窩的顳骨巖部凹陷中,FHV-1在這里形成潛伏感染[2]。雖然潛伏感染是一個臨床靜止階段,但潛伏期相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(latency associated transcript,LAT)的轉(zhuǎn)錄,在維持潛伏期和允許復(fù)發(fā)性疾病方面所發(fā)揮的作用仍有待深入研究。組織中LAT的鑒定被認(rèn)為是組織充當(dāng)病毒潛伏位點(diǎn)的證據(jù)。雖然三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)的潛伏期已被證實(shí),但關(guān)于FHV-1是否能夠維持其他組織內(nèi)的潛伏期存在爭議。人類皰疹病毒LAT已在人類角膜中鑒定出來,但通過RT-PCR檢測,并未在臨床正常的貓角膜中鑒定出LAT,這表明貓角膜不支持 FHV-1 的潛伏期。

1.2 病毒形態(tài)

FHV-1為圓形或橢圓形病毒,正20面體對稱,直徑約為120～180 nm,因病毒粒子所處位置和生長時間的不同而有所差異。病毒粒子由核衣殼和囊膜組成,核衣殼包括衣殼和芯髓,芯髓中含有大量遺產(chǎn)物質(zhì),為雙鏈DNA,被六角形病毒衣殼核心包裹,衣殼外層為雙層囊膜結(jié)構(gòu),由162個殼粒構(gòu)成,表面被整齊排列的纖突覆蓋。

1.3 病毒理化特性

FHV-1在外界環(huán)境中存活率較低。FHV-1對溫度敏感性強(qiáng),56 ℃下可在30 min內(nèi)被滅活,4 ℃下可存活5個月[3],長期保存應(yīng)在-80 ℃。FHV-1對有機(jī)溶劑敏感,可被多種消毒劑滅活。FHV-1對酸、堿溶液抵抗性差,pH低于5.0或高于8.0時,FHV-1可被滅活。

1.4 致病機(jī)理

FHV-1主要通過膜融合和胞吞侵入宿主細(xì)胞,主要在上呼吸道復(fù)制,嚴(yán)重時也會出現(xiàn)在肺臟等內(nèi)臟器官中。FHV-1在囊膜蛋白和衣殼蛋白的保護(hù)作用下,在宿主免疫細(xì)胞中進(jìn)行大量增殖,攻擊中樞免疫器官,導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降,引起繼發(fā)感染。FHV-1具有潛伏期,可潛伏存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,潛伏期的FHV-1處于非復(fù)制狀態(tài),且機(jī)體不表現(xiàn)任何臨床癥狀。FHV-1主要潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)、翼腭窩和顱頸神經(jīng)節(jié)中,同時也可潛伏于呼吸道和其他神經(jīng)系統(tǒng),感染過FHV-1的貓幾乎都會終身攜帶FHV-1,一旦受到外界刺激,便會經(jīng)歷病毒再激活或周期性活化。

1.5 基因組結(jié)構(gòu)

FHV-1的基因組結(jié)構(gòu)為雙股DNA,核苷酸長度約為126～134 kb,其中GC約占總基因組大小50%[4]。FHV-1基因組由長獨(dú)特區(qū)( unique long region,UL)、短獨(dú)特區(qū)(unique short region,US)、末端重復(fù)序列(terminal repeat short,TRs)和反向重復(fù)序列(inverted repeat short,IRs)4部分組成[5]?，F(xiàn)已知,FHV-1基因組有78個開放性閱讀框,其中UL區(qū)63個,US區(qū)12個[6],可編碼約74種蛋白質(zhì),主要包括毒力蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、復(fù)制酶等,也可將其分為病毒特異性蛋白和病毒囊膜糖蛋白。病毒囊膜糖蛋白又分為必要糖蛋白和非必要糖蛋白,共8種,它們在識別宿主細(xì)胞受體、介導(dǎo)細(xì)胞融合、病毒復(fù)制與感染的過程中起極為重要的作用。其中g(shù)B、gD、gH和gL為必需糖蛋白,在病毒復(fù)制與感染的過程中不可缺失,非必需糖蛋白為gE、gG、gI、gC,主要作用于病毒的復(fù)制過程[7]。

1.6 結(jié)構(gòu)蛋白及其功能

gB蛋白為組成FHV-1囊膜的重要成分,作用于FHV-1的復(fù)制和感染,屬于重要的免疫蛋白。gB蛋白是一種極為保守的囊膜糖蛋白,在皰疹病毒不同毒株間的不同組成蛋白中具有較高同源性,有研究表明[8],不同毒株間的gB蛋白存在相似的功能,可實(shí)現(xiàn)互相替代。gB蛋白可與gC蛋白共同作用,識別肝素樣受體,并可刺激宿主產(chǎn)生中和性抗體。而gB蛋白也能誘導(dǎo)小鼠和家兔產(chǎn)生高水平的中和抗體來抑制病毒復(fù)制。故對gB蛋白的深入研究對抗FHV-1感染的疫苗研發(fā)起重要作用。

gD蛋白亦是FHV-1病毒囊膜的主要組成成分之一,存在于被感染細(xì)胞的細(xì)胞膜中。gD蛋白具有種屬特異性,gD蛋白所具備的血凝性,可導(dǎo)致不同α皰疹病毒亞科成員對紅細(xì)胞產(chǎn)生差異性凝集[9]。gD蛋白主要作用于病毒復(fù)制和刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,還可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[10]。據(jù)研究[11],FHV-1 gD蛋白對貓?jiān)醇?xì)胞系具有特異性吸附作用,故表明gD蛋白在FHV-1的宿主選擇過程中起重要作用。此外,用通過親和層析技術(shù)從FHV-1中純化得到的gD蛋白刺激小鼠和家兔,同樣可產(chǎn)生較高水平的抗體以抑制病毒的感染。故在FHV-1相關(guān)試劑、藥物、疫苗等研發(fā)方面,gD蛋白亦可作為研究重點(diǎn)。

gC、gE、gG、gI蛋白屬于8種FHV-1囊膜糖蛋白中的非必需糖蛋白,目前對其生物學(xué)的研究相對匱乏。gC蛋白在FHV-1吸附宿主細(xì)胞初期起介導(dǎo)作用,可刺激細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答,屬于主要的肝素結(jié)合糖蛋白[12]。同時,gC基因也屬于FHV-1重要的毒力基因。gE蛋白主要作用于FHV-1復(fù)制過程,可在宿主細(xì)胞融合的過程中起介導(dǎo)作用,趨化病毒轉(zhuǎn)移至神經(jīng)系統(tǒng)。gE基因是FHV-1的毒力基因之一,多種基因的共同作用最終決定了FHV-1的毒力強(qiáng)弱。gG蛋白是一種屬于病毒趨化因子結(jié)合蛋白(vCKBP)家族的外分泌蛋白。gG基因編碼的蛋白以分泌形式和膜錨定形式存在,分泌形式蛋白水解裂解產(chǎn)生膜錨定形式蛋白,兩種形式蛋白均可結(jié)合趨化因子。gI蛋白亦為毒力相關(guān)蛋白,可對細(xì)胞融合和病毒擴(kuò)散起作用,同時,gD蛋白對病毒的體外復(fù)制增殖也起促進(jìn)作用[13]。為更加全面了解FHV-1的感染、復(fù)制機(jī)制,應(yīng)加強(qiáng)對非必需糖蛋白的研究。

1.7 非結(jié)構(gòu)蛋白

FHV-1非結(jié)構(gòu)蛋白主要有核酸復(fù)制的相關(guān)酶、衣殼蛋白和影響病毒毒力的非結(jié)構(gòu)蛋白等,其中較為常見的非結(jié)構(gòu)蛋白有核苷酸還原酶RR、絲氨酸/蘇氨酸激酶PK、胸苷激酶TK等。非結(jié)構(gòu)蛋白的作用主要體現(xiàn)于FHV-1的DNA復(fù)制、包裝釋放、基因調(diào)節(jié)和細(xì)胞融合等方面。胸苷激酶TK可影響FHV-1毒力,主要作用于核酸的代謝過程,是重要的毒力相關(guān)蛋白之一[14]。此外,TK也是用于FHV-1生物信息分析的重要基因,可用作對FHV-1的基因鑒定和遺傳進(jìn)化分析。

2 流行病學(xué)

自1958年美國首次將FHV-1分離出來起,許多國家也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了該病毒,包括加拿大、瑞士、英國、荷蘭、匈牙利、日本等[15]。我國也多次成功分離到了FHV-1。據(jù)研究表明,FHV-1呈世界性分布,有很強(qiáng)的種屬特異性,對所有貓科動物均易感染,近年來在野貓、獵豹、東北虎、華南虎甚至犬和龍貓身上均分離到了該病毒[16]。FHV-1主要通過感染易感貓的結(jié)膜、上呼吸道進(jìn)行增殖,并可存在于神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi),使其終身潛伏帶毒。因此,臨床康復(fù)貓是病毒的主要攜帶者,它們會經(jīng)歷周期性的病毒再激活,特別是在產(chǎn)生應(yīng)激后。FVR為高度接觸性傳染病,而受感染貓和易感貓之間的直接接觸則是主要傳播途徑,易感貓直接接觸受感染貓的眼、鼻、口分泌物,或間接接觸被污染的食物、水源、住所等都會被感染,此外,貓?jiān)诎l(fā)情期交配也可引起感染FVR。居住環(huán)境衛(wèi)生條件差,也會引起FHV-1的傳播,但FHV-1在外界環(huán)境中無法長時間生存,所以環(huán)境因素不會成為長期感染源。FHV-1的發(fā)病率較高,在多貓聚集地甚至能達(dá)到100%,各年齡段的貓均易感染,其中幼貓對FHV-1極易感染,然而,由于母源抗體的免疫保護(hù),大多數(shù)2周齡以內(nèi)的幼貓通常不表現(xiàn)出臨床癥狀,進(jìn)入潛伏感染階段,4周齡以后,隨著母源抗體減少,幼貓較易發(fā)生感染,且病死率高達(dá)50%。

由于人們對寵物貓健康問題的關(guān)注度不斷提高,且貓作為實(shí)驗(yàn)動物,在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛,我國對FHV-1的相關(guān)研究依然較為匱乏,故近年來各地區(qū)都開始加強(qiáng)了對FHV-1的調(diào)查研究,以了解FHV-1的進(jìn)化變異情況,完善實(shí)驗(yàn)用貓的標(biāo)準(zhǔn),為FHV-1的相關(guān)藥物研發(fā)提供依據(jù)。王吉等[17]在2020年通過對來自北京地區(qū)3月齡～19歲的142只貓進(jìn)行分析檢測,FHV-1感染率為41.92%,其中幼貓和老齡貓感染率分別為77.78%和60.00%,雌性貓比雄性貓感染率高9.63%,流浪貓比家貓高14.03%。鐘雪[18]收集了廣東地區(qū)2018-2020年共1 292份樣本,2018樣本陽性率為8.3%,2019樣本陽性率為7.7%,2020年為9.8%。楊玥晗[19]調(diào)查了2020年安徽地區(qū)的300份病例,FHV-1感染率為45.4%,無癥狀組均為陰性,有癥狀組中家貓感染率為10%,流浪貓為20%。李麗景等[20]采集了2020-2021年四川地區(qū)的樣品共340份,陽性檢出率為17.94%,其中健康樣本檢出率為14.65%,發(fā)病樣本檢出率為20.77%。謝畫畫[21]2021年從上海地區(qū)3家寵物醫(yī)院中收集了患病貓的眼鼻分泌物樣本500份,其中FHV-1的感染概率為57.8%。張東陽[22]在2021年對新疆地區(qū)23家寵物醫(yī)院中收集的140例貓上呼吸道病例進(jìn)行分析,其中FHV-1陽性檢出率為37.14%,幼貓發(fā)病率為60%,春、冬兩季發(fā)病率較高。孫厚民等[23]采集了2019-2021年山東地區(qū)貓眼鼻拭子樣本218份,其中FHV-1陽性檢出率為10.1%,幼貓陽性率為13.6%,成年貓為7.0%。綜上研究可知,FHV-1的感染與貓的年齡、性別、品種、免疫程度以及所處地域、季節(jié)和生活環(huán)境均有關(guān),且北方地區(qū)FHV-1的感染率相對較高。

3 臨床癥狀

FHV-1主要對貓科動物的眼部和呼吸系統(tǒng)造成損傷,根據(jù)感染毒株、動物年齡、免疫情況和其他因素的不同,臨床癥狀也會出現(xiàn)差異,感染后的潛伏期也會隨之改變。動物感染FHV-1后,初期會出現(xiàn)發(fā)熱、食欲不振、精神萎靡、眼鼻分泌物增多等癥狀。隨著病程的推移,呼吸道出現(xiàn)的病理變化表現(xiàn)為鼻腔彌漫性充血,舌和硬腭潰瘍,淋巴結(jié)腫大;眼部會出現(xiàn)結(jié)膜炎、角膜炎、結(jié)膜水腫甚至短暫性或永久性失明等癥狀;FHV-1還會感染生殖系統(tǒng),引發(fā)炎癥表現(xiàn);孕貓感染FHV-1后,多會影響產(chǎn)仔的成活率。病情嚴(yán)重時,患病動物還會出現(xiàn)繼發(fā)感染,引起病毒血癥、急性肺炎并侵害神經(jīng)系統(tǒng),從而引起神經(jīng)癥狀。有些成年貓感染FHV-1后表現(xiàn)耐過,康復(fù)后病毒潛伏于神經(jīng)系統(tǒng)、扁桃體、淋巴結(jié)、鼻甲骨和口鼻眼分泌物當(dāng)中,造成持續(xù)性潛伏感染,幾乎不表現(xiàn)臨床癥狀,但會在產(chǎn)生應(yīng)激后向體外排毒,這就給FVR的診治工作造成了一些困難。

4 病理變化

感染FHV-1后,患貓病理變化主要體現(xiàn)在上呼吸道,表現(xiàn)為充血、潰瘍甚至壞死。發(fā)病初期鼻腔上皮病變,細(xì)胞質(zhì)水腫變性,氣管中杯狀細(xì)胞黏液減少;隨著病情加重,鼻腔上皮細(xì)胞壞死,并伴有炎性細(xì)胞浸潤,毛細(xì)血管和小靜脈受損,鼻腔內(nèi)充滿中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維蛋白等,淋巴結(jié)腫大,出現(xiàn)大小不等的出血點(diǎn),皮質(zhì)和髓質(zhì)充滿淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞的混合物;嚴(yán)重時,鼻腔則出現(xiàn)骨溶性病變和缺血性壞死,并出現(xiàn)支氣管炎和間質(zhì)性肺炎,肺小葉結(jié)締組織壞死,肺泡壁血管擴(kuò)張、充血,肺泡壁增厚,肺泡腔出現(xiàn)紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞,表現(xiàn)為充血和炎性細(xì)胞浸潤。

5 檢測方法

感染FHV-1的臨床癥狀與感染FCV和上呼吸道感染衣原體、支原體的癥狀極為相似,故從臨床表現(xiàn)來看,難以判斷是否感染FHV-1,因此需要通過病原學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等方法進(jìn)行鑒定。

5.1 病原學(xué)檢測

FHV-1感染貓后,可存在于患病貓的鼻喉部和結(jié)膜處,通常采集患病貓的眼鼻拭子,將拭子懸液進(jìn)行無菌化處理后接種于貓腎細(xì)胞,觀察細(xì)胞病變狀態(tài),從而進(jìn)行判斷,因沒有固定評判標(biāo)準(zhǔn),所以病原學(xué)檢測并不實(shí)用。且FHV-1僅可在患病貓急性感染時易分離到,慢性感染時則難以分離到[24]。

5.2 血清學(xué)檢測

將擴(kuò)增分離的病毒進(jìn)行純化處理,再通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescence assay,IFA)、中和試驗(yàn)(serum neutralization test,SNT)等進(jìn)行進(jìn)一步鑒定[25]。血清學(xué)檢測具有較高的特異性和靈敏性。

5.3 分子生物學(xué)檢測

感染FHV-1的貓可能處于急性感染、慢性感染、潛伏感染或繼發(fā)感染等不同時期。不同感染時期的FHV-1均可被聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)快速準(zhǔn)確的檢測到,根據(jù)FHV-1基因中的保守片段設(shè)計(jì)引物,將FHV-1核酸進(jìn)行擴(kuò)增,通過電泳成像,基因測序,做出準(zhǔn)確鑒定,還可通過實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行鑒定。周紅蕾等[26]建立的FHV-1、FCV、支氣管敗血波氏菌(Bordetellabronchiseptica)多重?zé)晒舛縋CR檢測方法特異性強(qiáng),準(zhǔn)確性高,且對FHV-1、FCV和Bb的最低檢出限分別為10、10、100拷貝/μL,此方法可提高對貓上呼吸道疾病的檢測效率,為患貓?zhí)峁┛焖贉?zhǔn)確的診治方案。

5.4 快速檢測方法

由于血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測的成本較高,耗時較長,且存在一定的操作難度,不太適用于寵物臨床診斷。近年來為了可以快速檢測FHV-1,已建立出很多對FHV-1的快檢方法。

5.4.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplificatio,LAMP)是一種在鏈置換DNA聚合酶作用下,恒溫?cái)U(kuò)增核酸的檢測方法,將LAMP的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用基因鏡進(jìn)行觀察,檢測其熒光值,從而判斷產(chǎn)物是否陽性。此方法成本低,操作便捷,耗時短,1 h左右就可對樣本進(jìn)行檢測。冀中豪等[27]建立了一種檢測FHV-1的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法,該方法利用金屬浴、烘箱、恒溫水浴鍋與PCR儀分別進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果均達(dá)到LAMP要求,出現(xiàn)特異性梯形條帶,最低檢限為10拷貝/μL,靈敏性較高。

5.4.2 重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增-側(cè)流層析試紙檢測技術(shù) 重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增-側(cè)流層析試紙(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)檢測技術(shù)是一種結(jié)合重組聚合酶擴(kuò)增檢測(RPA)與側(cè)流層析試紙技術(shù)(LFD)的新興檢測方法。該方法特異性較強(qiáng),靈敏度也較高,且操作便捷,家用微波爐煮沸樣品后體溫孵育,可在檢測條件有限的情況下實(shí)現(xiàn)FHV-1的檢測,僅需20 min即可得出結(jié)果,較為適用于寵物醫(yī)院對FHV-1的臨床檢測。Liu M Z等[28]建立出了一種用于檢測FHV-1的RPA-LFD檢測方法,此方法針對gD基因擴(kuò)增,最低檢限為103拷貝/μL,雖靈敏性與普通PCR相近,但實(shí)際檢出率略高于普通PCR。

5.4.3 重組聚合酶擴(kuò)增-Cas12a反式酶切反應(yīng)-側(cè)流層析試紙條檢測技術(shù) 重組聚合酶擴(kuò)增-Cas12a反式酶切反應(yīng)-側(cè)流層析試紙條(recombinase polymerase amplification-Cas12a-lateral flow dipstick,RPA-Cas12a-LFD)檢測技術(shù)是以重組聚合酶擴(kuò)增(RPA)、Cas12a反式酶切反應(yīng)以及側(cè)流層析試紙條(lateral flow dipstick,LFD)顯示技術(shù)為基礎(chǔ)所建立的快速可視化分子檢測方法。該方法由黃堅(jiān)等[29]首次建立,針對TK基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,利用體外合成的crRNA引導(dǎo)CRISPR-Cas12a識別經(jīng)RPA擴(kuò)增的核酸序列,而后利用Cas12a的附帶切割活性降解反應(yīng)體系中的ssDNA探針,最后在LFD上出現(xiàn)標(biāo)記信號,以此來判斷檢測結(jié)果,結(jié)果顯示RPA-Cas12a-LFD法對20份臨床樣本的檢出率為35%,陽性符合率100%,效果較理想。

5.4.4 交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 交叉引物等溫?cái)U(kuò)增(cross priming amplificatio,CPA)技術(shù)是一種利用顯色劑SYBR Green和恒溫水浴鍋進(jìn)行病毒核酸擴(kuò)增的新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),該技術(shù)可直接觀察到檢測結(jié)果的顯色變化,使檢測更加方便快捷,實(shí)現(xiàn)了結(jié)果的可視化,提高了檢測效率。Tan Y X等[30]利于簡單的恒溫儀器,在BstDNA聚合酶作用下,63 ℃反應(yīng)45 min,完成了目的基因的快速擴(kuò)增,再通過SYBR Green Ⅰ染料實(shí)現(xiàn)結(jié)果的可視化,從而建立了一種CPA檢測法,此方法最低檢限為100拷貝/μL,陽性檢出率為100%,檢測效果較優(yōu)于普通PCR。

5.4.5 膠體金速測卡 膠體金速測卡檢測FHV-1的原理是待測樣本中的FHV-1與膠體金顆粒標(biāo)記的FHV-1單克隆抗體結(jié)合,二者形成的抗原抗體復(fù)合物因毛細(xì)作用逐漸向檢測線移動,與檢測線上固定的FHV-1單克隆抗體再次結(jié)合并呈現(xiàn)紅紫色,由此得出檢測結(jié)果。膠體金速測卡因其成本低,操作方便而被廣泛應(yīng)用于寵物的臨床診斷,該方法雖可快速得出檢測結(jié)果,但結(jié)果存在一定誤差,且該方法對于低濃度FHV-1和混合性感染無法判斷,因此難以做出精確診斷[31]。張君等[32]將膠體金檢測方法與熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行對比,熒光定量PCR檢測方法的靈敏度為100%,而膠體金檢測方法的靈敏度為57.3%。蕭晟等[33]將膠體金檢測方法與普通PCR檢測和熒光定量PCR檢測同時對比,熒光定量PCR檢出率為71%,普通PCR檢出率為57%,而膠體金速測法檢出率為29%。

5.4.6 重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(recombinase aided amplification,RAA)是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),對溫度的要求不高,利用簡單的加熱設(shè)備,在核酸外切酶作用下,37～42 ℃恒溫條件下,即可完成核酸的指數(shù)倍擴(kuò)增[34]。此方法耗時短、操作便捷、結(jié)果讀取多元化。王穎等[35]針對UL55序列設(shè)計(jì)出特異性探針和引物,建立出FHV-1的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法,此方法最低檢限為76拷貝/μL,其靈敏性高于普通PCR,且特異性較好,與其他病原無交叉反應(yīng)。

5.4.7 核酸可視化檢測技術(shù) 核酸可視化檢測技術(shù)是一種將RAA技術(shù)和封閉式一次性核酸可視化免疫層析試紙裝置相結(jié)合的核酸檢測技術(shù)。該方法對儀器設(shè)備和溫度要求較低,操作簡單、反應(yīng)迅速,只需將反應(yīng)體系置于適宜溫度內(nèi)反應(yīng)20～30 min,然后通過封閉式一次性核酸可視化試紙裝置觀察檢測結(jié)果。劉美慧等[36]建立了一種針對FHV-1 TK基因的核酸可視化檢測方法,最低檢限為14.2拷貝/μL,且與FCV、FPV等常見病原均為交叉反應(yīng),有較好的特異性和靈敏性。該方法的建立有利于FHV-1的快速檢測,可適用于寵物醫(yī)院或基層單位,有利于對臨床病例快速制定出有效的治療方法。

6 防控方法

6.1 預(yù)防方法

FHV-1的傳染源不僅只有處于感染或潛伏感染的動物,還有患病動物所接觸過食物、水源、貓舍、飼養(yǎng)人員等,尤其是貓群密集的地方,FHV-1的感染與傳播程度更高。為了有效預(yù)防FHV-1的擴(kuò)散,需要定期通風(fēng)清潔,保持適宜的溫度和濕度,及時對感染動物進(jìn)行隔離,并對動物的生活住所進(jìn)行消毒處理。為了更好的預(yù)防FHV-1感染,最主要的措施是接種疫苗,現(xiàn)有的疫苗分為弱毒疫苗和滅活疫苗,其中弱毒疫苗雖然也可誘導(dǎo)易感動物產(chǎn)生相應(yīng)抗體,但更易引起動物潛伏感染。相比下,滅活疫苗的應(yīng)用更為安全廣泛,國內(nèi)使用的也只有滅活疫苗,常用的滅活疫苗為貓三聯(lián)滅活疫苗,可對FHV-1、FCV、FPV進(jìn)行預(yù)防。接種疫苗后,雖不能完全預(yù)防病毒感染,但可一定程度上減少病毒的感染與復(fù)發(fā),減輕感染后的臨床癥狀,疫苗的免疫程度還與易感貓的年齡、品種、生活條件等有關(guān)。

6.2 治療方法

目前,對FHV-1的感染并無特效藥,可治療FVR的抗病毒藥物有西多福韋、三氟胸苷、干擾素、食源性L-賴氨酸等,但由于這些藥物成本高,效果一般,所以很少被應(yīng)用于臨床治療。主要通過對癥治療和支持治療的方式對FVR進(jìn)行治療,以減緩病癥。感染動物的臨床癥狀主要表現(xiàn)在眼部和上呼吸道,針對眼部感染和呼吸道感染的病癥進(jìn)行治療,并配合使用廣譜抗菌藥物,以減少繼發(fā)感染。若發(fā)生繼發(fā)感染,出現(xiàn)病情惡化,需使用抗菌藥物和收斂類藥物進(jìn)行治療。當(dāng)臨床癥狀較為嚴(yán)重,患病動物無法主動攝取食物和飲水時,還需通過靜脈輸液來補(bǔ)充營養(yǎng),維持代謝平衡,以減緩病癥。對于出現(xiàn)復(fù)發(fā)性角膜炎或結(jié)膜炎的成年貓,抗病毒藥物是主要的治療方法,此外,壓力也是引起疾病復(fù)發(fā)的主要原因之一,這些壓力源可能包括并發(fā)的全身或局部皮質(zhì)類固醇給藥、分娩和哺乳、與其他病原的合并感染、環(huán)境的變化等。因此,及時的識別并減少壓力源對防止疾病復(fù)發(fā)和治療疾病方面有較大的幫助。對于患有慢性間質(zhì)角膜炎的成年貓,治療選擇則是有限的,從理論上講,需要進(jìn)行抗炎或免疫抑制治療,但這種治療方案存在著誘導(dǎo)病毒復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),因此仍需研究出更好的治療方法?；疾游锞幼…h(huán)境也應(yīng)保暖通風(fēng),滅菌消毒,但要注意避免消毒劑中毒。

7 結(jié)語

雖然FHV-1的毒性較強(qiáng),對貓科動物造成的危害較大,近年來在野貓、獵豹、東北虎等野生貓科動物身上均發(fā)現(xiàn)了該病毒,還出現(xiàn)了在犬身上分離到FHV-1的案例,且FHV-1還存在著感染人類的風(fēng)險(xiǎn)。目前分離到的FHV-1病毒株數(shù)量相對較少,尚未研制出免疫原性好、效價高的疫苗,國產(chǎn)FHV-1疫苗研究板塊缺失,也未研制出治療FVR的特效藥物。但我國對FHV-1的重視程度依然不夠,對FHV-1的相關(guān)研究也僅局限于寵物臨床診療,病毒感染發(fā)病機(jī)制及機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制的相關(guān)研究缺乏。因此,要加強(qiáng)對FHV-1的病原學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、臨床診斷等方面的研究,這對于貓科動物的健康問題至關(guān)重要。