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    腰果CBF基因家族的鑒定及響應(yīng)冷脅迫的表達(dá)模式

    2024-06-05 08:36:45崔恒久曾教科李雯黃海杰彭世清郭冬蒲金基周永凱李輝亮
    熱帶作物學(xué)報(bào) 2024年3期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄因子腰果

    崔恒久 曾教科 李雯 黃海杰 彭世清 郭冬 蒲金基 周永凱 李輝亮

    關(guān)鍵詞:腰果;低溫響應(yīng);CBF 轉(zhuǎn)錄因子;基因家族;qRT-PCR

    植物生長(zhǎng)受多種環(huán)境因素的控制,其中溫度是重要的因素之一[1]。低溫脅迫會(huì)影響甚至破壞細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡,導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重影響[2]。C-repeat binding factor(CBF)轉(zhuǎn)錄因子,也叫做dehydration responsive element binding factor1蛋白(DREB1 蛋白)[3-4],在響應(yīng)低溫脅迫中起重要作用,冷應(yīng)答途徑是植物感受低溫信號(hào)重要的調(diào)控途徑之一。ICE-CBF-COR 是被研究最透徹的一條通路。植物對(duì)低溫等非生物脅迫抗性的提高與脯氨酸、可溶性糖等物質(zhì)的積累密不可分,而相關(guān)物質(zhì)的積累需要下游基因的激活表達(dá)。下游基因的激活表達(dá)需要CBF 轉(zhuǎn)錄激活因子與下游COR 基因啟動(dòng)子中的DRE/CRT (C-repeat/dehydration responsiveelement)順式作用元件特異性結(jié)合[5-8]。

    CBF轉(zhuǎn)錄因子屬于Apetala2/Ethylene responsivefactor 基因家族(AP2/ERF 基因家族),AP2/ERF由AP2 亞家族、ERF 亞家族和RAV 亞家族組成。目前,CBF 基因家族已經(jīng)在多種植物中得以研究,擬南芥(Arabidopsis thaliana)研究表明,擬南芥基因組中含有6 個(gè)CBF 基因[9]。此外,CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子還存在于其他植物中,如番茄[10-13]、水稻[14-20]、大豆[21-25]等。CBF/DREB1 轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域。AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域含約60 個(gè)氨基酸[26]。

    腰果(Anacardium occidentalie Linn)被譽(yù)為世界四大著名堅(jiān)果之一。是典型的熱帶果樹,原產(chǎn)地在巴西東北部地區(qū),16 世紀(jì)被引入亞洲、非洲以及南美洲的熱帶國(guó)家和地區(qū)[27]。栽培的緯度范圍在北緯20°和南緯20°之間,但主要分布在15°以內(nèi)地區(qū)。我國(guó)腰果種植主要集中在云南、海南等地。

    腰果仁有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,用途十分廣泛,可作為甜品、點(diǎn)心、菜肴的原材料。副產(chǎn)品主要有果梨、果殼液等,果殼液被作為重要的工業(yè)原料被大量使用,果梨可以食用,用在果酒、果醬、腌菜等[28]。因此,種植腰果可以帶來很大的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。在中國(guó)熱帶地區(qū)脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興中起到重要作用。腰果對(duì)低溫比較敏感,當(dāng)溫度低于15 ℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢,在8 ℃時(shí)受到嚴(yán)重傷害,此前,海南等地的腰果因低溫受災(zāi)嚴(yán)重。目前,對(duì)腰果的研究主要集中在生理層面,對(duì)于分子層面的研究較少??鼓婊蛞呀?jīng)在許多物種中進(jìn)行了挖掘和應(yīng)用,本研究將腰果作為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)腰果的CBF 基因家族進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析,分離鑒定得到AoCBF 基因,為后續(xù)深入開展腰果耐寒性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    將保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)庫的腰果種質(zhì)資源CJSX 作為實(shí)驗(yàn)材料。通過篩選得到有活力的種子,將篩選的種子進(jìn)行催芽,長(zhǎng)出真葉后移栽至育苗盤中,在溫度為25 ℃,16 h 光照,2800 lx 的環(huán)境下生長(zhǎng)。生長(zhǎng)到6 片真葉時(shí),移栽至人工氣候屋,保持光照條件不變,對(duì)照溫度25 ℃(CK)不變,溫度分別調(diào)至8 ℃、16 ℃,2個(gè)溫度下處理時(shí)間為6 h、24 h,共4 個(gè)處理(T1:8 ℃ 6 h,T2:8 ℃ 24 h,T3:16 ℃ 6 h,T4:16 ℃24 h)。將低溫處理過的腰果葉片采摘,液氮處理,送公司進(jìn)行Illumina 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

    1.2 方法

    1.2.1 腰果CBF 基因家族的鑒定和分析 在擬南芥資源網(wǎng)站TAIR(https://www.arabidopsis.org/)上獲取相關(guān)AtCBFs 蛋白序列。將得到的AtCBFs蛋白序列進(jìn)行本地BLAST 分析, 相關(guān)參數(shù)E_value 設(shè)置為10e–50;蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)為identity≥60%,align_ratio≥60%。將蛋白是否含有AP2結(jié)構(gòu)域作為重要的判斷依據(jù),使用NCBI-CDD 數(shù)據(jù)庫與Pfam_scan 軟件進(jìn)行驗(yàn)證,由此得到具有AP2 結(jié)構(gòu)域的候選腰果CBF 基因。利用在線軟件Expasy( https://web.expasy.org/protparam/)分析腰果AoCBF 蛋白序列,對(duì)每個(gè)AoCBF 蛋白的等電點(diǎn)、長(zhǎng)度、相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行預(yù)測(cè)[29]。使用Cell-PLoc 2.0(http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在線軟件對(duì)候選的腰果CBF 基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[30]。

    1.2.2 AoCBF 蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守基序(motif)分析 對(duì)每個(gè)AoCBF 氨基酸序列使用MEGA-X軟件進(jìn)行比對(duì),使用MEME 在線軟件(https://meme-suite.org/meme/)對(duì)AoCBF 蛋白保守結(jié)構(gòu)域?qū)M(jìn)行分析。對(duì)相關(guān)AoCBF 蛋白的保守基序進(jìn)行分析[31],設(shè)置為5 個(gè)基序,設(shè)置基序?yàn)?0~200個(gè)氨基酸長(zhǎng)度,其他參數(shù)均為默認(rèn)值。使用SWISS軟件對(duì)AoCBF 蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[26]。

    1.2.3 AoCBF 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析為了進(jìn)一步研究腰果和擬南芥之間的進(jìn)化關(guān)系,將6 個(gè)AoCBF 蛋白和6 個(gè)AtCBF 蛋白采取Neighborjoining(NJ)法在MEGA-X 軟件上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24],Bootstrp method 參數(shù)值設(shè)為1000。

    1.2.4 AoCBF 基因上游序列的順式作用元件分析從 JGI(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Aoccidentalev0_9)網(wǎng)站上獲取AoCBF 基因上游2000 bp 的序列,利用PlantCARE 軟件對(duì)其進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析[32]。

    1.2.5 AoCBFs 在冷脅迫下的表達(dá)模式 用TBtools(v1.082)軟件提取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中腰果CBF 基因家族的CDS 序列,并通過IDT(https://sg.idtdna.com/pages)在線網(wǎng)站進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)按照說明書從每個(gè)樣品中提取總RNA,并對(duì)其濃度和純度進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示A260/A280 和A260/A230 的參數(shù)均在2.0 左右,表明RNA 無明顯的DNA 和蛋白污染,此外,通過瓊脂糖電泳也檢測(cè)RNA 的完整性。隨后通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(蘇州莫納生物科技有限公司)按照說明書合成cDNA 第一鏈并檢測(cè)其濃度,稀釋后備用。并使用2–ΔΔCT 方法計(jì)算每個(gè)AoCBFs 的最終相對(duì)表達(dá)水平。使用GraphPad Prism 8 軟件制圖,每個(gè)處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 腰果CBF 基因家族成員的鑒定和分析

    用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和6 個(gè)已知的擬南芥AtCBFs序列進(jìn)行本地BLAST 分析,共得到15 個(gè)注釋的DREB 基因。經(jīng)過結(jié)構(gòu)域分析,鑒定出11 個(gè)腰果CBF 基因。設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,獲得6 條腰果序列(AoCBF1~AoCBF6)。

    理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,AoCBFs 編碼的氨基酸序列存在較大差異,預(yù)測(cè)蛋白的長(zhǎng)度為189~334 aa,最長(zhǎng)的為AoCBF1,最短的為AoCBF4。蛋白分子量介于21.31~37.89 kDa 之間;6 個(gè)AoCBFs全部呈酸性,其理論等電點(diǎn)(pI)介于4.93~5.79之間。通過亞細(xì)胞定位分析得出所有AoCBFs 都有核定位信號(hào)(表2)。

    2.2 AoCBF 蛋白保守基序分析

    保守基序(motif)預(yù)測(cè)結(jié)果表明(圖1),AoCBFs 含有5 個(gè)保守motifs。motif 1、motif 2存在所有AoCBFs 中,表明2 個(gè)基序高度保守。AoCBF1只包含motif1、motif2,AoCBF2、 AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5、AoCBF6 包含motif1、motif2、motif3、motif5,原因可能是串聯(lián)重復(fù)過程中堿基丟失造成的。對(duì)上述保守基序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)motif 1 含有AP2 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)其在結(jié)構(gòu)上有所不同,推測(cè)不同AoCBF 在功能上存在一定差異。

    2.3 腰果和擬南芥CBF 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

    將6 個(gè)AoCBFs 氨基酸序列和6 個(gè)AtCBFs氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示,上述CBF氨基酸序列可分成A、B 兩個(gè)亞家族。AoCBFs在A 組有1 個(gè),B 組有5 個(gè)。AtCBFs 在A 組有2個(gè),B 組有6 個(gè)(圖2)。

    2.4 AoCBFs 三維結(jié)構(gòu)及序列特征分析

    6 個(gè)AoCBF 蛋白序列相似性在46%~58%之間。一段長(zhǎng)度為60 個(gè)氨基酸左右較為保守的序列在N 段被發(fā)現(xiàn),軟件預(yù)測(cè)其為CBF 蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖3)。AoCBFs 的identity 最高為AoCBF4 和AoCBF6。最高的同源性為58.21%。對(duì)AoCBFs 進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模分析,1 個(gè)α-螺旋和2 個(gè)β-折疊構(gòu)成AoCBFs 的三維結(jié)構(gòu)。

    2.5 AoCBFs 上游序列的順式作用元件分析

    利用PlantCARE 軟件注釋AoCBFs 基因上游2000 bp 啟動(dòng)子區(qū)域序列,在其上游發(fā)現(xiàn)了參與激素反應(yīng)的相關(guān)順式作用元件(茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)素、水楊酸有關(guān)的順式作用元件)、參與低溫、干旱和高鹽誘導(dǎo)脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件。此外,普遍存在于啟動(dòng)子與增強(qiáng)子區(qū)的核心元件、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)調(diào)控順式作用元件也被發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明,AoCBF 基因在抵御非生物脅迫、生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)控中發(fā)揮重要作用(表3)。

    2.6 AoCBFs 在冷脅迫下的表達(dá)模式

    為了探明AoCBFs 在冷脅迫下的表達(dá)模式,對(duì)AoCBFs 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。結(jié)果表明,經(jīng)8 ℃和16 ℃低溫誘導(dǎo)處理6 h 和24 h 后,除了AoCBF5 在8 ℃時(shí)相對(duì)表達(dá)量變化較少,在16 ℃表達(dá)變化較大,其他基因在8 ℃的表達(dá)量均顯著升高。表明AoCBF 基因參與響應(yīng)冷脅迫相關(guān)生物學(xué)過程(圖4)。

    3 討論

    腰果是典型的熱帶果樹,對(duì)低溫極敏感。主要在我國(guó)熱區(qū)的海南、云南等地種植。但是近年來冬季寒潮頻發(fā),溫度降低使腰果受到冷害的問題愈加嚴(yán)重。植物中CBF 家族在面對(duì)低溫時(shí)發(fā)揮調(diào)控作用,減少低溫對(duì)植株的損傷。因此,本課題組對(duì)腰果CBF 家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以期發(fā)現(xiàn)腰果CBF 基因在低溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制。

    本研究共鑒定獲得6 個(gè)AoCBF 基因。并對(duì)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹、蛋白三維結(jié)構(gòu)、順式作用元件以及對(duì)低溫脅迫下的表達(dá)方式進(jìn)行研究。由于AoCBFs 的等電點(diǎn)為4.93~5.79,蛋白呈酸性,故在酸性亞細(xì)胞環(huán)境下,AoCBF 蛋白可能會(huì)發(fā)揮作用。AoCBFs 可以分為2 個(gè)亞族:AoCBF1 為A 族,AoCBF2、AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5、AoCBF6 為B 族。而B 族中AoCBF3、AoCBF4 具有更高親緣性,AoCBF2、AoCBF5、AoCBF6 可能具有類似的調(diào)控方式。

    目前CBF 基因在十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、漆樹科植物、茄科植物中均有研究。最早是STOCKINGER 等[33]在模式植物擬南芥中克隆得到相關(guān)CBF 基因。擬南芥的6 個(gè)家族成員,受外源ABA 誘導(dǎo)的有CBF1、CBF2 和CBF3。CBF1 和CBF3 的表達(dá)受CBF2 的負(fù)調(diào)控。CBF4不能響應(yīng)低溫脅迫誘導(dǎo)但是能夠響應(yīng)干旱和ABA誘導(dǎo)[34]。DREB1E 和DREB1F 均可以受高鹽脅迫誘導(dǎo)。本研究在6 個(gè)AoCBFs 啟動(dòng)子上不僅篩選到響應(yīng)低溫誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)、光響應(yīng)元件有關(guān)的順式作用元件,而且篩選到與茉莉酸、生長(zhǎng)素、水楊酸、脫落酸、赤霉素等激素有關(guān)的順式作用元件。后續(xù)可開展分子對(duì)激素和冷信號(hào)調(diào)控的相關(guān)機(jī)制。

    AoCBF 基因家族6 個(gè)成員均不存在內(nèi)含子,所以AoCBF 基因?yàn)閮?nèi)含子缺失型。內(nèi)含子缺失型基因在面對(duì)脅迫時(shí),可通過減少轉(zhuǎn)錄處理的方法提高轉(zhuǎn)錄本積累的效率[35]。

    本研究發(fā)現(xiàn),腰果經(jīng)過冷脅迫處理后,6 個(gè)AoCBF 基因均對(duì)低溫產(chǎn)生響應(yīng),除了AoCBF1、AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5 在16 ℃表達(dá)顯量著提高,其余的基因均在8 ℃時(shí)表達(dá)量顯著提高。

    相較于傳統(tǒng)的雜交育種、誘變育種等方式,基因工程技術(shù)有高效率、短周期、提高植物抗逆性等優(yōu)勢(shì)??蒲泄ぷ髡呖梢岳没蚩寺〖夹g(shù)、基因重組技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等基因工程技術(shù)提升植物抵御低溫脅迫的能力。本研究通過對(duì)AoCBF基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析,分析AoCBF 基因在低溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制,為未來的腰果抗性分子輔助育種研究工作奠定基礎(chǔ)。

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