警報素在椎間盤退變中作用的研究進展△

羅章斌，邱曉明，張亦智，康學(xué)文

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730030）

椎間盤由位于中央的髓核、四周包繞的纖維環(huán)以及頂部和底部的軟骨終板構(gòu)成［1］。髓核的營養(yǎng)供應(yīng)主要來自軟骨終板中的血管網(wǎng)，作為一個相對缺乏血供的組織，髓核內(nèi)部是一個相對缺氧、代謝產(chǎn)物堆積的酸性環(huán)境［2，3］。在人體內(nèi)部，存在著病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）和損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern,DAMP）這兩種免疫應(yīng)答方式，PAMP 主要與微生物的入侵相關(guān)，DAMP 主要識別機體的組織損傷［4］。這兩種模式可以觸發(fā)細胞信號通路，導(dǎo)致產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)會參與對外界環(huán)境的應(yīng)答。盡管一部分研究指出，椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IVDD）的發(fā)生可能與感染存在著部分關(guān)系［5，6］，但同時有研究指出，DAMP 也可能是IVDD 的重要原因之一［7～9］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）、熱休克蛋白（heat shock protein, HSP）、S100 蛋白家族、白細胞介素-1α（interleukin-1α, IL-1α）和白細胞介素-33 （interleukin-33, IL-33）等蛋白作為警報素，參與DAMP 所引起的IVDD 過程。

1 高遷移率族蛋白B1

HMGB1 是高度保守的非組蛋白家族的一員，因其特有的快速電泳遷移速度而得名。盡管HMGB1 具有高豐度和保守性，但其主要作為細胞外信號因子進行研究。HMGB1 可由活化的單核細胞和巨噬細胞等細胞主動分泌，或由壞死和受損細胞被動釋放，發(fā)揮報警蛋白的作用［10］。研究指出，HMGB1 在退變髓核組織中明顯高表達。當(dāng)過表達該蛋白時，髓核細胞活力降低，增殖變慢。此外，HMGB1 過表達可以促進髓核細胞凋亡、細胞外基質(zhì)降解以及細胞自噬［11］。有研究證實，HMGB1 的表達隨著患者髓核樣本中變性嚴(yán)重程度的增加而增加。HMGB1 的基礎(chǔ)表達定位于細胞核和細胞質(zhì)，當(dāng)脂多糖（lipopolysaccharide,LPS） 作用于髓核細胞后，細胞為了響應(yīng)應(yīng)激，HMGB1 從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，然后在細胞外釋放。當(dāng)用HMGB1 重組蛋白作用于髓核細胞后，可以劑量依賴性方式促進白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1,MMP-1）的基因和蛋白質(zhì)產(chǎn)生，其可能的原因是HMGB1 通過激活Toll 樣受體4（toll-like receptor 4, TLR4）來激活核因子κB（nuclear factor-κB, NFκB）信號通路，從而導(dǎo)致髓核細胞炎癥和髓核組織降解的發(fā)生［9］。除此之外，血清剝奪也可能是HMGB1 表達上調(diào)的原因之一。為了應(yīng)對血清剝奪應(yīng)激，HMGB1 從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，最終在細胞外釋放。研究進一步證實，血清剝奪會導(dǎo)致纖維環(huán)細胞發(fā)生自噬，細胞核和細胞質(zhì)中HMGB1 的獨立測量顯示細胞質(zhì)HMGB1 強度與微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3）斑點形成密切相關(guān)，這表明細胞質(zhì)中的HMGB1 可以作為椎間盤纖維環(huán)細胞中的自噬傳感器，并可作為一種有用的自噬標(biāo)志物［12］。另外，HMGB1 在髓核作用于背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion, DRG）之后引起的疼痛相關(guān)行為的發(fā)展中起重要作用。大鼠髓核免疫組化顯示，髓核中含有HMGB1。將髓核組織置于DRG附近，可導(dǎo)致疼痛相關(guān)行為的發(fā)生。但是，術(shù)后腹腔注射抗HMGB1 中和抗體的大鼠，疼痛相關(guān)行為會得到改善，其DRG 中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）的表達也會顯著降低。HMGB1 的阻斷治療有望成為神經(jīng)性疼痛的一種新的治療方法［13］。

白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）是引起髓核細胞退變的原因之一。當(dāng)IL-1β 作用于髓核細胞后，會導(dǎo)致髓核細胞發(fā)生細胞外基質(zhì)降解、炎癥反應(yīng)和凋亡的發(fā)生。甘草甜素（glycyrrhizin, GL）是HMGB1 的有效抑制劑，當(dāng)其作用于髓核細胞后，會逆轉(zhuǎn)IL-1β 的作用。GL 可以通過抑制p38/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun amino terminal kinase,JNK）信號通路來抑制HMGB1 的表達，抑制炎癥和細胞凋亡，同時抑制髓核細胞外基質(zhì)降解。GL 有可能成為治療IVDD 的新型細胞因子［14］。另有研究指出，IL-1β 處理同樣會引起HMGB1 的表達增加，而p38 抑制劑TAK-715 處理髓核細胞后則會逆轉(zhuǎn)IL-1β 的作用，HMGB1 的表達同樣會減少［15］。以上結(jié)果提示，靶向p38 和HMGB1 的藥物可能是一種針對IVDD 新穎的治療方法。

IVDD 的原因之一是髓核細胞基質(zhì)代謝失衡，與TNF-α 等炎癥因子有關(guān)。將髓核細胞用TNF-α 處理后，可導(dǎo)致髓核細胞發(fā)生衰老、焦亡，并促進細胞外基質(zhì)分解代謝，同時還會導(dǎo)致HMGB1 的表達升高［16，17］。但是，在用GL 抑制HMGB1 或用小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）敲減HMGB1 的表達后，由TNF-α 誘導(dǎo)的髓核細胞的退變過程會得到緩解。瑞舒伐他汀是一種在臨床上廣泛用于降低膽固醇水平、具有抗炎作用的藥物。瑞舒伐他汀可以通過下調(diào)HMGB1 表達的同時，抑制NF-κB 信號通路來減輕TNF-α 誘導(dǎo)的髓核細胞焦亡和衰老的發(fā)生，同時緩解細胞外基質(zhì)的降解［16］。有研究指出，高壓氧處理可能是治療IVDD 的手段之一。將髓核細胞置于高壓氧環(huán)境后，microRNA-107（miR-107）的表達顯著增加，由于HMGB1 是miR-107 的直接目標(biāo)，下游的HMGB1 的表達會被抑制。高壓氧可以通過抑制HMGB1 的表達來進一步發(fā)揮抗炎的作用［18］。用LPS處理THP-1 細胞，可以誘導(dǎo)巨噬細胞M1 極化，同時促進HMGB1 的表達升高。但是木蘭花堿（magnoflorine,MAG）則可以有效抑制THP-1 細胞的M1 極化，同時抑制炎性因子和HMGB1 的表達。同樣地，IL-1β 可以促進髓核細胞HMGB1 的產(chǎn)生，而MAG則會抑制HMGB1 的升高。此外，當(dāng)用M1 極化的THP1 細胞條件培養(yǎng)基作用于髓核細胞后，HMGB1的表達也會增加，而加入了MAG 的條件培養(yǎng)基則會抑制HMGB1 的產(chǎn)生。MAG 通過下調(diào)HMGB1 來緩解M1 極化巨噬細胞介導(dǎo)的IVDD 的體外模型［19］?？傊?，GL、瑞舒伐他汀、MAG 以及高壓氧均可以通過HMGB1 這一靶點緩解椎間盤的退變。

2 熱休克蛋白

HSP 也被稱為分子伴侶蛋白，是一類廣泛存在于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)家族。它因?qū)嵝菘舜嬖诜磻?yīng)而得名，其主要功能是應(yīng)對潛在的危險情況［20］，HSP 家族也在椎間盤的退變過程中扮演著重要的角色。機械負(fù)荷會影響椎間盤中細胞的行為和細胞外基質(zhì)的代謝平衡［21］。有研究指出，在機械負(fù)荷加載2 h 后，牛髓核中熱休克蛋白70（HSP70）顯著上調(diào)，而在去除機械負(fù)荷后恢復(fù)［22］。此外，有研究指出，線粒體裂變和融合的失調(diào)與多種疾病的發(fā)病機制有關(guān)，壓縮負(fù)荷會誘導(dǎo)髓核細胞發(fā)生線粒體裂變，還會引起髓核細胞外基質(zhì)分解代謝和線粒體凋亡途徑。但是，在促進HSP70 的表達后，被壓縮負(fù)荷誘導(dǎo)的線粒體裂變、細胞外基質(zhì)分解代謝以及線粒體途徑凋亡均會得到緩解，這一過程部分是通過HSP70 上調(diào)蛋白質(zhì)賴氨酸脫?；?（sirtuin3, SIRT3）的表達來實現(xiàn)的［23］。HSP70 對髓核細胞有著一定的保護作用。用叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide,TBHP）處理髓核細胞，可引起細胞活力喪失，線粒體凋亡和衰老的發(fā)生，還可以增加活性氧（reactive oxygen species,ROS），造成線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）的崩潰，以及促進三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）的消耗。但是，用HSP70誘導(dǎo)劑TRC051384 可以下調(diào)JNK/c-Jun 通路，減輕TBHP 誘導(dǎo)的髓核細胞的凋亡和衰老，以及氧化應(yīng)激的發(fā)生［24］。在缺氧條件下，HSP70 的表達也會發(fā)生變化。用HSP70 轉(zhuǎn)錄抑制劑KNK437 處理髓核細胞后，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性均有所增加。同樣，當(dāng)HSP70 過表達時，HIF-1α 的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性下降。HSP70 在缺氧條件下與HIF-1α 相互作用，HSP70 可能通過蛋白酶體途徑促進髓核細胞HIF-1α的降解［25］?？傊?，HSP70 在髓核應(yīng)對各種環(huán)境時發(fā)揮著重要的作用。

近期研究指出，巨噬細胞的極化對髓核細胞有一定的影響。巨噬細胞M1 極化的條件培養(yǎng)基可以導(dǎo)致髓核細胞發(fā)生炎癥和細胞外基質(zhì)分解代謝，但是HSP90 抑制劑（17-AAG）通過抑制絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB 途徑來阻礙巨噬細胞的M1 極化來減弱條件培養(yǎng)基的促炎活性，還可以通過上調(diào)HSP70和抑制Janus 激酶2-信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）通路，最終減輕了M1 極化巨噬細胞誘導(dǎo)的髓核細胞炎癥和分解代謝［26］。研究指出，血管長入會造成髓核內(nèi)部的物質(zhì)代謝、微環(huán)境等的改變［27］。IVDD 常伴有髓核纖維化和病理性血管生成，可能與巨噬細胞浸潤有關(guān)。免疫染色顯示嚴(yán)重退行性人椎間盤組織中血管長入與巨噬細胞浸潤之間存在空間關(guān)聯(lián)，并且在嚴(yán)重退行性人椎間盤組織中細胞遷移誘導(dǎo)蛋白（cell migration inducing protein, CEMIP）和血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）水平升高，CEMIP 參與多種組織的纖維化表型，VEGFA 和成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2,FGF2）與血管的長入相關(guān)。M1 和M2極化的巨噬細胞條件培養(yǎng)基可以提高髓核細胞中CEMIP 的表達，導(dǎo)致髓核細胞纖維化的發(fā)生，還可以提高髓核細胞中VEGFA 和FGF2 的表達，但是17-AAG 可以通過抑制CEMIP 來改善巨噬細胞誘導(dǎo)的髓核細胞纖維化表型以及病理性血管生成過程［28］。類似的研究指出，抑制HSP90 在一定程度上可以保護髓核細胞。研究指出，壓縮可以觸發(fā)受體相互作用蛋白激酶 1 （receptor interacting protein kinase 1,RIPK1）/受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3, RIPK3）/混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白 （mixed lineage kinase domain like protein,MLKL）導(dǎo)致的髓核細胞壞死性凋亡，引起線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激的發(fā)生。但是，抑制HSP90 可以調(diào)節(jié)RIPK1/ RIPK3/ MLKL 的表達和活性進而顯著減輕壞死性凋亡，并減輕線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激的發(fā)生［29］。在一項對人退行性髓核組織的免疫組化結(jié)果中指出，HSPA8 在腰椎間盤髓核組織中穩(wěn)定表達，但是其表達隨著IVDD 的嚴(yán)重程度而逐漸降低［30］?？傊琀SP 家族在IVDD 中發(fā)揮著重要的作用，更詳細的作用機制仍需要進一步探索。

3 S100 蛋白家族

S100 蛋白家族由結(jié)構(gòu)高度相似、但具有不同功能的成員組成，該蛋白家族在細胞內(nèi)充當(dāng)鈣離子傳感器并通過調(diào)節(jié)細胞外因子來調(diào)控細胞反應(yīng)，參與炎癥反應(yīng)、細胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫逃逸等過程［31］。研究指出，警報素成員中的S100A8、S100A9 蛋白參與椎間盤的退變過程。研究指出，S100A8 和S100A9 在嚴(yán)重退化的人髓核組織中顯著升高。當(dāng)S100A8 和S100A9 重組蛋白作用于髓核細胞后，可以促進基質(zhì)分解酶MMP-3、MMP-13，以及具有血小板反應(yīng)蛋白基序以及去整合素和金屬蛋白酶活性的蛋白-4（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4, ADAMTS-4）的表達顯著上調(diào)，抑制細胞外基質(zhì)聚集蛋白聚糖（aggrecan）和Ⅱ型膠原（collagen Ⅱ） 的表達；S100A8 和S100A9 還會引起炎癥因子IL-1、IL-6、IL-8 和TNF-α 的基因表達增加［32，8］。此外，S100A9 還會導(dǎo)致髓核細胞發(fā)生凋亡，促凋亡蛋白BCL2 相關(guān)X 蛋白、細胞色素C 及切割的胱天蛋白酶3 的表達量顯著升高［32］。具體的作用通路可能是S100A8 和S100A9 會與TLR4 結(jié)合，進一步誘導(dǎo)p65 核轉(zhuǎn)位，從而激活NF-κB 信號通路，導(dǎo)致促凋亡、促降解和促炎作用的發(fā)生，該過程可以被NF-κB 特異性抑制劑所逆轉(zhuǎn)［32，8］。此外，S100A12 作為S100 家族的重要成員之一，在牙周炎、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)展中有著重要的意義［33～35］。盡管S100A12在IVDD 過程中的作用尚未報道，但是相信在不久的將來，S100A12 將會是治療IVDD 的重要靶點之一。

4 IL-1α 和IL-33

IL-1α 和IL-1β 均是來自IL-1 家族的成員，IL-1β 在椎間盤的退變過程中發(fā)揮著重要的作用［36］。與IL-1β 不同，IL-1α 是一種雙重功能的細胞因子，通過原位IL-1α 的核易位或裂解的N-末端前肽來發(fā)揮生物學(xué)功能［37］。在先前的一項流行病學(xué)研究中，觀察到具有2 個IL-1α（+889C/T）等位基因（TT 基因型）的個體與沒有該等位基因（CC 基因型）的個體相比，IVDD 的風(fēng)險增加了3 倍以上［38］。另有薈萃分析指出，IL-1α（+889C/T）的基因多態(tài)性可增加純合、隱性和等位基因模型下IVDD 的風(fēng)險，尤其是在高加索人中。相比之下，IL-1β（+3954C/T）多態(tài)性可能與白種人患IVDD 的風(fēng)險存在明顯的關(guān)聯(lián)趨勢［39～41］。

IL-33 是一種組織來源的細胞因子，屬于IL-1家族。它在內(nèi)皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞樣細胞中廣泛表達，在正常條件和炎癥過程中都有表達，它的功能是在細胞或組織損傷時釋放警報信號，以激活表達致癌抑制因子2（suppression of tumorigenicity 2, ST2，也稱為IL-33R）受體的免疫細胞［42］。有基礎(chǔ)研究指出，在人體退變髓核組織中，IL-33 的表達顯著降低。此外，在人的原代髓核細胞中，過表達IL-33 可以增加細胞外基質(zhì)aggrecan 和collagenⅡ的表達，抑制基質(zhì)降解酶和凋亡相關(guān)基因的表達，還可以通過增加HIF-1α 的表達來增強aggrecan 和collagenⅡ的表達；但是，在抑制了IL-33的表達之后，HIF-1α 的表達被抑制，aggrecan 和collagenⅡ的表達也會降低?？傊?，IL-33 表達的改變可以通過調(diào)節(jié)HIF-1α 進而調(diào)節(jié)髓核細胞的基質(zhì)降解和凋亡［43］。

5 小結(jié)與展望

目前，對于警報素的研究日益深入，警報素在IVDD 中扮演著重要角色。眾多研究指出，由于椎間盤獨特的結(jié)構(gòu)，髓核可能是一個免疫豁免組織。然而，近期許多研究表明，巨噬細胞浸潤和血管侵入可能是IVDD 的重要原因之一。警報素作為PAMP 和DAMP 的共同配體，更是在椎間盤的退變過程中發(fā)揮著重要的作用。相信在不久的將來，免疫因素是否在IVDD 過程中發(fā)揮著作用將會得到更好的回答。同時，針對警報素的進一步研究將會為IVDD 的治療提供更好的思路和方法。