髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中粒細(xì)胞胞外陷阱的作用

張吉美，于芳洲，耿榆杰，李作偉，2*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東濟(jì)南 250014）

中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱（neutrophil extracellular traps,NETs）是由脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）、組蛋白和中性粒細(xì)胞顆粒蛋白在胞外構(gòu)成的網(wǎng)狀復(fù)合物，由Brinkmann 等［1］于2004 年首次報道。NETs 一方面具有強(qiáng)大的抗菌作用，另一方面產(chǎn)生過多或清除不徹底，導(dǎo)致炎性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展［2］，其病理后果包括血栓形成和纖溶障礙［3］。NETs 參與動脈血栓形成，腦梗死患者的血栓中NETs 含量明顯升高［4］，髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中是少見且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，髖關(guān)節(jié)置換患者術(shù)后出現(xiàn)具有高效促炎作用的NETs［5］，NETs 在髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中發(fā)揮著重要作用。本文就NETs 生物學(xué)特性進(jìn)行研究，通過對以往國內(nèi)外相關(guān)研究的回顧，將對NETs 在髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中診療中的作用進(jìn)行分析和討論，為今后此病的預(yù)防、治療提供新的思路。

1 NETs 的概述

NETs 的產(chǎn)生過程稱為NETosis［6］，是先天免疫系統(tǒng)的一種細(xì)胞現(xiàn)象，DNA 是NETs 的骨架結(jié)構(gòu)；組蛋白是NETs 的重要組成部分，通過細(xì)胞Toll 樣受體4（toll-like receptors 4, TLR4）信號介導(dǎo)的方式造成細(xì)胞及組織損傷；中性粒細(xì)胞顆粒蛋白，如髓過氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）、肽基精氨酸脫氨酶4（peptidyl arginine deiminase 4, PAD4）、蛋白酶3（proteinase3,PR3）等，與DNA、組蛋白組成帶有強(qiáng)大負(fù)電荷的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)菌、病毒、真菌、活化的血小板等均能誘導(dǎo)NETs 的產(chǎn)生，NETs 形成的主要機(jī)制分為中性粒細(xì)胞裂解模式和非裂解模式。

1.1 NETs 形成的中性粒細(xì)胞裂解模式

在裂解模式NETs 形成過程中，中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活化，通過釋放活性氧（reactive oxygen species,ROS）分解中性粒細(xì)胞內(nèi)的顆粒膜和核膜，隨后MPO、NE 自由入核結(jié)合并降解組蛋白［7］；ROS 激活PAD4 將組蛋白精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，破壞DNA 和組蛋白間的靜電荷關(guān)聯(lián)，使染色質(zhì)解聚，染色質(zhì)和顆粒蛋白被釋放到細(xì)胞外，形成NETs。某些誘導(dǎo)因素如尼古丁可導(dǎo)致線粒體ROS 釋放并激活PAD4，催化組蛋白H3（citrullinated histones 3, H3Cit）使其瓜氨酸化，解聚染色質(zhì)，從而形成NETs［8］。

1.2 NETs 形成的中性粒細(xì)胞非裂解模式

在非裂解模式NETs 形成過程中，病原體或體內(nèi)病理性產(chǎn)物刺激中性粒細(xì)胞，血小板與中性粒細(xì)胞、補(bǔ)體受體結(jié)合，或TLR 與感染性刺激因素結(jié)合，可活化PAD4，隨后解聚的染色質(zhì)和顆粒蛋白通過核膜的出芽形式釋放到細(xì)胞外，形成中性粒細(xì)胞非裂解模式NETs［9］。

2 NETs 在髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中的作用機(jī)制

髖關(guān)節(jié)置換術(shù)是多種終末期髖關(guān)節(jié)疾病的有效治療手段［10］，多用于治療股骨頭壞死、股骨頸骨折、強(qiáng)直性脊柱炎、先天性髖關(guān)節(jié)脫位、髖臼發(fā)育不良等疾?。?1］，可緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能、提高生活質(zhì)量。髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中發(fā)生率為0.2%～0.5%［12］，其致殘率高，甚至危及生命。手術(shù)創(chuàng)傷引起創(chuàng)傷炎癥反應(yīng)激活NETs，誘發(fā)高凝狀態(tài)、血小板聚集、凝血功能亢進(jìn)、動脈粥樣硬化斑塊脫落，導(dǎo)致血栓形成。髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜且影響因素較多，NETs 發(fā)揮著重要作用，其在髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中的機(jī)制如下：

2.1 NETs 大量釋放使血液處于高凝狀態(tài)

手術(shù)創(chuàng)傷性炎癥刺激下中性粒細(xì)胞活化釋放大量的NETs，通過上調(diào)細(xì)胞磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）和P-選擇素（P-selectin）表達(dá)，誘導(dǎo)血液處于高凝狀態(tài)［13］，NETs 提供纖維樣骨架結(jié)構(gòu)，形成血栓栓子，栓子伴隨著血液循環(huán)栓塞顱內(nèi)動脈。研究表明，在膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后血液呈高凝狀態(tài)，而且NETs 在其術(shù)后下肢深靜脈血栓患者中呈高表達(dá)［14］，髖關(guān)節(jié)置換術(shù)作為創(chuàng)傷性炎性刺激引起中性粒細(xì)胞活化，大量NETs 形成及釋放促進(jìn)血液高凝。

2.2 NETs 促進(jìn)血小板高效聚集和血栓形成

術(shù)后活化的血小板分泌高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein,HMGB1），通過晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor of advanced glycation end products, RAGE）、TLR2 和TLR4 受體激活中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)NETosis，組蛋白與血小板結(jié)合誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，血漿黏附蛋白（如纖維蛋白原）促進(jìn)血小板微聚集，同時組蛋白誘導(dǎo)血小板高效聚集，形成大的血小板聚集物［15］，NETs 的大型網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于血小板聚集和血栓形成。

損傷的內(nèi)皮細(xì)胞釋放白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白介素-8（interleukin-8,IL-8）和ROS等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活性，加速NETs 形成［16］。NETs 釋放的金屬蛋白酶、NE、組織蛋白酶G和蛋白酶3 可以破壞內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接［17］。與此同時，NETs 再次激活內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血小板產(chǎn)生血栓素A2（thromboxane A2, TXA2）和P-Selectin，激活血管細(xì)胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）和細(xì)胞內(nèi)粘附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1），促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移。NETs 產(chǎn)生過程中釋放出大量自身抗原，從而加劇血栓形成［18］。

2.3 NETs 促進(jìn)凝血酶產(chǎn)生、激活部分凝血因子，促進(jìn)凝血功能

NETs 具有激活外源性和內(nèi)源性凝血級聯(lián)的能力［19］，在觸發(fā)凝血途徑中，來自NETs 的純化DNA骨架誘導(dǎo)血漿產(chǎn)生凝血酶［20］，NETs 中組蛋白通過TLR2 和TLR4 激活血小板來誘導(dǎo)富血小板血漿中凝血酶的生成。凝血級聯(lián)反應(yīng)的限速步驟中凝血酶將纖維蛋白原裂解成纖維蛋白，NETs 通過內(nèi)在的凝血途徑促進(jìn)外周血纖維蛋白和凝血酶的形成。NETs 的成分，例如H3Cit 和組蛋白H4（citrullinated histones 4,H4Cit），對內(nèi)皮細(xì)胞具有高度細(xì)胞毒性，組蛋白通過與凝血調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合并防止活化蛋白C 的激活，促進(jìn)凝血酶的產(chǎn)生［21］。一項創(chuàng)傷動物模型研究顯示，在損傷3 h 后，NETs 產(chǎn)生并加速凝血酶生成，誘導(dǎo)創(chuàng)傷性凝血［22］。研究證實(shí)，凝血因子XII（Factor XII,FXII）和凝血因子XI（factor XI,FXI）會導(dǎo)致血栓形成，NETs 與FXII 結(jié)合并刺激纖維蛋白形成［23］。

2.4 NETs 促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成，并破壞其穩(wěn)定性，導(dǎo)致斑塊脫落

NETs 激活動脈粥樣硬化病灶內(nèi)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells, PDCs）的自身免疫，引起大量干擾素合成和釋放，進(jìn)而強(qiáng)化炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動脈粥樣硬化進(jìn)展［24］。Warnatsch 等［25］證明，膽固醇晶體作為動脈粥樣硬化的高危因素，觸發(fā)中性粒細(xì)胞釋放NETs，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子并激活輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17, Th-17），增強(qiáng)動脈粥樣硬化斑塊中免疫細(xì)胞聚集，促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成。

與穩(wěn)定斑塊相比，不穩(wěn)定斑塊樣本中巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B 細(xì)胞和未成熟樹突狀細(xì)胞的水平明顯增高。目前確定補(bǔ)體片段C5a 受體1（complement component 5a receptor 1,C5aR1）、水通道蛋白9（aquaporin 9, AQP9）和唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素-9（Sialic acid-binding Ig-like lectin 9,SIGLEC9）3 個特征性基因與基于NETs 形成的動脈粥樣硬化斑塊關(guān)系密切。C5aR1 與補(bǔ)體系統(tǒng)中最強(qiáng)大的炎癥蛋白之一C5a 相互作用［26］，通過觸發(fā)核苷酸結(jié)合域和富亮氨酸重復(fù)蛋白3 炎性體來加速動脈粥樣硬化的發(fā)展，NE 具有C5 轉(zhuǎn)化酶活性，可裂解C5 蛋白，從而生成C5a，進(jìn)而誘導(dǎo)NETs 形成并降低動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。Inouye 等［27］發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化病變小鼠肝組織中AQP9 高表達(dá)。然而，SIGLEC9 能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的凋亡，抑制單核巨噬細(xì)胞浸潤［28］，阻止動脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展。

隨著老齡化加劇，髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者多為老年人群，合并多種內(nèi)科疾病，尤其是糖尿病［29］，動脈粥樣硬化加重了高齡患者髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中風(fēng)險，NETs 的釋放誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞死亡，導(dǎo)致斑塊穩(wěn)定性降低，增加斑塊破裂栓子脫落風(fēng)險。

3 NETs 在髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中診療中的作用

NETs 在缺血性腦卒中病理過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中患者急性期血漿中NETs的循環(huán)水平顯著增加［30］，腦梗死后3～5 d 達(dá)高峰［31］。缺血性腦卒中以意識障礙、肢體活動障礙、言語不利等神經(jīng)功能缺損等為主要臨床表現(xiàn)，致殘率高，嚴(yán)重者危及生命。骨科創(chuàng)傷后早期，具有強(qiáng)效促炎作用的NETs 會大量釋放［5］，特別是在髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后3～5 d NETs 釋放量達(dá)高峰，預(yù)防關(guān)節(jié)置換術(shù)后腦梗死對關(guān)節(jié)置換患者非常重要［32］，早期檢測NETs生物標(biāo)志物可預(yù)測術(shù)后缺血性腦卒中發(fā)生，抑制NETs 形成或促進(jìn)NETs 降解是預(yù)防、治療髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中新的思路。

3.1 NETs 在預(yù)測髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中的作用

對急性腦梗死患者行取栓治療后，發(fā)現(xiàn)其血栓中NETs 含量高的患者預(yù)后較差［33］，檢測外周血中NETs 的數(shù)量可預(yù)測腦梗死的發(fā)生及嚴(yán)重程度［34］，缺血性腦卒中作為髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后嚴(yán)重并發(fā)癥，特別是70 歲以上高齡患者，髖關(guān)節(jié)置換腦梗死發(fā)生率明顯升高，利用外周血對髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者進(jìn)行NETs相關(guān)生物標(biāo)志物檢測可以預(yù)測發(fā)生缺血性腦卒中的風(fēng)險，其相關(guān)生物標(biāo)志物主要有血漿游離H3Cit、血漿游離DNA（cell-free DNA,cfDNA）和MPO。

Kang 等［31］的研究表明，H3Cit 是目前可用于檢測NETs 形成更具體的標(biāo)記物之一，其敏感性和特異性均為88%［35］。缺血性腦卒中患者血漿中NETs 標(biāo)記物H3Cit 水平與死亡率呈正相關(guān)，H3Cit 也是評估急性缺血性腦卒中預(yù)后的有效標(biāo)志物。DNA 是NETs的重要組成部分，cfDNA 代表釋放的NETs，是NETs的替代標(biāo)記物，其特異性和敏感性達(dá)95%以上［35］，性能優(yōu)異。MPO 作為NETs 的分解產(chǎn)物釋放到細(xì)胞外，在腦缺血再灌注損傷的病理過程中觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，為腦卒中的早期診斷和病情評估提供參考價值，其敏感性達(dá)94%［35］。

3.2 NETs 在髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中預(yù)防、治療中的應(yīng)用

NETs 促進(jìn)血栓形成，NETs 是預(yù)防、治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)［17］，髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后創(chuàng)傷性炎癥刺激誘導(dǎo)NETs 產(chǎn)生并大量釋放，導(dǎo)致血液高凝狀態(tài)、血小板高效聚集、促進(jìn)凝血酶產(chǎn)生、激活部分凝血因子、動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性下降等，因此抑制NETs 形成，或促進(jìn)NETs 降解，可有效預(yù)防、治療髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中。

3.2.1 抑制NETs 的形成

血栓形成依賴于中性粒細(xì)胞中的PAD4，PAD4不可逆抑制劑（如氯脒） 與PAD4 活性位點(diǎn)的Cys645 共價結(jié)合，顯著減少組蛋白瓜氨酸化并抑制NETs 形成。GSK199 和GSK484 被開發(fā)為PAD4 的有效選擇性抑制劑，可抑制NETs 的形成［36］，PAD4 抑制劑的高親和力和高特異性，成為未來研究突破的重點(diǎn)。

ROS 促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙、增加血管通透性，線粒體ROS 由NADPH 氧化酶非依賴性途徑產(chǎn)生，利用抑制性藥物抑制NADPH 氧化酶的活性，進(jìn)而減少NETs 生成，減輕組織的氧化損傷，氧自由基清除劑依達(dá)拉奉可清除體內(nèi)自由基而減少NETs 產(chǎn)生，明顯改善神經(jīng)功能［37］。

NE 能損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加組織通透性，促進(jìn)炎性因子釋放,NE 抑制劑西維來司鈉能可逆性和競爭性抑制NE 釋放，在急性腦缺血損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［38］。

他汀類藥物通過抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制NETs 形成，同時改善重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogen activator, at-PA）誘導(dǎo)的出血轉(zhuǎn)化［39］。阿托伐他汀可減少TLR4 表達(dá)及其下游通路的激活，起到抗炎作用［40］，同時阿托伐他汀具有調(diào)脂作用，并通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移［41］，穩(wěn)定斑塊。

3.2.2 促進(jìn)NETs 的降解

脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase）是一種已知NETs 降解酶［42］，脫氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease I, DNaseI）和at-PA 聯(lián)合使用可加速急性缺血腦卒中早期的體內(nèi)溶栓。CdcPDE 是一種磷酸二酯酶，能夠抑制二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集，降解NETs 中的cfDNA，CdcPDE 的出現(xiàn)使DNase I 療法有望成為治療和預(yù)防血栓形成的新治療概念［43］。NETs 可能通過激活血小板和內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)急性腦梗死at-PA 抵抗，at-PA 可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒形成NETs，導(dǎo)致出血轉(zhuǎn)化和溶栓抵抗，當(dāng)at-PA 聯(lián)合DNase I 進(jìn)行溶栓治療時效率更高［44］，是提高患者at-PA 溶栓效率的一種治療方法。

4 展 望

NETs 異質(zhì)性強(qiáng)，其生物標(biāo)志物H3Cit、cfDNA和MPO 具有較高的特異性和敏感性，靶向預(yù)防NETs形成可成為防止髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中發(fā)生的新方法。目前針對NETs 研究結(jié)果大部分來自動物模型研究，具有局限性，隨著分子生物學(xué)發(fā)展，相信基于NETs 表達(dá)，更多NETs 生物標(biāo)志物可用于協(xié)助預(yù)測髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中發(fā)生，預(yù)防和治療的靶向藥物將逐漸問世，早期預(yù)防，早期診斷，早期治療，從而降低髖關(guān)節(jié)置換缺血性腦卒中的發(fā)生，改善預(yù)后。