糖尿病腎病中與鐵死亡相關(guān)中樞基因的識別

趙升 李文川 董蘭 連容 李玥嬌 何鳳

【摘要】目的 通過生物信息學(xué)分析，識別在糖尿病腎病（DN）進(jìn)展中發(fā)揮重要作用的鐵死亡相關(guān)基因，為DN的治療提供新見解。方法 對RNA測序數(shù)據(jù)集GSE142025進(jìn)行DN差異表達(dá)基因（DEGs）的分析和篩選，并進(jìn)行了基因本體論（GO）功能注釋和基因集富集分析（GSEA）。隨后，構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）來識別關(guān)鍵基因。通過韋恩圖將DEGs和關(guān)鍵基因所共有的鐵死亡相關(guān)基因（FRGs）確立為中樞（hub）基因。應(yīng)用受試者操作特征（ROC）曲線驗證hub基因的臨床診斷價值，并采用免疫組織化學(xué)染色（IHC）法檢測 hub 基因在3例 DN 患者及3例正常腎組織中的表達(dá)量。結(jié)果 在DN組和對照組（NC組）篩選出1 916個DEGs。GO功能富集分析顯示，DEGs主要參與炎癥相關(guān)的生物過程，GSEA分析提示DEGs在鐵離子結(jié)合的生物過程中顯著富集。WGCNA構(gòu)建的12個共表達(dá)模塊中，grey60、turquoise和grey模塊與DN的相關(guān)性最高。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)從3個模塊中挑選出188個關(guān)鍵基因，其中與DEGs共有的FRGs有2個，分別為銅藍(lán)蛋白（CP）基因和脂質(zhì)運載蛋白-2（LCN2）基因。ROC曲線驗證二者皆具有良好的臨床診斷價值。IHC結(jié)果顯示，2個基因在DN患者組織樣本中表達(dá)均上調(diào)（P均< 0.05），與生物信息學(xué)的分析結(jié)果相一致。結(jié)論 CP和LCN2可能通過抑制腎組織中的鐵死亡參與DN疾病的發(fā)展，可作為DN潛在的生物標(biāo)志物和治療的新靶點。

【關(guān)鍵詞】糖尿病腎?。患訖?quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析；鐵死亡；銅藍(lán)蛋白；脂質(zhì)運載蛋白-2

Characterization of hub genes associated with ferroptosis in diabetic nephropathy

ZHAO Sheng， LI Wenchuan， DONG Lan， LIAN Rong， LI Yuejiao， HE Feng

（Department of Nephrology， the Second Affiliated Hospital， School of Medicine， South China University of Technology，

Guangzhou 510180， China）

Corresponding author： HE Feng， E-mail： eyhefeng@scut.edu.cn

【Abstract】Objective To identify hub genes associated with ferroptosis in the progression of diabetic nephropathy （DN） through bioinformatics analysis， offering novel insights into DN treatment. Methods Differentially expressed genes （DEGs） in DN were screened using RNA sequencing dataset GSE142025， and Gene Ontology （GO） and Gene Set Enrichment Analysis （GSEA） were utilized for functional annotation. Subsequently， the Weighted Gene Co-expression Network Analysis （WGCNA）was conducted to pinpoint key genes. Venn diagrams aided in identifying hub genes among ferroptosis-related genes （FRGs） common to DEGs and key genes. ROC curves were employed to assess the clinical diagnostic potential of these hub genes. Immunohistochemistry （IHC）was conducted to detect the expression levels of hub genes in DN patients and normal kidney tissues. Results 1 916 DEGs were identified between the DN and control （NC） groups. GO enrichment analysis revealed that DEGs were mainly involved in inflammation-related biological processes. GSEA analysis found significant enrichment in processes related to iron ion binding. Among 12 co-expression modules constructed by WGCNA， grey60， turquoise， and grey modules showed the highest correlation with DN. 188 key genes were selected from 3 modules based on the screening criteria， among which 2 were FRGs shared by DEGs， namely ceruloplasmin （CP） gene and lipocalin-2 （LCN2） gene. ROC curves confirmed high clinical diagnostic value of these two genes. IHC results showed upregulated expression of both two genes in DN patient samples （both P < 0.05）， consistent with the findings of bioinformatics analysis.? Conclusion CP and LCN2 could be involved in the progression of DN by inhibiting ferroptosis， serving as promising biomarkers and treatment targets for DN.

【Key words】Diabetic nephropathy； WGCNA； Ferroptosis； Ceruloplasmin； Lipocalin-2

糖尿病腎?。―N）是糖尿病的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎?。‥SRD）的主要原因［1-2］。盡管對糖尿病患者已有全面的醫(yī)療健康管理策略，但DN發(fā)病率仍呈逐年上升的趨勢［3］。DN發(fā)病的機制涉及血流動力學(xué)的變化、代謝失衡以及炎癥免疫等多重因素［4-7］。目前尚無有效延緩DN進(jìn)展的特效藥物，因此需要研究新的生物標(biāo)志物來提高DN的早期診斷準(zhǔn)確性，從而及時干預(yù)，延緩ESRD的發(fā)生。DN與細(xì)胞程序性死亡如自噬、細(xì)胞凋亡和壞死相關(guān)［7-8］。鐵死亡作為一種由氧化應(yīng)激損傷引發(fā)的細(xì)胞程序性死亡形式，引發(fā)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物過度堆積以及谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）活性降低，可導(dǎo)致腎臟組織受到嚴(yán)重的活性氧（ROS）損

害［9-10］。近年來，越來越多的科學(xué)研究證明，鐵死亡可能在DN的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［11］。因此，深入研究DN發(fā)生、發(fā)展過程中鐵死亡的相關(guān)病理機制成為目前研究的焦點。隨著高通量測序技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，利用基因數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)技術(shù)對海量的數(shù)據(jù)分析可深入挖掘疾病進(jìn)展過程中的分子功能及變化聯(lián)系，為揭示疾病的起因和發(fā)展機制提供了更多的可能性。

本課題擬通過從DN中篩選出有差異表達(dá)的、與鐵死亡相關(guān)的基因（FRGs），同時從加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）高度相關(guān)的基因模塊中識別并鑒定具有潛在價值的FRGs作為DN的潛在生物標(biāo)志物，為DN的早期診斷和治療提供了新方向，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

本課題收集來自華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的3例經(jīng)活組織檢查（活檢）確診的DN（尿白蛋白與肌酐質(zhì)量比>30 mg/g）腎組織樣本，以及3例腎切除術(shù)后未受影響的正常（NC）腎組織作為對照。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：S-2021-065），所有參與者均已簽署知情同意書。

1.2 獲取數(shù)據(jù)集及篩選差異基因

從GEO數(shù)據(jù)庫下載糖尿病腎組織活檢樣本的RNA測序數(shù)據(jù)集GSE142025，包含正常對照組（NC組）9例和DN組27例。使用R軟件中的“l(fā)imma”包對NC組和DN組進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEGs）的分析和篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P < 0.05且|Log2FC| > 1。隨后使用“ggplot2”包繪制火山圖以可視化DEGs。

1.3 基因功能富集分析

為了探索DEGs的生物功能和參與的生物過程，使用R軟件的“clusterProfiler”包對DEGs進(jìn)行基因本體論（GO）功能分析和基因集富集分析（GSEA）。

1.4 獲取與鐵死亡相關(guān)的基因集

在FerrDb網(wǎng)站（http： //www.zhounan.org/ferrdb）上獲得經(jīng)證實在人體組織中表達(dá)的與鐵死亡相關(guān)的基因集，包括265個Driver基因、280個Suppressor基因和3個Marker基因。排除重復(fù)的基因，最終篩選出396個FRGs。

1.5 WGCNA的構(gòu)建

使用 R 軟件的“WGCNA”包，根據(jù)方差排名，在數(shù)據(jù)集中選取17 182個在前25%的基因構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過“pickSoftThreshold”函數(shù)確定適當(dāng)?shù)能涢撝担箻?gòu)建的基因網(wǎng)絡(luò)更符合無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)特征。然后根據(jù)基因加權(quán)的相關(guān)系數(shù)，將基因按照表達(dá)模式分類，得到基因樹狀聚類圖。再計算基因表達(dá)譜和給定模型的相關(guān)性，對相關(guān)性較高的模塊進(jìn)行合并后得到12個模塊。最后計算基因模塊和臨床狀態(tài)之間的相關(guān)性及統(tǒng)計學(xué)P值，r的絕對值越接近1，說明相關(guān)性越大；P < 0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 關(guān)鍵模塊和中樞基因的識別

將與臨床特征關(guān)聯(lián)度最高的模塊確立為關(guān)鍵模塊，將Gene Significance（GS）>0.2和Module Membership（MM）>0.8的基因定為關(guān)鍵基因。對DEGs、WGCNA和FRGs取交集，確定交集處的基因為中樞（hub）基因。

1.7 免疫組織化學(xué)染色（IHC）

將所收集的3例DN腎組織和3例NC腎組織樣本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片后使用特異性抗體進(jìn)行IHC。使用的抗體為：銅藍(lán)蛋白基因（CP，21131-1-AP），脂質(zhì)運載蛋白-2（LCN2，26991-1-AP）。然后應(yīng)用Image J軟件的IHC-Toolbox軟件對400倍視野的IHC結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪制統(tǒng)計圖。所有計量資料均符合正態(tài)分布，以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P < 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DN組與NC組的DEGs篩選

使用R軟件分析并篩選數(shù)據(jù)集GSE142025中的DEGs，得到1 916個DEGs，火山圖見圖1A，其中上調(diào)的基因為1 071個，下調(diào)的基因為845個。

2.2 GO功能分析和GSEA

DEGs的GO功能分析見圖1B。與NC組相比，DN組的DEGs主要富集于與炎癥相關(guān)的生物過程，涉及炎性細(xì)胞的激活、分化和增殖。GSEA結(jié)果提示，DEGs的分子功能富集于鐵離子結(jié)合的生物過程（圖1C）。因鐵離子的結(jié)合過程可能與DN疾病進(jìn)展中的鐵死亡過程相關(guān)，故從FerrDb網(wǎng)站獲取396個已被證實在人體組織表達(dá)的FRGs，其中32個FRGs為與DEGs共有的基因（圖1D）。熱圖展示了FRGs在數(shù)據(jù)集GSE142025中的表達(dá)和差異情況（圖1E）。

2.3 構(gòu)建WGCNA并篩選關(guān)鍵基因

使用數(shù)據(jù)集GSE142025中的36個樣本構(gòu)建WGCNA（圖2A），選取最佳的軟閾值20（圖2B），代入模型構(gòu)建無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，獲得擬合指數(shù)R2=0.97（圖2C）。利用基因樹狀圖進(jìn)行層次聚類以生成模塊，合并具有相似特征基因的模塊，最終得到12個共表達(dá)模塊（圖2D）。評估基因模塊與臨床狀態(tài)之間的相關(guān)性（圖2E），結(jié)果顯示grey60（r=-0.53）、turquoise（r=-0.48）和grey模塊（r=0.46）與DN的相關(guān)性最高且具有統(tǒng)計學(xué)意

義（P均< 0.05）。繪制這3個模塊的散點圖（圖2F～H），選取GS>0.2和MM>0.8的基因，共獲得188個關(guān)鍵基因。

2.4 Hub基因的篩選和驗證

將通過WGCNA獲得的關(guān)鍵基因與32個FRGs繪制韋恩圖（圖3A），取交集為hub基因，即銅藍(lán)蛋白基因（CP）和脂質(zhì)運載蛋白-2（LCN2）。ROC曲線驗證了hub基因，結(jié)果顯示CP和LCN2的AUC均為0.852，均>0.80的標(biāo)準(zhǔn)（圖3B）。繪制散點圖可視化hub基因在數(shù)據(jù)集GSE142025中的表達(dá)情況（圖3C），用IHC交叉驗證（圖3D、E），檢測hub基因的蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示2個基因在DN腎組織中的表達(dá)均上調(diào)，與生物信息學(xué)分析的結(jié)果一致。

3 討 論

DN因其逐年升高的發(fā)病率和致死率以及昂貴的醫(yī)療費用，正在成為世界性的公共衛(wèi)生問題［12］。由于DN的發(fā)病機制尚不明確，目前尚無有效的藥物或方法預(yù)防ESRD。鐵死亡是一種由氧化應(yīng)激損傷引發(fā)的鐵依賴性細(xì)胞程序性死亡的形式，已有研究證實其參與多種疾病的炎癥和氧化的病理過程［13-16］。鑒于炎癥和氧化在DN的疾病進(jìn)展中扮演的重要角色，探究DN發(fā)生、發(fā)展過程中與鐵死亡相關(guān)的分子機制成為近年研究的熱點。早期研究揭示，鐵在腎臟中的過度累積會加速糖尿病大鼠的腎損傷［17］。在此基礎(chǔ)上，F(xiàn)eng等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境的刺激下，腎臟組織細(xì)胞顯現(xiàn)出明顯的鐵死亡特征，包括膜密度的增加、線粒體的體積縮小、線粒體嵴的減少甚至消失，以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛和4-羥基壬烯醛等相關(guān)分子的過表達(dá)。Kim等［11］進(jìn)一步的研究表明，鐵死亡抑制劑Fer-1能夠顯著改善TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞死亡以及脂質(zhì)過氧化物的累積。Feng等［19］指出，鐵死亡可能通過激活低氧誘導(dǎo)因子/血紅素氧合酶1途徑促進(jìn)DN進(jìn)展，從而損害腎小管。Chen等［20］的研究則顯示，通過抑制糖尿病小鼠足細(xì)胞中GPX4的泛素化，可以保護(hù)腎臟免受鐵濃縮和氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而改善DN。此外，Lu等［21］的研究表明，恩格列凈可能通過促進(jìn)AMP活化蛋白激酶介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2激活途徑減輕DN小鼠以及HK-2細(xì)胞高糖模型的鐵死亡損傷，從而改善DN腎臟組織的病變。上述研究均表明，鐵死亡在DN的進(jìn)展中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，探索鐵死亡相關(guān)調(diào)控途徑中新的生物標(biāo)志物有望為減緩DN進(jìn)展的治療提供新的研究方向。

本研究利用生物信息學(xué)的方法在DN組和NC組鑒定出1 916個DEGs，其中上調(diào)的基因有1 071個、下調(diào)的基因有845個。GO功能分析顯示，DEGs主要參與炎癥相關(guān)的生物過程，而GSEA結(jié)果提示DEGs的分子功能顯著富集在鐵離子結(jié)合的生物過程上，表明在DN的發(fā)生發(fā)展中鐵死亡可能與DN的炎癥過程相關(guān)。本研究通過韋恩圖獲得DN組與NC組間差異表達(dá)的32個FRGs，隨后使用WGCNA獲得存在差異性和與臨床狀態(tài)相關(guān)性最高的3個模塊中的188個關(guān)鍵基因，聯(lián)合關(guān)鍵基因和FRGs鑒定出2個hub基因即CP和LCN2。

CP是一種攜帶銅的金屬酶，其主要作用是通過將二價銅離子還原成一價，從而充當(dāng)促氧化劑，把亞鐵轉(zhuǎn)化為可以與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的三價形態(tài)［22］。早期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血清CP水平升高［23-24］。Yamazaki等［25］的研究表明，血清CP水平升高是DN進(jìn)展的危險因素，對患者不良預(yù)后有一定的預(yù)測價值。Tsai等［26］的研究指出，尿液中CP水平與近端腎小管細(xì)胞的損傷呈正相關(guān)，提示CP可能通過鐵死亡在早期DN中發(fā)揮病理生理作用。另外，Shang等［27］的研究表明，CP的過表達(dá)可抑制鐵死亡誘導(dǎo)劑在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的鐵、丙二醛和脂質(zhì)ROS的沉積，從而減少肝癌細(xì)胞中的鐵死亡。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，CP的AUC>0.80，對臨床DN具有一定的診斷效能，且IHC結(jié)果顯示DN組中CP的表達(dá)量明顯上調(diào)。

LCN2在大多數(shù)組織的上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中產(chǎn)生，也被稱中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（NGAL），是免疫調(diào)節(jié)蛋白亞家族的一部分，在炎癥環(huán)境中已成為一種關(guān)鍵的鐵調(diào)節(jié)蛋白。LCN2的表達(dá)上調(diào)可以募集炎癥細(xì)胞和誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放［28-29］。已有研究顯示，在急性腎損傷和慢性腎臟病中，血清及尿液中LCN2的含量會隨著估計腎小球濾過率的下降和白蛋白尿的增加而升高，其可作為腎小管損傷的標(biāo)志物［30-32］。Jaberi等［33］的研究表明，高血糖刺激下LCN2的合成增加。Tang等［34］的研究發(fā)現(xiàn)，尿液中NGAL水平與DN的腎損傷分期相關(guān)。Song等［35］的體外實驗研究表明，NGAL促進(jìn)HK-2細(xì)胞的增殖以及減少細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。本研究LCN2的ROC曲線分析結(jié)果表明，LCN2對DN進(jìn)展的診斷有一定臨床價值（AUC為0.825）。

另外，本研究中IHC結(jié)果顯示，DN組織的CP和LCN2的表達(dá)水平升高，提示其可能是機體對DN氧化和免疫環(huán)境失衡的一種穩(wěn)態(tài)反應(yīng)。這種上調(diào)可能是機體的一種代償機制，旨在通過負(fù)調(diào)控鐵死亡以延緩DN的疾病進(jìn)展，但發(fā)揮該作用的具體機制尚需進(jìn)一步利用體外細(xì)胞實驗和動物模型實驗研究闡明，以期為DN治療靶向的藥物研發(fā)提供新的見解和方向。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：林燕薇）