2021-2022年河南省豬細(xì)小病毒1～7型檢測與分析

郭全海,許夕雅,石蒙蒙,楊 寒,高冬生,王永生,陳 陸*

(1.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院牧醫(yī)學(xué)院,河南商丘 476100;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,河南鄭州 450046)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是細(xì)小病毒科一類單鏈無囊膜的DNA病毒,其基因組大小約為4～6.3 kb[1],兩端有回文序列。PPV最早于1965年在德國首次發(fā)現(xiàn),并于1967年從豬流產(chǎn)胎兒的器官中成功分離[2]。該病毒可引起初產(chǎn)母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎、延遲發(fā)情等[3]。近些年,不斷發(fā)現(xiàn)新型豬細(xì)小病毒,經(jīng)典PPV被定義為PPV1,PPV則被定義為PPV1～PPV7的統(tǒng)稱。2001年,Hijikata M等[4]在緬甸首次在豬血清中發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒2型(Porcine parvovirus 2,PPV2);2008年,香港學(xué)者在豬樣品中發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒3型(Porcine parvovirus 3,PPV3);2009年,美國科研人員首次報道在北卡羅來納州檢測到豬細(xì)小病毒4型(Porcine parvovirus 4,PPV4);2013年,Xiao C T等[5]首次于美國育肥豬肺中發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒5型(Porcine parvovirus 5,PPV5);2014年,Ni J等[6]在中國豬流產(chǎn)胎兒的組織樣品中發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒6型(Porcine parvovirus 6,PPV6);同年,Xing X等[7]在中國首次從血清中檢測到豬細(xì)小病毒7型(Porcine parvovirus 7,PPV7);2016年,Palinski R M等[8]首次報道在健康成年豬的肛拭子中發(fā)現(xiàn)了PPV7。之后全球多個國家相繼報道了涵蓋上述7種PPV的流行情況,它們大多以引種方式傳入[9]。PPV2～PPV7在國內(nèi)外豬群中廣泛流行,PPV2是世界公認(rèn)的感染率最高的型,約為20%～40%[10-12],肺部組織的檢出率為48.8%[13],扁桃體中PPV1～PPV4的檢出率為44%～83%[14]。我國的PPV3感染率為43.23%～51.30%,分布在江蘇、上海、浙江、安徽等11個省市,在血清、肝臟、肺臟等組織器官中均可檢測到[15-16]。 PPV5多發(fā)現(xiàn)于臨床表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病、腹瀉、全身性疾病或生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病豬[5]。我國的PPV6感染分布在北京、江蘇、天津和四川,流產(chǎn)胎兒(50%)和仔豬(75%)的患病率明顯高于育肥豬(15.6%)和母豬(3.8%)。PPV7具有相對廣泛的組織趨向性,病豬的血清、肝、肺、腹股溝淋巴結(jié)、脾和腎均可檢測到PPV7[8]。根據(jù)NS1蛋白序列同源性,PPV分為4個不同的細(xì)小病毒屬,即Protoparvovirus(PPV1)[17]、Tetraparvoviru(PPV2～PPV3)、Copiparvovirus(PPV4～PPV6)和Chapparvovirus(PPV7)[18]。PPV1～PPV7有相似的病毒結(jié)構(gòu),PPV4具有獨特的ORF3,其編碼1個功能未知的蛋白(類似“Y”或“T”形狀),但PPV1～PPV7基因組同源性較低[19](31.1%～37.0%)。這些PPV是否可引起豬群發(fā)病仍在探索中,基于此,需要引起人們的重視,對PPV1～PPV7持續(xù)監(jiān)測。

為了解河南省PPV1～PPV7流行現(xiàn)狀,本研究通過對河南省不同地區(qū)2021-2022年P(guān)PV1～PPV7進(jìn)行PCR檢測,分析不同地區(qū)、季節(jié)、生長階段、樣品類型的流行情況及其與豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)混合感染的情況,以期為臨床診斷和疫病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病防控實驗室從河南省豬場于2021-2022年送檢樣品中選取748份(有合樣),包括275份血樣、78份口腔液、406份肺脾淋巴結(jié),為臨床上有呼吸困難、厭食、高熱、咳嗽癥狀或檢出PCV2、PRRSV或無癥狀的豬樣品;PRRSV(cDNA)、PCV2核酸,由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病防控實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 2×TaqMaster Mix、DNA Marker,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品;T100TMPCR儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;全自動樣品快速研磨儀Tissuelyser-48L,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品;天隆GeneRotex96核酸提取儀,西安天隆科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 通過對比分析NCBI數(shù)據(jù)庫中多條PPV1～PPV7的全基因組序列,找到各自保守區(qū)利用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物(表1),其中PCV2引物為本實驗室保存設(shè)計序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物信息

1.2.2 樣品處理及核酸提取 將肺脾淋巴結(jié)剪碎,加入1 mL ddH2O用自動研磨儀研磨3 min成勻漿后凍融3次;向口腔液中加入1 mL ddH2O置于渦旋儀混勻,然后肺脾淋巴結(jié)勻漿、口腔液、血樣均8 000 r/min離心3 min后取上清,利用GeneRotex96核酸提取儀及配套試劑盒自動化程序完成核酸提取。

1.2.3 樣品檢測 以1.2.2中提取的核酸為模板,分別利用表1中相應(yīng)引物對748份樣品核酸進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL:2×TaqMaster Mix 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min預(yù)變性;95 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s(退火溫度參考表1),72 ℃ 30 s(擴(kuò)增片段>1 000 bp 時,延伸時間為45 s),共29個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。電泳鑒定,將有目的條帶的確定為陽性。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 將樣品檢測結(jié)果輸入Excel軟件,分析6種PPV感染的情況,包括其在不同地區(qū)、季節(jié)、生長階段、樣品類型中的感染情況及6種PPV之間、其與PCV2、PRRSV混合感染的情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PPV1～PPV7經(jīng)特異性引物擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物電泳后,除PPV4未檢到陽性外,分別在約1 600、1 000、900、600、800、400 bp處觀察到目的條帶(圖1),與預(yù)期片段大小相符。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～6.依次為PPV1、PPV2、PPV3、PPV5、PPV6、PPV7 PC擴(kuò)增結(jié)果

2.2 樣品檢測結(jié)果

2.2.1 PPV1～PPV7的檢測結(jié)果 對748份樣品檢測結(jié)果顯示,PPV2和PPV7的感染率較高,分別是16.04%(120/748)、15.11%(113/748),其次是PPV6為6.55%(49/748),PPV1、PPV3、PPV5的感染率均不到5%,分別為2.41%(18/748)、2.94%(22/748)、3.07%(23/748),其中365份樣品中未檢出PPV4。

2.2.2 不同地區(qū)6種PPV的感染情況 如圖2所示,PPV各型在河南省有廣泛的地理分布,總體上,豫南的感染率較高。各地區(qū)PPV2和PPV7的感染率均高于其他PPV,且除豫北外,PPV2的感染率均高于PPV7,豫南較明顯,豫西未檢出PPV3。豫北的樣品最多,但只有PPV3的感染率高于其他地區(qū),為5.29%(11/208),其他5種PPV的感染率均較低。

圖2 2021-2022年河南省不同地區(qū)PPV1/2/3/5/6/7感染情況

2.2.3 不同季節(jié)6種PPV的感染情況 按照春(3～5月)、夏(6～8月)、秋(9～11月)和冬(12月～次年2月)四季劃分,不同季節(jié)檢出結(jié)果見圖3。PPV各型一年四季均流行,PPV7秋季感染率最高,為23.96%(52/217),在春、夏、冬季PPV2的感染率相較于其他PPV高,夏季未檢出PPV5。

圖3 2021-2022年河南省不同季節(jié)PPV1/2/3/5/6/7感染情況

2.2.4 不同生長階段6種PPV的感染情況 不同生長階段檢測結(jié)果見圖4。不同生長階段豬群中PPV各型的感染率相差較大,從仔豬到育肥后期PPV各型整體呈現(xiàn)遞增態(tài)勢。在胎兒中,PPV2和PPV7的感染率較高,分別為8.79%(8/91)、7.69%(7/91),PPV3/5/6感染率較低,未檢測到PPV1;在仔豬中也發(fā)現(xiàn)了類似情況,PPV2的感染率最高,增加到15.69%,此階段未發(fā)現(xiàn)PPV1/3/5感染;PPV1/2/3/5/6/7的感染率逐漸上升,直到育肥后期,保育豬中PPV2感染率最高(19.84%,45/231),PPV7 次之(16.45%,38/231),育肥豬中PPV2 和PPV7感染均達(dá)到峰值,分別為20.34%(48/236)、24.58%(58/236);在母豬中,同樣均發(fā)現(xiàn)6種PPV感染,但整體較低,其中PPV2的感染率最高,為7.53%(11/146),其他PPV檢出率都不超過6%。

圖4 2021-2022年河南省各生長階段豬PPV1/2/3/5/6/7的感染情況

2.2.5 不同類型樣品6種PPV的感染情況 不同類型樣品檢測結(jié)果見圖5。PPV1/2/3/5/6/7在口腔液、血樣、肺脾淋巴結(jié)中均可檢出,口腔液和肺脾淋巴結(jié)檢出率較高?？谇灰褐袡z出率最高的是PPV2(23.08%,18/78),其次是PPV7(19.23%,15/78)。血樣中檢出率最高的是PPV2(9.45%,26/275),其次是PPV6(8.00%,22/275)。肺脾淋巴結(jié)中檢出率最高的是PPV7(20.94%,85/406),其次是PPV2(19.46%,79/406)。其他PPV檢出率都不超過8%。

圖5 2021-2022年河南省不同類型樣品PPV1/2/3/5/6/7的感染情況

2.2.6 混合感染情況 本研究分別統(tǒng)計了2021-2022年P(guān)PV1/2/3/5/6/7之間(表2,圖6)及與PCV2、PRRSV的混合感染情況。在PPV1/2/3/5/6/7之間混合感染情況研究中,未發(fā)現(xiàn)PPV單一感染,混合感染現(xiàn)象嚴(yán)重,多見于保育和育肥豬。相比于無癥狀豬樣品,PPV2更易在PPV7陽性樣品中檢出,共在32份樣品中發(fā)現(xiàn),除保育和育肥豬的組織樣品外,還在1份母豬口拭子、3份死胎、1份仔豬口拭子中檢出。PPV2、PPV7均可以與其他PPV混合感染,存在多重感染,雙重感染樣品數(shù)遠(yuǎn)高于三重、四重、五重感染。PPV2和PPV6的混合感染中,僅有1份在母豬血中檢出,其余均在保育和育肥豬的血或肺脾淋巴結(jié)中檢出。

圖6 PPV1/2/3/5/6/7之間混合感染情況

表2 PPV1/2/3/5/6/7之間混合感染情況

PPV1/2/3/5/6/7與PCV2混合感染率依次為4.17%(4/96)、26.04%(25/96)、6.25%(6/96)、6.25%(6/96)、8.33%(8/96)、37.50%(36/96)。其中PCV2陽性樣品中PPV的感染率高于陰性樣品,PPV7與PCV2混合感染最常見。PPV2、PPV7與PCV2的混合感染集中在保育和育肥豬,且多數(shù)豬只出現(xiàn)呼吸困難、發(fā)熱、咳嗽、厭食等癥狀,PPV2與PCV2的混合感染中育肥豬占比高出保育豬1倍。另外,此種感染偶見于拉稀仔豬,可從腸道和內(nèi)臟器官檢出。PPV1/3/5/6與PCV2混合感染及PPV3/5/6與PRRSV混合感染的豬只未見臨床癥狀,且未在仔豬中發(fā)現(xiàn)。PPV2、PPV7與PRRSV、PCV2的混合感染癥狀類似,PPV2與PRRSV的混合感染率(32.9 7%,30/91)高于PPV7與PRRSV(28.57%,26/91)。PPV1/3/5/6在PRRSV陽性樣品中的感染率低于PRRSV陰性樣品,其混合感染率依次為2.20%(2/91)、4.40%(4/91)、1.10%(1/91)、6.59%(6/91)。

3 討論

在病原核酸檢測中,PCR方法被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”,本研究利用該方法檢測了748份樣品,從不同地區(qū)、季節(jié)、生長階段、樣品類型4個方面對7種PPV感染情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明,PPV1/2/3/5/6/7在河南省豬群中廣泛流行,PPV2(16.04%)的感染率最高,這與PPV2是全世界最普遍的PPV[12,22-25]的研究是一致的;PPV7(15.11%)感染率次之;未檢測出PPV4,可能在2021-2022年河南省未發(fā)生該病毒的廣泛傳播,也可能是所選檢測樣本中不含該型病毒。何玉[26]研究也發(fā)現(xiàn)在2013-2014年中國多個省市均未檢PPV4。Li J等[23]、Lagan Tregaskis P等[27]、Huang L等[28]及Afolabi K O等[10]也發(fā)現(xiàn)PPV4感染率極低的特點。樣品檢測發(fā)現(xiàn)豫南PPV的檢出率高,豫北相對較低,秋、冬季的保育和育肥豬中較常見,這可能與地理位置及自然條件差別有關(guān)。趙潤澤等[30]研究湖北地區(qū)豬細(xì)小病毒流行情況,發(fā)現(xiàn)恩施地區(qū)感染率尤為高,同樣有同省不同地區(qū)檢出率差別大的現(xiàn)象。研究表明,PPV1主要危害初產(chǎn)母豬和血清學(xué)陰性的經(jīng)產(chǎn)母豬[22],PPV2～PPV7未成功分離培養(yǎng),其致病性暫不清楚。PPV1在保育、育肥豬中樣品中檢出,而在胎兒及仔豬中未檢出,這可能與母豬使用疫苗對該病毒阻斷及仔豬出生后獲得的母源抗體隨豬齡的增高而衰減有關(guān)。資料顯示,母豬抗體水平高是可以預(yù)防PPV1感染,而低的抗體水平可以減少感染豬的PPV1傳播[30],這說明了疫苗在很大程度上削弱了河南省PPV1的流行。

在患病保育和育肥豬的肺脾淋巴結(jié)中,PPV2/7檢出率較高,PPV6在血樣中檢出率較高,這一結(jié)果可能與不同型的PPV組織親嗜性不同有關(guān)。李厚偉等[31]研究發(fā)現(xiàn)PPV對豬腎臟、脾臟、淋巴結(jié)、妊娠母豬子宮的嗜性最強(qiáng),對肝臟的嗜性較弱。PPV2感染始于胎兒,并且隨著日齡增加感染率逐漸升高,育肥后期開始回落,與Kim S C等[12]、Milek D等[32]的研究結(jié)果一致。這一現(xiàn)象表明PPV2感染具有慢性特征,可以感染各個年齡段的豬,這可能是該型PPV檢出率高的重要原因。檢測結(jié)果表明,PPV7的感染與PPV2類似,同樣可以感染胎兒、哺乳仔豬保育豬育肥豬和成年豬,這與嚴(yán)美君等[33]研究結(jié)果一致。有資料表明,PPV7病毒具有相對廣泛的組織趨向性,在病豬的血清、肝臟、肺、腹股溝淋巴結(jié)、脾和腎臟中都能夠檢測到PPV7的存在[8],這可能是它檢出率高的因素。人們對PPV2及PPV7的致病性了解少、在引種和防控方面容易忽視它們也可能是傳播的另一原因。在本研究中檢出PPV2與PPV7的混合感染樣本比例大與之前研究的結(jié)果吻合。

本研究在樣本檢測PPV陽性樣品中,未發(fā)現(xiàn)單一感染,均是混合感染。有資料顯示,多數(shù)情況下,單獨感染PPV并不能引起未懷孕成年豬或仔豬產(chǎn)生臨床癥狀[34]?？赡苷沁@個原因,養(yǎng)殖人員不能及時的進(jìn)行病原檢測與凈化,導(dǎo)致該病毒在豬群中廣泛傳播,待混合其他病毒感染才出現(xiàn)臨床癥狀。本檢測中發(fā)現(xiàn)PPV與PCV2或PRRSV混合感染率高,可能與PPV對有絲分裂活性組織的趨向性有關(guān)。PPV可能通過刺激宿主細(xì)胞分裂和酶的產(chǎn)生來増強(qiáng)PCV2與PRRSV的復(fù)制,也可能通過減少宿主免疫保護(hù)和刺激病毒感染同一宿主細(xì)胞來促進(jìn)PVC2或其他病原體的感染[35]。有報道稱PPV2和PRRSV感染有明顯的正相關(guān)趨勢,PPV1～PPV7可作為PCV2復(fù)制的刺激因子,并加重PCV2相關(guān)疾病[12]。研究證實,豬細(xì)小病毒本身能引起繁殖障礙,還可以與PCV2及PRRSV混合感染,與繁殖障礙性疾病有協(xié)同作用[36],與本研究結(jié)果一致。根據(jù)檢測結(jié)果推測PPV2、PPV7并不直接導(dǎo)致母豬繁殖障礙而是與呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)。這與Li J等[23]、Kim S C等[12]的研究結(jié)果吻合。

目前市場上暫未流通PPV2～PPV7疫苗,PPV2/3/5/6/7感染率較PPV1高且它們之間的同源性較低,這說明PPV1疫苗很難對PPV2～PPV7產(chǎn)生交叉保護(hù)作用[1]。PPV1對外界環(huán)境的抵抗力很強(qiáng),豬場一旦感染很難消除,最好的防控措施是接種疫苗。鑒于PPV1的防控經(jīng)驗,在PPV2～PPV7沒有疫苗的情況下,飼養(yǎng)人員應(yīng)當(dāng)切實做好豬舍通風(fēng)和定期消毒工作,阻斷病原微生物的感染與傳播,堅持自繁自養(yǎng),確需引種的要做好監(jiān)測、消毒和隔離工作[37-38]。PPV與多種病原混合感染已是常態(tài),今后豬病的防控與凈化應(yīng)以多病原治理為思路。制定優(yōu)良的免疫程序,搭配科學(xué)的管理制度,強(qiáng)化疫病凈化,建立生物安全體系。就目前所知,本研究為首次對河南省PPV1～PPV7的檢測分析,可為河南省PPV防控提供新的參考。