艾灸對D-半乳糖致亞急性衰老模型大鼠皮膚組織膠原蛋白含量及雌二醇水平的影響

王彩霞

【摘 要】 目的：觀察艾灸對D-半乳糖致亞急性衰老模型大鼠皮膚組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量及雌二醇水平的影響，探討艾灸延緩皮膚衰老的作用機(jī)制。方法：大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖制備亞急性衰老模型，連續(xù)42 d。造模第22天，實(shí)驗(yàn)組予以艾灸“足三里”“關(guān)元”穴。42 d后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠膠原蛋白含量及皮膚雌二醇（Estradiol）水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠皮膚組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量和雌二醇水平顯著下降（P<0.01）。與模型組比較，艾灸可增加大鼠皮膚組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量和雌二醇水平（P<0.01）。結(jié)論：艾灸能顯著緩解D-半乳糖所致的亞急性皮膚衰老。

【關(guān)鍵詞】 艾灸療法；皮膚衰老；膠原蛋白；雌二醇；大鼠

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2024）09-0024-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.09.zgmzmjyyzz202409007

Effects of Moxibustion on Collagen Content and Estradiol Level in Skin

Tissue of Subacute Aging Model Rats Induced by D-galactose

WANG Caixia

Institute of Traditional Chinese medicine， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004，China

Abstract：Objective To observe the effects of moxibustion on the contents of type Ⅰ， type Ⅲ collagen and the level of estradiol in skin tissue of subacute aging rats induced by D-galactose，and to explore its mechanism of delaying skin aging．Methods Subacute aging model was established by subcutaneous injection of D-galactose into the neck and back of rats for 42 days. On the 22th modeling day， the rats of the experimental group accepted moxibustion at Zusanli and Guanyuan points.Forty-two days later， The contents of typeⅠ， type Ⅲ collagen and estradiol in skin of rats were determined by ELISA.Results Compared with the normal group， the content of type Ⅰ， type Ⅲ collagen and the level of estradiol in skin tissue of model group were significantly decreased （P<0.01）．Compared with the model group，moxibustion could significantly increase the content of type Ⅰ， type Ⅲ collagen and the level of estradiol level in skin tissue of rats（P<0.01）．Conclusion Moxibustion can significantly alleviate subacute skin aging induced by D-galactose.

Keywords：Moxibustion Therapy; Skin Aging; Collagen; Estradiol; Rat

目前，人口老齡化已成為社會面臨的難題，延緩衰老亦成為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的熱點(diǎn)課題之一。皮膚是最早反映機(jī)體衰老的組織，隨著人們對美的需求日益增長，永葆青春成了人們追求的目標(biāo)。衰老是一種不可抗拒的自然規(guī)律，而皮膚作為生物衰老過程中變化最為明顯的器官之一，主要表現(xiàn)為皮膚松弛、粗糙、彈性下降、皺紋增多、色素沉著等［1-2］。目前認(rèn)為，皮膚衰老與氧自由基增多、端粒酶活性降低、膠原降解增加、免疫力衰退、炎性浸潤等有關(guān)［3-4］。皮膚衰老不僅有損于容貌，亦影響社交，而且與許多皮膚病如日光性角化病、脂溢性皮炎、基底細(xì)胞癌的發(fā)生也有著病因?qū)W的關(guān)系［5-6］。在延緩皮膚衰老方面，西醫(yī)學(xué)運(yùn)用皮膚提緊術(shù)、自體脂肪填充術(shù)、肉毒素注射等方法治療，但有一定的風(fēng)險(xiǎn)及副作用。再加上化學(xué)合成化妝品的涌入和濫用以及化學(xué)合成抗氧化劑的毒性和致癌作用對人體造成的傷害，人們的自我保護(hù)意識不斷增強(qiáng)，向往“綠色”的呼聲越來越高，對“老而不衰”的渴望也愈加強(qiáng)烈。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人體衰老與臟腑氣血盛衰有著密切關(guān)系。陽氣衰弱，陰精不足，氣血虧虛，臟腑功能減退，經(jīng)絡(luò)運(yùn)行不暢，均能引起陰陽失調(diào)，從而導(dǎo)致衰老進(jìn)程加快。因此，將傳統(tǒng)中醫(yī)保健抗衰手段與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前延緩衰老的重要課題。

艾灸是中醫(yī)學(xué)的傳統(tǒng)療法，其保健抗衰老作用歷史悠久，早在兩千多年前的醫(yī)學(xué)著作《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，就對抗衰老理論及艾灸臨床治療有著十分詳細(xì)的記載。艾灸具有溫通經(jīng)絡(luò)、補(bǔ)益氣血、防病保健、延年益壽等作用，歷來被認(rèn)為是養(yǎng)生保健抗衰老的重要方法 ［7］。南宋醫(yī)家竇材在《扁鵲心書》中曰：“人于無病時(shí)常灸關(guān)元、氣海、命門、中脘，雖未得長生，亦可保百余年壽矣?！薄锻馀_秘要》記載：“三里養(yǎng)先后天之氣，灸三里可使元?dú)獠凰?，故稱長壽之灸?！庇纱丝梢钥闯?，艾灸在調(diào)節(jié)身體機(jī)能、抗衰老、延年益壽中發(fā)揮了重要作用。

現(xiàn)代研究［8］表明，艾灸可通過清除自由基、提高免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、調(diào)整脂質(zhì)代謝等以延緩衰老?！白闳铩焙汀瓣P(guān)元”穴是防病抗衰的要穴，具有健運(yùn)脾胃、強(qiáng)壯機(jī)體之功，也是治療諸虛百損的常用穴位。本研究通過觀察艾灸“足三里”“關(guān)元”穴對D-半乳糖致衰老模型大鼠膠原蛋白、雌二醇含量及皮膚組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的影響，從而探討艾灸抗衰老作用及機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 動物與分組 SPF級SD雌性健康大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽性對照組（維生素E組）和艾灸組，每組各10只。各組動物在同等條件下常規(guī)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在（24±2）℃，濕度40%～60%，保持光照充足、通風(fēng)良好。

1.2 藥品與試劑 艾條（北京國醫(yī)研醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司），維生素E（北京綠健園科技有限公司）；D-半乳糖生化試劑（源葉生物）；Ⅰ型膠原（COL1）、Ⅲ型膠原（COL3）測定試劑盒（Elabscience公司）；雌二醇（Estradiol）測定試劑盒（Elabscience公司）。

1.3 儀器 ?C2500-R-230V微型高速離心機(jī)（美國Labnet公司）；ICV-450電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本ASONE）；FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備與給藥 實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開始給藥造模，模型組、陽性對照組和艾灸組大鼠每日頸背部皮下注射10%D-半乳糖（1000 mg/kg）［9］制備亞急性衰老模型，正常組皮下注射同等劑量的0.9%生理鹽水，連續(xù)注射給藥42 d。

2.2 取穴與艾灸方法 從注射的第22天開始實(shí)施艾灸治療。時(shí)間選擇在每日上午9時(shí)至12時(shí)，大鼠穴位定位參照余曙光主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜［10］。足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下方約5 mm處；關(guān)元穴位于臍下約25 mm處。艾灸前將穴區(qū)直徑約1.0 cm的毛剃干凈，用大鼠固定器將大鼠固定，暴露穴區(qū)局部皮膚，對足三里穴和關(guān)元穴實(shí)施溫和灸，每穴灸5 min，灸后局部皮膚潮紅，無發(fā)泡。除艾灸組外，其余各組每天相同時(shí)間做相同固定5 min，但不灸，亦不讓其聞到艾煙的味道。陽性對照組頸背部涂抹維生素E軟膠囊。每天1次，連續(xù)21 d。

2.3 取材及指標(biāo)測定 取材前一天用剃毛器脫去大鼠背部皮膚的毛，約3 cm×3 cm。取材當(dāng)天大鼠處死后，取脫毛后背部皮膚組織約0.5 g，用預(yù)冷（4 ℃）生理鹽水漂洗，除去多余雜質(zhì)，濾紙拭干，稱重（取0.5 g），放入該組織塊9倍重量的預(yù)冷生理鹽水中，眼科小剪剪碎組織塊，制成10％組織勻漿，漿液以3500 r/min的速度離心20 min，取適量上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測皮膚組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量、雌二醇水平。實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，各組單因素之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

如表1所示，與正常組比較，模型組大鼠皮膚中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和雌二醇含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，艾灸組皮膚中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和雌二醇含量顯著升高（P＜0.01）。

4 討論

實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖致亞急性衰老模型，該模型是在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)皮下注射D-半乳糖，通過增加體內(nèi)半乳糖濃度從而使細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，自由基過量堆積而使機(jī)體呈現(xiàn)衰老狀態(tài)，該模型被認(rèn)為是當(dāng)前抗衰老研究的較好模型，被廣泛應(yīng)用［11-12］。實(shí)驗(yàn)中模型大鼠出現(xiàn)衰老征象，皮膚膠原蛋白含量及雌二醇水平降低證明了此造模方法的可行性。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究［13］證實(shí)，皮膚衰老過程中其中一個(gè)重要變化是細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解。膠原纖維約占真皮纖維的90%，是真皮的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，它們聚集成粗大的膠原束，相互交聯(lián)，縱橫交錯，從而形成皮膚固有的韌性。但隨著年齡的增長，皮膚膠原纖維逐漸變細(xì)，合成減少，真皮層變薄，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚韌性下降。膠原蛋白是膠原纖維的主要成分，存在于所有哺乳動物體內(nèi)，是一類纖維狀、大分子蛋白質(zhì)，由結(jié)締組織細(xì)胞與其他類型的細(xì)胞（如肝、脾、肺臟及腦組織細(xì)胞）分泌，普遍分布于細(xì)胞外基質(zhì)中。膠原蛋白是真皮中含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，約占總蛋白的1/3，使皮膚保持一定的強(qiáng)度和彈性［14-15］。人體皮膚真皮中的膠原主要由Ⅰ型膠原（80%～90%）和Ⅲ型膠原（8%～12%）構(gòu)成［16］。皮膚的張力和承受耐力主要由Ⅰ型膠原維持，皮膚彈性主要與Ⅲ型膠原有關(guān)，而皮膚質(zhì)地主要由Ⅰ型與Ⅲ型膠原的比例所決定［2］。當(dāng)皮膚衰老時(shí)，兩者比例逐漸倒置，皮膚中含有的膠原纖維會逐漸降解，交聯(lián)異常，膠原應(yīng)力傳導(dǎo)下降，抗剪切力減弱，從而損害了真皮結(jié)構(gòu)的完整性，致使皮膚松弛，彈性降低、松弛起皺［17］。因此，皮膚中膠原蛋白含量的測定也是反映皮膚衰老的一個(gè)重要指標(biāo)［18］。

雌激素參與皮膚許多生理、病理過程，人類皮膚老化與機(jī)體內(nèi)雌激素水平下降有關(guān)［19］。研究［20］表明，雌激素能促進(jìn)表皮細(xì)胞增生，從而增加表皮厚度，改善皮膚循環(huán)分布，影響皮脂腺分泌，可通過作用于成纖維細(xì)胞受體而直接調(diào)控該細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其活性，增加膠原蛋白含量。女性服用雌二醇（2 mg/d）7個(gè)月后，用高頻超聲波檢測出皮膚厚度、彈性及保濕性均有顯著改善；雌激素局部治療對絕經(jīng)后婦女面部皮膚的影響，通過比較治療16周前后皮膚樣本，發(fā)現(xiàn)無論是表皮還是真皮厚度都有所增加，同時(shí)膠原含量平均增加28%。雌二醇是機(jī)體內(nèi)含量最多，也是活性最強(qiáng)的一種雌激素，其含量的高低也可以間接反映皮膚衰老程度。

“關(guān)元”穴位于任脈，是任脈與足三陰經(jīng)的交會穴，是三焦元?dú)馑l(fā)處，聯(lián)系命門真陽，為陰中之陽穴，具有培本固腎、調(diào)理沖任、補(bǔ)益精血之功，艾灸關(guān)元穴可補(bǔ)攝下焦元?dú)?，扶助機(jī)體元陰元陽，屬先天之本，是古今強(qiáng)壯保健的要穴，當(dāng)代學(xué)者亦從實(shí)驗(yàn)研究［21］中證實(shí)了艾灸關(guān)元的抗衰老作用?！白闳铩睘樽汴柮魑附?jīng)的合穴，胃之下合穴，土經(jīng)中的土穴，為回陽九針穴之一，具有健運(yùn)脾胃、益氣養(yǎng)血、培土化元之功，屬后天之本，為健脾補(bǔ)虛培元之要穴。已有實(shí)驗(yàn)研究［22-24］證實(shí)，艾灸足三里可增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）等酶類抗氧化劑的活性，降低丙二醛（MDA）等代謝產(chǎn)物的含量，具有良好的抗衰老作用。故本實(shí)驗(yàn)選用艾灸關(guān)元和雙側(cè)足三里穴，既能充養(yǎng)先天，又能培補(bǔ)后天，共奏補(bǔ)腎健脾、益氣活血、培元固本、延年益壽之功，從而達(dá)到固護(hù)正氣、防病抗衰的目的。

研究結(jié)果顯示，模型組皮膚組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量及雌二醇水平低于正常組（P<0.01），提示D-半乳糖造模成功。而艾灸“足三里”及“關(guān)元”穴能夠提高皮膚組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量及雌二醇水平（P<0.01），且改善效果優(yōu)于維生素E對照組，表明艾灸可能通過抑制膠原蛋白降解，升高雌激素水平，增加膠原蛋白含量，從而減緩皮膚衰老。這與艾灸溫通經(jīng)絡(luò)，補(bǔ)益氣血，充養(yǎng)先天，培補(bǔ)后天，以延緩衰老的機(jī)理也是不謀而合的。本研究提示艾灸對皮膚衰老大鼠具有一定的干預(yù)作用，但是尚存不足之處： 本實(shí)驗(yàn)只是做了大鼠皮膚組織的檢測，卻沒有做病理觀察，也沒有對基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測，因此對艾灸的抗衰老作用機(jī)制尚未完全明了。后期需進(jìn)一步深入研究相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而明確艾灸延緩皮膚衰老的具體作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)為臨床抗衰老提供了新的思路與方法。

參考文獻(xiàn)

［1］孫程，王冬東，張輝靠，等.茶樹提取物經(jīng)皮給藥對衰老小鼠皮膚的影響［J］.中成藥，2017，39（8）：1690-1694.

［2］朱華偉，葛亞中，汪曉凌，等.復(fù)方美姿力口服液對D-半乳糖聯(lián)合紫外線照射致皮膚衰老裸鼠模型的影響［J］.中藥材，2019，42（3）：666-671.

［3］王昱，何九軍，張宗舟.白肉靈芝水提物對衰老大鼠皮膚的作用研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2019，31：2131-2136.

［4］徐曉珍，譚機(jī)永，覃武，等.海帶多糖延緩自然衰老小鼠皮膚衰老的作用研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26（10）：2328-2330.

［5］謝曉輝，朱瑤，竇智燕，等.一種復(fù)方口服美容液的抗衰老作用及毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2017，26（5）：35-38.

［6］張宇，張小卿，吳景東，等.桃紅四物湯對光老化小鼠皮膚組織中MMP-12、Smad-2mRNA、Smad-3、TIMP-1mRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（5）：1201-1203.

［7］李霞，唐中生.艾灸益氣活血法對D-半乳糖致衰老大鼠免疫功能的影響［J］.錦州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，39（3）：4-6.

［8］靖媛，張苗，游世晶.艾灸關(guān)元穴對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠皮膚氧化應(yīng)激及MMP-1、TIMP-1mRNA表達(dá)的影響［J］.福建中醫(yī)藥，2018，49（5）：32-35.

［9］劉思彤，尹日鳳，韋玥吟，等.刺梨預(yù)防D-半乳糖誘發(fā)小鼠皮膚衰老的作用研究［J］.食品研究與開發(fā)，2020，41（9）：2-4.

［10］余曙光，徐斌.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：270.

［11］詹光杰，楊年安.富硒板黨對D-半乳糖所致衰老小鼠模型的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2015，35（15）：4171-4173.

［12］苗明三，李孟艷，項(xiàng)麗玲，等.中藥配方精油抗小鼠皮膚衰老作用的研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2018，29（10）：2365-2367.

［13］陳迪，章漳，蔣耀權(quán)，等.冰川水和白雪茶提取物延緩人真皮成纖維細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2018（30）：469-474.

［14］張苗，紀(jì)峰，陳友義.逆灸足三里抗自然衰老大鼠皮膚老化的研究［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2020，26（7）：912-916.

［15］張麗宏，熊輝，胡中花，等.白樺脂醇對人皮膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白及相關(guān)蛋白酶基因的調(diào)控機(jī)制研究［J］.國際中醫(yī)中藥雜志，2016，38（5）：420-423.

［16］薛歡，王佩茹，徐雨婷，等.膳食補(bǔ)充n-3多不飽和脂肪酸保護(hù)大鼠衰老皮膚膠原的作用及機(jī)制研究［J］.食品工業(yè)科技，2020，41（22）：316-321，334.

［17］張英杰，劉巖，路芳，等.益胃湯延緩初老雌性SD大鼠皮膚衰老的研究［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào)，2019，34（7）：1483-1487.

［18］趙文紅，張雯，王金花，等.直鏈烷基苯磺酸鈉對小鼠皮膚組織老化的促進(jìn)作用［J］.中國老年學(xué)雜志，2017，37（4）：825-827.

［19］李凌霞，趙晶，季順欣，等.歸素膏對衰老小鼠皮膚羥脯氨酸含量及病理學(xué)變化的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2014，21（5）：506-507.

［20］左俊，李勤，吳燕虹.雌激素調(diào)控皮膚衰老作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國中醫(yī)藥科技，2012，24（2）：122-124.

［21］金琪，韓麗，趙百孝，等.保健灸對Wister大鼠衰老進(jìn)程肝臟組織中SIRT1、FOXO3a、PPARα表達(dá)的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2021，48（5）：176-180.

［22］趙彩嬌，李嫻，覃永貞，等.艾灸足三里對衰老模型豚鼠血清SOD及肝腎組織基因表達(dá)的影響［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2016，27（10）：2543-2545.

［23］趙舒羽，劉文博，吳煥淦，等.溫和灸足三里穴對自然衰老大鼠的腎臟保護(hù)作用及FN、TGF-β1表達(dá)的影響［J］.世界中醫(yī)藥，2021（9）：11-12.

［24］鐘莉，艾炳蔚，夏毅.針刺足三里、關(guān)元穴抗自由基延緩衰老的臨床研究［J］.江蘇中醫(yī)藥，2015，47（6）：56-58.

（收稿日期：2023-08-01 編輯：劉 斌）