仙客來枯萎病病原菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

宋卓琴 賈民隆 梁崢 梁曉霞 屈璐 王玉川 段九菊 曹冬梅

摘要 為了獲得高濃度的仙客來枯萎病病原菌的孢子懸液，通過對不同營養(yǎng)培養(yǎng)基進行初篩，再以初篩營養(yǎng)成分進行正交試驗，得到最佳營養(yǎng)配比，進一步通過單因素試驗對培養(yǎng)基的pH和培養(yǎng)溫度進行篩選。結(jié)果表明，馬鈴薯、綠豆、蔗糖為仙客來枯萎病病原菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的最佳營養(yǎng)成分，最佳配比為綠豆5.0%、蔗糖0.5%、馬鈴薯20%，培養(yǎng)基最佳pH為6，最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。研究結(jié)果明確了仙客來枯萎病病原菌的產(chǎn)孢條件，為仙客來枯萎病的感病機理、防治技術(shù)及孢子萌發(fā)抑制等研究奠定基礎(chǔ)，同時對指導(dǎo)實際生產(chǎn)中科學(xué)管理、綜合防治病害具有重要意義。

關(guān)鍵詞 仙客來枯萎??；病原菌；產(chǎn)孢培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件

中圖分類號 S682.2+62? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）10-0159-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.10.035

Optimization of? Sporulation Medium and Culture Conditions of the? Pathogen of? Cyclamen Wilt Disease

SONG Zhuo-qin，? JIA Min-long，? LIANG Zheng et al

（College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taiyuan，Shanxi? 030031）

Abstract In order to obtain a high concentration spore suspension of the pathogen causing Cyclamen wilt disease， different nutrient media were preliminarily screened， and then orthogonal experiments were conducted to obtain the optimal nutrient ratio based on the initial screened nutrients. Furthermore， single factor experiments were conducted to screen the pH and culture temperature of the media. The results showed that potatoes， mung beans， and sucrose were the optimal nutritional components for the sporulation culture medium of the pathogen of Cyclamen wilt disease. The optimal ratio was mung bean 5.0%， sucrose 0.5%， and potato 20%. The optimal pH of the culture medium was 6， and the optimal culture temperature was 30 ℃. Clarifying the spore production conditions of the pathogen causing Cyclamen wilt disease lays the foundation for the research on the pathogenic mechanism， prevention and control techniques， and spore germination inhibition of Cyclamen wilt disease. At the same time， it is of great significance for guiding scientific management and comprehensive prevention and control of diseases in actual production.

Key words Cyclamen wilt disease;Pathogenic bacteria;Spore producing culture medium;Cultivation conditions

基金項目 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年基金項目（YCX2020YQ11）。

作者簡介 宋卓琴（1985—），女，山西屯留人，助理研究員，碩士，從事觀賞植物生理、病理研究。

*通信作者，研究員，博士，從事觀賞植物分子生物學(xué)和栽培育種研究。

收稿日期 2023-07-19

仙客來（Cyclamen persicum Mill.），是報春花科仙客來屬多年生塊莖花卉，原產(chǎn)于地中海東部沿岸、希臘、土耳其南部、敘利亞、塞浦路斯等地，花冠五裂片呈長橢圓形向上翻卷、扭曲，形似兔耳，亦稱兔耳花、兔子花，且品種豐富，花期長達180～240 d，深受人們的喜愛［1-4］。2022年，仙客來全國的生產(chǎn)量達2 000萬盆左右，是我國重要的年宵花卉。

枯萎病是仙客來主要的一個真菌病害，發(fā)病率在35%左右，病菌以菌絲體、分生孢子、厚垣孢子隨病株殘體在土壤中越冬［4-5］，其中菌絲體可在土壤中腐生存活3年，此病具有發(fā)生突然、蔓延迅速、致死率高的特點［6-7］。植株感病后表現(xiàn)為葉片局部或全部黃化、萎蔫，葉柄水漬化，表皮開裂，最后變褐，直到整株死亡［8-10］，嚴重影響仙客來觀賞性和商品性，隨著仙客來大范圍種植及規(guī)模化生產(chǎn)，病害發(fā)生也逐漸加重，直接造成的損失可達2%～5%。

目前國內(nèi)對仙客來病害的研究主要集中在病害的化學(xué)防治、生物防治及栽培管理等方面［4-8］，而對于仙客來枯萎病病原菌的研究很少。2019年筆者所在項目組在長子方興仙客來種植基地采集枯萎病病株，并對病原菌進行了組織分離，經(jīng)初步鑒定病原菌為尖孢鐮刀菌。在此基礎(chǔ)上，對病原菌的生物學(xué)特性開展了一系列的研究，主要針對仙客來枯萎病病原菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了研究，通過培養(yǎng)基的初篩，及營養(yǎng)成分不同配比的正交試驗，確定培養(yǎng)基配方，進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，篩選出適宜病原菌生長的產(chǎn)孢培養(yǎng)基，從而探明仙客來枯萎病病原菌的生長特性，為仙客來枯萎病的病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

仙客來枯萎病病原菌由長子方興仙客來生產(chǎn)基地的病株分離、純化獲得。采用科赫法則驗證以及分子生物學(xué)鑒定確定該病原菌為尖孢鐮刀菌，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 培養(yǎng)基

病原菌的活化采用PDA培養(yǎng)基，選取7種不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基對病原菌進行培養(yǎng)，具體配方見表1。

1.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

分別選取馬鈴薯、綠豆、蔗糖的濃度作為3因素，每種因子設(shè)定3個水平，按正交表L9（34）（表2）組合的條件培養(yǎng)病原菌，每組試驗重復(fù)3次。培養(yǎng)方法參考“1.6”，測定方法參考“1.8”。

1.4 培養(yǎng)基pH的優(yōu)化

在“1.3”優(yōu)化獲得的培養(yǎng)基上分別比較培養(yǎng)基pH 4、5、6、7、8、9和10這7個梯度下的病原菌的生長情況及產(chǎn)孢情況。

1.5 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

在“1.4”優(yōu)化的基礎(chǔ)上分別比較培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35 ℃時病原菌生長情況及產(chǎn)孢情況。

1.6 培養(yǎng)方法

將病原菌在PDA培養(yǎng)基上活化后，用5 mm的打孔器取菌落邊緣長勢一致的菌塊接種至倒好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，在28 ℃的無菌培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.7 病原菌孢子懸液制備

將培養(yǎng)7 d的平板用刮針刮取菌苔并用無菌水多次清洗全部移入三角瓶中，并在漩渦儀上充分振蕩3 min，制得病原菌孢子懸浮液，用于孢子量的測定。

1.8 測定項目與方法

菌落生長速率的測定采用十字劃線法，接種后第2天開始測定菌落的直徑，連續(xù)測定5 d，菌落生長速率=菌落直徑/5 d。孢子量的測定采用血球計數(shù)板計數(shù)法。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010 和SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用LSD 法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營養(yǎng)成分培養(yǎng)基培養(yǎng)下仙客來枯萎病病原菌的菌落生長情況及產(chǎn)孢情況

仙客來枯萎病病原菌在7種不同營養(yǎng)成分培養(yǎng)基長勢不同，分生孢子產(chǎn)孢量差異顯著。由圖1可知，生長速率最快的是馬鈴薯培養(yǎng)基，PDA和PSA均顯著高于其他培養(yǎng)基，其次是綠豆培養(yǎng)基，仙客來培養(yǎng)基生長最慢。由圖2可知，綠豆培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量最大，達10.40×107個/mL，其次是PSA和PDA，OA培養(yǎng)基產(chǎn)孢量均處于中等，CMA、香蕉、仙客來葉片培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相對較少。PSA培養(yǎng)基生長的菌絲體最濃密，其次是綠豆培養(yǎng)基，CMA培養(yǎng)基菌絲生長最稀疏（圖3）。綜合考慮，選擇綠豆、馬鈴薯、蔗糖作為營養(yǎng)成分進行下一步的正交試驗，篩選最佳配比。

2.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)產(chǎn)孢培養(yǎng)基的初篩結(jié)果，選擇綠豆、蔗糖、馬鈴薯作為3因素，并設(shè)置3水平進行正交試驗（表2），對培養(yǎng)基的主成分進行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基組成。正交試驗結(jié)果見表3，由R1可以看出RB>RA>RC，因此各因素對生長速率的影響B(tài)>A>C，即培養(yǎng)基中蔗糖含量對病原菌的生長速率影響最大，由R2可以看出RC>RA>RB，因此各因素對分生孢子總量的影響C>A>B，即培養(yǎng)基中馬鈴薯含量對病原菌的產(chǎn)孢量影響最大。從表4可以看出，各因素對病原菌生長速率的影響均達極顯著水平，馬鈴薯含量對分生孢子總量的影響顯著，因此，通過正交試驗得出產(chǎn)孢培養(yǎng)基各因素的最佳比例為綠豆5.0%、蔗糖0.5%、馬鈴薯20%，產(chǎn)孢量達13.22×107個/mL。

2.3 基于正交試驗結(jié)果的產(chǎn)孢培養(yǎng)基pH優(yōu)化

以最佳培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將產(chǎn)孢培養(yǎng)基的pH調(diào)至4～10分別對病原菌進行培養(yǎng)，結(jié)果（圖4）顯示，病原菌的適應(yīng)性很強，在pH為4～10時都能生長，pH為4～6時，隨pH增大，病原菌的生長速率和產(chǎn)孢量均增加，當(dāng)pH為6時，生長速率和產(chǎn)孢量均達最高，顯著高于其他處理，當(dāng)pH大于6時，隨pH增大，病原菌的生長速率和產(chǎn)孢量逐漸降低，因此確定pH=6為病原菌的最適pH。

2.4 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

以最佳培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)溫度的優(yōu)化。由圖5可知，培養(yǎng)溫度在15～30 ℃，病原菌的生長速率和產(chǎn)孢量均呈上升趨勢，培養(yǎng)溫度為30 ℃時，生長速率和產(chǎn)孢量均達到最大值，顯著高于其他培養(yǎng)溫度，生長速率達11.61 mm/d，產(chǎn)孢量達13.85×107個/mL，培養(yǎng)溫度高于30 ℃后，病原菌的生長速率和產(chǎn)孢量迅速下降，35 ℃時最低，顯著低于其他培養(yǎng)溫度。因此，病原菌的最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。

3 結(jié)論與討論

對真菌的致病性、耐藥性及抗真菌藥物的研究中，快速大量獲取孢子懸浮液是這些研究的前提條件［11］。對枯萎病及其病原菌產(chǎn)孢條件的研究較多，但自然界中各種作物枯萎病病原真菌的種類很多，致病性、產(chǎn)生色素、產(chǎn)孢條件以及產(chǎn)孢特點等有所差異［12］。張茂星等［13］設(shè)置不同硝/銨配比的

氮源、不同pH來培養(yǎng)香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌，并探明其最適生長條件?？灯贾サ龋?4］研究了不同培養(yǎng)基對其菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響，明確尖孢鐮刀菌黃瓜?；偷淖钸m生長條件。該研究是以導(dǎo)致仙客來產(chǎn)生枯萎病的病原菌為研究對象，對其產(chǎn)孢培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行研究。

該研究首先進行了初始培養(yǎng)基成分的篩選，研究PDA、PSA、CMA、綠豆培養(yǎng)基、香蕉培養(yǎng)基、仙客來培養(yǎng)基、OA 7種不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，病原菌生長及產(chǎn)孢量，結(jié)果表明生長速率最快的是馬鈴薯培養(yǎng)基，其次是綠豆培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量最多的是綠豆培養(yǎng)基，達10.40×107個/mL，其次是馬鈴薯培養(yǎng)基，這與楊冬靜等［15］的研究結(jié)果相似，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌產(chǎn)孢量高，且大小均勻、形態(tài)整齊，綠豆培養(yǎng)基中孢子形態(tài)多樣，更適用于對病原菌孢子的觀察，而仙客來培養(yǎng)基可能由于在加熱滅菌過程中破壞了其中的生長因子，反而不適宜病原菌生長。因此選出馬鈴薯、綠豆、蔗糖作為初始培養(yǎng)基主要營養(yǎng)成分。

正交試驗法因其高效、經(jīng)濟的優(yōu)點，廣泛用于菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化［16-17］。該研究根據(jù)產(chǎn)孢培養(yǎng)基的初篩結(jié)果，選擇綠豆、蔗糖、馬鈴薯作為3因素，并設(shè)置3水平，進行正交試驗，對培養(yǎng)基的主成分進行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基組成，結(jié)果表明營養(yǎng)成分配比為綠豆5.0%、蔗糖0.5%、馬鈴薯20%，產(chǎn)孢量達到最高為13.22×107個/mL，此培養(yǎng)基培養(yǎng)的病原菌既可以獲得最大孢子量，用于后續(xù)的病害防治、發(fā)病機理研究等，還可以滿足對各種形態(tài)孢子的觀察，對于病原菌的進一步鑒定非常有意義。

pH不僅可以影響細胞膜和溶液中物質(zhì)的帶電性，還可以影響菌株產(chǎn)酶活性，進而影響菌株對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的吸收，通過單因素試驗對初始培養(yǎng)基的pH及培養(yǎng)溫度進行優(yōu)化，確定其生長的最佳環(huán)境條件，對指導(dǎo)生產(chǎn)中環(huán)境的控制具有重要意義。該研究結(jié)果表明仙客來枯萎病病原菌的適應(yīng)性很強，在pH為4～10都能生長，pH 6為病原菌的最適pH，這與秦涵淳等［18-19］的研究結(jié)果相似。溫度作為影響微生物生長代謝的重要因素，在菌株發(fā)酵條件優(yōu)化過程中至關(guān)重要［20］，菌種不同，可耐受的溫度不同，該研究通過單因素試驗結(jié)果表明培養(yǎng)溫度30 ℃為病原菌的最適產(chǎn)孢溫度，這與文增葉等［12］研究的三七根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性研究結(jié)果相似。

在仙客來盆花的實際生產(chǎn)中，基質(zhì)pH要求控制在5.5～7.0，溫度控制在15～30 ℃，夏季高溫的情況下溫度控制在25～30 ℃，這正好是病原菌最適生長的環(huán)境條件，很好地解釋了夏季高溫條件下仙客來枯萎病易發(fā)生的重要原因，該研究結(jié)果對于指導(dǎo)實際生產(chǎn)，如何從栽培管理的角度科學(xué)防治仙客來枯萎病的發(fā)生具有重要意義。但對于仙客來枯萎病的防治還需要深入研究，下一步將開展抑菌方面的研究。

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