重金屬汞脅迫下菲律賓蛤仔GPx和GST基因表達分析

鄭志龍 閆路路 閆喜武 秦艷杰

摘要 為研究重金屬汞脅迫下菲律賓蛤仔谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）基因的表達情況，用汞對指示生物菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）進行單一慢性暴露試驗，分別在0、12、24 h以及2、3、4、5、6、7和8 d時檢測菲律賓蛤仔內臟團和鰓中GPx和GST基因的表達情況。結果表明，菲律賓蛤仔內臟團中GPx和GST基因的表達量都呈現(xiàn)波動變化趨勢，分別在24和12 h時表達量最高（P<0.05），6 d時GPx基因表達量最低（P>0.05），3 d時GST基因表達量最低（P<0.05）；GPx基因在鰓中的表達量在8 d時最高（P<0.05）；鰓中GST基因的表達量在5 d時最高（P<0.05）。以上結果表明汞暴露在短期內能夠誘導GPx和GST基因進行不同程度的表達，但其隨著時間的延長呈明顯的抑制作用。該研究結果為揭示重金屬汞對菲律賓蛤仔的毒性機理提供了理論依據。

關鍵詞 重金屬汞；菲律賓蛤仔；谷胱甘肽過氧化物酶；谷胱甘肽-S-轉移酶

中圖分類號 S917.4? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）10-0113-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.10.024

Expression Analysis of GPx and GST Genes in Ruditapes philippinarum Under Heavy Metal Mercury Stress

ZHENG Zhi-long1，2， YAN Lu-lu1，2， YAN Xi-wu1，2 et al

（1.College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian， Liaoning 116023;2.Liaoning Shellfish Breeding Engineering Technology Center， Dalian，Liaoning 116023）

Abstract In order to study the gene expression of glutathione peroxidase （GPx） and glutathione-S-transferase （GST） in Ruditapes philippinarum under the stress of heavy metal mercury （Hg），? a single chronic exposure experiment on the indicator organism R. philippinarum was carried out. The expression of two genes in visceral mass and gill of? R. philippinarum was detected at 0，12 h，24 h and 2， 3， 4， 5， 6， 7 and 8 d. The results showed that the expression multiples of GPx and GST in the visceral mass showed a fluctuation trend， and the expression multiples reached the highest （P<0.05） at 24 and 12 h， respectively. The expression level was the lowest at 6 d（P>0.05）and 3 d （P<0.05）. The expression multiple of GPx in the gill was the highest at 8 d （P< 0.05）， and the first peak appeared at 5 d. The expression amount of GST? was the highest at 5 d （P<0.05）. It showed that mercury exposure could induce the expression of GPx and GST in different degrees in the short term，but it had obvious inhibitory effect with the extension of time. This study provided the theoretical basis for revealing the toxicity of heavy metal mercury to R. philippinarum.

Key words Heavy metal mercury;R. philippinarum;Glutathione peroxidase;Glutathione-S-transferase

基金項目 山東省重點研發(fā)計劃項目（2023LZGCQY001）；現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系專項（CARS-49）；國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD0901400）。

作者簡介 鄭志龍（1999—），男，福建福州人，碩士研究生，研究方向：水產動物遺傳育種與繁殖。

*通信作者，教授，博士，從事水產養(yǎng)殖學研究。

收稿日期 2023-04-21

隨著城市化發(fā)展的不斷加快，大量城市污水和固體廢棄物直接排入水中，致使重金屬污染嚴重破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡，已引起廣泛關注。重金屬污染物（Hg、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn等）流動性低、難以降解且難溶于水，但來源十分廣泛，殘留時間久并通過食物鏈被生物富集和傳遞，最終匯入海洋造成不可逆轉的傷害，嚴重危及人體健康［1］。

重金屬汞已成為全球關注的持續(xù)性污染物，被列為污染物優(yōu)先排查的控制目標［2］。重金屬汞進入海洋無法降解，只能通過顆粒沉降進入沉積物才能離開海洋，但沉積物中有機組分礦化及生物擾動會促使汞釋放出來重新進入水體［3］。在此過程中其對底棲生物又造成了危害，繼而造成二次污染，危害海洋生物。

金屬的毒性作用已經在許多水生生物中被證實［4］。雙殼貝類最具代表性，其金屬中毒的主要后果是氧化應激［5］。大量研究表明，金屬中毒促進了生物體內活性氧（ROS）的生成，進而導致細胞過氧化損傷、脂質過氧化等［6］。為了減少活性氧對生物的影響，生物體內啟動有效的抗氧化防御機制，主要包括谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）［7］。因此，對抗氧化反應和脂質過氧化水平的評價常常被應用于雙殼貝類在重金屬暴露環(huán)境的研究中［8］。谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）通過將內源性活性氧維持在相對較低水平來保護細胞免受氧自由基的損害，并減輕其應激反應相關的損害［9］。谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）是一種Ⅱ期解毒酶，參與有機化合物的結合和解毒，通過催化谷胱甘肽過氧化物酶的活性，發(fā)揮抗氧化應激的保護作用［10］，因此它被認為是監(jiān)測海洋海岸生態(tài)系統(tǒng)金屬污染的生物標記物［11］。

我國是海水養(yǎng)殖大國，貝類是四大海水養(yǎng)殖產品之一。其中，菲律賓蛤仔在水體中分布廣泛，對多種重金屬（Cd、Zn、Cu、Hg和Cr等）有較高的富集能力，因此菲律賓蛤仔不僅被用于重金屬污染監(jiān)測，而且在海洋毒理學研究中被廣泛應用［12］。針對重金屬汞的海洋生態(tài)毒理學研究，一般包括生長、呼吸、行為、繁殖、濾食和發(fā)育等方面［13］。為了保護海洋生物免受汞的毒害，要加強對重金屬汞的防治和控制，明確重金屬汞對海洋生物的毒性效應。筆者選取谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）這2個與谷胱甘肽代謝相關的關鍵基因，通過實時熒光定量PCR方法驗證和分析這2個基因

在汞脅迫下菲律賓蛤仔體內的表達情況，旨在為揭示重金屬汞對菲律賓蛤仔的毒性機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為菲律賓蛤仔，購于大連長興市場（進貨渠道為大連莊河周邊養(yǎng)殖場），殼長（3.0±0.5）cm，個體健壯，生活狀態(tài)良好。

1.2 試驗藥品

動物組織總RNA提取試劑盒（柱型），購自天根生化科技（北京）有限公司；

SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit，購自寶生物工程（大連）有限公司；

PrimeScriptTM RT reagent Kit，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 主要儀器與設備

核酸蛋白檢測儀，為德國Implen NanoPhotometer公司產品；

熒光定量檢測系統(tǒng)Mx3005p，為美國Agilent Stratagene公司產品；

梯度PCR儀，為德國Eppendorf公司產品；

電泳儀，為北京六一儀器廠產品；

生物電泳圖像分析系統(tǒng)，為上海天能科技有限公司產品；

高速冷凍離心機，為德國Hettich公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 汞脅迫下菲律賓蛤仔表達譜研究。

1.4.1.1

測序與序列比對。將經0.094 8 mg/L Hg處理的菲律賓蛤仔分別在0、12 h和6 d時取其鰓和內臟團，并迅速放入液氮中保存。采用Invitrogen公司的Trizol試劑提取RNA；提取RNA后，按照Invitrogen公司的Dynabeads mRNA純化試劑盒進行mRNA的純化。將mRNA在fragmentation buffer提供的高鹽理性環(huán)境下，高溫打斷；以打斷的mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成cDNA第一鏈，加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成cDNA第二鏈；經過QiaQuick PCR純化試劑盒純化并加入EB緩沖液洗脫，末端修復、加堿基A后加上測序接頭，再經過瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段大小的核酸序列，進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作，構建的文庫用Illumina HiSeqTM 2000測序儀進行測序。測序儀產生的原始圖像數據經base calling轉化為序列數據，序列數據包含reads的序列及reads的測序質量，原始reads數據中帶有含測序接頭的序列和少量低質量序列；最后，利用SOAPaligner/Soap2軟件，將每個樣品的clean reads分別與菲律賓蛤仔轉錄組進行比對，最后將比對得到的基因用于后續(xù)生物信息學分析。

1.4.1.2 生物信息學分析。對clean reads進行測序評估，并根據clean reads比對到參考序列（菲律賓蛤仔轉錄組）上的數量及分布，采用RPKM法（reads per kilobase per million）計算該基因的表達量，計算公式如下：

RPKM（A）=106CNL/103（1）

式中：RPKM（A）為A基因的表達量；C為唯一比對到A基因的reads數；N為唯一比對到參考基因的reads數；L為A基因的堿基數。

通過比較不同樣本的數據，利用概率公式篩選出差異表達基因。差異表達基因同時需要滿足差異檢驗FDR≤0.001且基因A與基因B的相對表達量絕對值|log2Ratio（A/B）|≥1。將滿足上述條件的差異表達基因進行以下分析：

（1）基因表達模式聚類分析：表達模式相似的基因通常具有相似的功能，因此利用差異表達基因和試驗條件同時進行等級聚類分析。

（2）Pathway顯著性富集分析：以KEGG pathway為單位，找出差異表達基因中顯著性富集的pathway。

為進一步了解差異表達基因的生物學功能，以KEGG pathway為單位，找出與整個轉錄組相比差異表達基因顯著富集的KEGG pathway。按照以下計算公式，計算P值：

P=1-m-1i=0MiN-Mn-iNn

（2）

式中，N為轉錄組中具有pathway注釋的基因數目，n為具有pathway注釋的差異表達基因數，

M為轉錄組中注釋為某特定pathway條目的基因數目，

m為注釋為某特定pathway條目的差異表達基因數。

設定Q值≤0.05的KEGG pathway為顯著性富集，由此確定重金屬脅迫下菲律賓蛤仔差異表達基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

1.4.2 GPx和GST基因實時熒光定量PCR分析。

1.4.2.1 前期處理和取樣。

菲律賓蛤仔暫養(yǎng)7 d后，用96 h半致死濃度（0.094 8 mg/L）的Hg處理菲律賓蛤仔，分別在0、12、24 h以及2、3、4、5、6、7、8 d取其鰓和內臟團，迅速冷凍在液氮中，保存于-80 ℃冰箱中。

1.4.2.2 總RNA的提取。

按照天根生化科技（北京）有限公司提供的動物組織總RNA提取試劑盒說明書提取樣品總RNA。

1.4.2.3

RNA純度及濃度檢測。

總RNA經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，電泳液為0.5×TBE，電泳時間為30 min，電泳后在凝膠成像儀下觀察RNA條帶。將沒有彌散且條帶清晰的總RNA在核酸蛋白檢測儀上檢測RNA純度和濃度，選擇純度1.9～2.1、濃度≥61.5 ng/μL的RNA樣品用于后續(xù)試驗，將不合格樣品重新提取總RNA，直到滿足條件為止。

1.4.2.4 cDNA第一鏈的合成。

將檢測合格的RNA樣品，分別取800 ng總RNA進行反轉錄，按照反轉錄試劑盒說明書進行，整個試驗操作在冰上進行，反轉錄體系如下：5×PrimeScriptTM buffer 4 μL、

PrimeScriptTM RT enzyme Mix I 1 μL、

Oligo dT Primer（50 μmol/L）1 μL、

Random 6 mers（100 μmol/L）1 μL、

Total RNA 900 ng，

用RNase Free H2O補足20 μL。反應條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；

4 ℃下分裝并保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4.2.5 qRT-PCR引物設計。

根據引物設計原則，設計內參基因和目的基因引物。內參基因Tubulin，目的基因GPx和GST序列均來自菲律賓蛤仔轉錄組序列。引物設計完成后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成，經過引物篩選，設計引物序列如下：

Tubulin-F為AAGCGTCTATGATTCTGG，Tubulin-R為GGTAAGGGCAAAGGTAT；

GPx-F為GAATGTAGCATCCCTCTG，

GPx-R為TCTCCTGGTGTCCAAACT；

GST-F為TGCTTCAGGCTCTTGCT；

GST-R為TATCTTGACGAAACTACCC。

1.4.2.6 GPx和GST基因實時熒光定量PCR。

將反轉錄得到的所有cDNA各取1 μL，混合后作為cDNA的混合模板，按照2×50、2×51、2×52、2×53、2×54倍數進行稀釋，用于標準曲線的制備。確定標準曲線后，對內參基因、GST和GPx基因進行實時熒光定量PCR，反應體系如下：

2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10.0 μL，

PCR Forward Primer（0.4 μmol/L）0.8 μL，

PCR Reverse Primer（0.4 μmol/L）0.8 μL，

ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，

cDNA（≤100 ng）2.0 μL，用ddH2O補足20 μL。qRT-PCR反應程序：95 ℃30 s；95 ℃10 s，56 ℃25 s，72 ℃25 s，40個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 序列比對結果

將6個樣品分別與參考基因進行序列比對，得到所測樣品總reads數、比對到參考序列的reads數和唯一比對到參考序列的reads數，結果見表1。

2.2 差異基因表達篩選

差異表達基因篩選原則：

①差異檢驗中陽性發(fā)現(xiàn)錯誤率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.001；

②差異倍數在2倍及以上，即|log2Ratio| ≥1。

試驗以單變量為比對原則，將樣品進行兩兩比對，并得到差異表達基因統(tǒng)計圖（圖1）。從圖1可以看出，S0 VS S6d有2 251個上調基因和5 051個下調基因。

2.3 KEGG Pathway顯著性富集分析 通過KEGG通路顯著性富集分析，得到KEGG中顯著性富集的通路，同時確定差異表達基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑，具體結果見圖2。由圖2可知，鰓在脅迫12 h時顯著基因主

要富集

在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，脂肪酸生物合成，氮代謝，?；撬岷蛠喤；撬岽x，精氨酸和脯氨酸代謝等代謝通路（P<0.05）；鰓在脅迫6 d時顯著基因主要富集于谷胱甘肽代謝、苯丙氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等代謝通路（P<0.05）。內臟團在脅迫12 h時顯著基因主要富集于氨酰-tRNA生物合成、氰基氨基酸代謝、牛磺酸和亞?；撬岽x以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等代謝通路（P<0.05）；內臟團在脅迫6 d時顯著基因主要富集于氨酰-tRNA生物合成、內質網中的蛋白質加工以及氨基糖和核苷酸糖代謝等代謝通路（P<0.05）。

2.4 汞脅迫下蛤仔GPx和GST基因的表達

以Tubulin作為內參基因，以篩選好的引物為熒光定量引物，采用相對定量的方法檢測目的基因（GPx和GST基因）在菲律賓蛤仔鰓和內臟團中的表達情況。從圖3～6可以看出，在Hg脅迫菲律賓蛤仔試驗中，內臟團中GPx基因在24 h時表達量最高（P<0.05），在6 d時表達量最低（P>0.05）；鰓中GPx基因在8 d 時表達量最高（P<0.05），在24 h時表達量最低（P<0.05）；內臟團中GST基因在12 h時表達量最高（P<0.05），在3 d時表達量最低（P<0.05）；鰓中GST基因在5 d時表達量最高（P<0.05）。

2.5 qRT-PCR與表達譜分析結果的比較

以各組GPx和GST基因與對照組的相對表達量為研究指標，分析發(fā)現(xiàn)目的基因上下調一致率達到87.5%，僅有1組數據不一致（圖7）。

3 討論

3.1 貝類GPx和GST基因的防御作用

該研究在篩選大量差異表達基因的基礎上，用Hg對菲律賓蛤仔進行脅迫，通過熒光定量PCR方法進一步研究基因表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽代謝通路中的大多數酶基因在汞脅迫后的菲律賓蛤仔體內表現(xiàn)出顯著的表達變化。其中，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）是谷胱甘肽代謝通路中的關鍵酶，在解毒系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)中均起到非常重要的作

用［14-15］，

因此研究這2個酶基因在重金屬脅迫菲律賓蛤仔中的表達情況意義重大。目前已有學者研究了文蛤（Meretrix meretrix）［16］、蝦夷扇貝（Mizuhopectenyessoensis）［17］、太平洋長牡蠣（Crassostrea gigas）［18］、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）［19］、三角帆蚌（Hyriopsis cumingi）［20］、厚殼貽貝（Mytilus coruscus）［21］等貝類的GPx和GST基因表達情況。Wang等［22］研究Nrf2-Keap1信號通路對多環(huán)芳烴暴露下菲律賓蛤仔抗氧化防御系統(tǒng)及氧化損傷的影響，檢測了注射dsRNA-Nrf2后的菲律賓蛤仔中CAT、GPx和GST mRNA的表達情況，暴露前12 h CAT和GPx的mRNA表達量顯著高于暴露第0天（P<0.05）;RpNrf2-dsRNA組4、5 d時檢測到GPx和GST-pi mRNA的表達量顯著升高（P<0.05）；RpNrf2-dsRNA組GST-pi活性在4、5 d時顯著低于GFP-dsRNA和PBS組，抑制作用在3 d時達到峰值。Wang等［23］在櫛孔扇貝Nrf2-Keap1信號通路在BaP誘導的抗氧化防御反應中的分子機制研究中發(fā)現(xiàn)，注射Bap后第1天Cfkeap1-dsRNA組櫛孔扇貝消化腺和鰓中的GPx mRNA表達量與對照組相比沒有明顯差異（P>0.05），而2 d時GPx的mRNA表達量高于對照組，與該試驗結果相符。Vidal-Lin等［24］研究發(fā)現(xiàn)紫貽貝暴露于最高濃度的PCB 7 d后GST活性受到顯著抑制，不同濃度的PCB對GPx活性都有顯著誘導作用。以上報道結果和該試驗結果均表明在毒物刺激下雙殼貝類中GPx和GST基因表達量均發(fā)生不同程度的變化，在免疫防御中起重要作用。

3.2 重金屬脅迫下GPx和GST基因表達分析

鰓是雙殼類軟體動物的濾食器官和呼吸器官［25］，在Hg脅迫下抗氧化系統(tǒng)和解毒系統(tǒng)中關鍵酶基因GPx和GST基因分別表現(xiàn)出各自的表達譜。該研究結果表明Hg脅迫下菲律賓蛤仔鰓中GPx基因在5 d時達到第1個峰值（4.5倍左右，P<0.05），在8 d 時達到最高。蔣國萍［26］研究了Hg脅迫下斧文蛤體內GPx、SOD以及CAT基因的表達情況，結果顯示GPx、SOD和CAT基因的表達量都呈先上升后下降的趨勢，SOD、CAT以及GPx基因的表達量分別在3、1和2 d達到最大。以上結果表明，Hg脅迫下斧文蛤體內抗氧化酶在清除和轉運活性氧過程中起到至關重要的作用。暴露于Hg脅迫環(huán)境下的菲律賓蛤仔和斧文蛤GPx基因表達量均發(fā)生變化，推測在Hg脅迫下雙殼貝類鰓組織中GPx基因的表達對雙殼貝類起到一定的機體調節(jié)和保護作用。該研究結果表明Hg脅迫下菲律賓蛤仔鰓中GST基因的表達量在5 d達到最大（82倍左右，P<0.05）。Jiang等［27］研究了菲律賓蛤仔在汞（Hg2+，2和10 μg/L）、苯并［a］芘單一和聯(lián)合脅迫下GSTs基因表達量的變化，發(fā)現(xiàn)Hg2+和BaP處理顯著誘導了菲律賓蛤仔肝胰腺中的GSTs。

雙殼貝類的內臟團是消化系統(tǒng)的重要組成部分，能夠富集重金屬，從而對生物體造成危害［28］。該研究結果表明在Hg脅迫下菲律賓蛤仔內臟團中GPx和GST基因分別在24和12 h時表達量最高，分別為4倍左右（P<0.05）和2.7倍左右（P<0.05）。隨著Hg暴露時間的延長，GPx和GST基因分別在6和3 d時表達量最低，分別為0.5左右（P>0.05）和0.2左右（P<0.05）。陳琳琳等［29］研究了汞、硒暴露對紫貽貝（Mytilus edulis）抗氧化酶系統(tǒng)的影響，結果表明汞暴露條件下GPx基因表達量隨著暴露時間的延長呈先升高后降低的變化，2 d時表達量最大。該研究進一步推測出Hg對菲律賓蛤仔內臟團中GST基因的抑制程度要高于GPx基因，汞入侵引起了菲律賓蛤仔的應激反應，產生大量的GPx和GST來清除機體產生的活性氧自由基。

3.3 qRT-PCR與表達譜分析結果的比較 以各組GPx和GST基因與對照組的相對表達量為研究指標，分析發(fā)現(xiàn)目的基因上下調一致率達到87.5%，還有1組試驗數據不一致。這可能與取樣批次、養(yǎng)殖環(huán)境和個體差異有關。綜合來看，熒光定量PCR試驗結果與表達譜分析結果相似度高，可見表達譜分析結果準確性高，可直接用于基因表達的分析中，與鱸魚［30］、斑馬魚［31］等表達譜分析結果基本一致，即表達譜分析試驗結果準確，可為后續(xù)基因表達分析提供理論依據和參考。

4 結論

綜上所述，汞暴露短期內能夠誘導菲律賓蛤仔體內抗氧化防御系統(tǒng)來清除氧自由基。隨著暴露時間的延長，表現(xiàn)出明顯的抑制作用。因此，重金屬汞慢性脅迫下菲律賓蛤仔體內GPx和GST基因表達量分析揭示了重金屬汞在菲律賓蛤仔體內的作用規(guī)律，為深入研究重金屬汞在菲律賓蛤仔體內重金屬毒性作用提供理論基礎。

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