DOI：10.3969/j.issn.10001565.2024.02.008

摘" 要：為探索下調(diào)鳥氨酸脫羧酶1（ornithine decarboxylase1， ODC1）對人小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）細(xì)胞H82、H69增殖、凋亡及鉑類藥物敏感性的影響，檢測了人SCLC細(xì)胞系ODC1的表達(dá)水平，并利用LV-NC/ODC1-RNAi慢病毒感染H82、H69細(xì)胞后，通過實時熒光定量PCR（qPCR）和免疫印跡實驗（West1ern blot）檢測ODC1在mRNA和蛋白水平的表達(dá).CCK-8法、軟瓊脂克隆形成實驗、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot等檢測下調(diào)ODC1后細(xì)胞增殖、凋亡及對鉑類藥物敏感性的變化.結(jié)果顯示，ODC1在人SCLC細(xì)胞系中多數(shù)高表達(dá)，且下調(diào)ODC1后人SCLC細(xì)胞H82、H69增殖減慢，凋亡明顯增加，藥物敏感性增強(qiáng).說明下調(diào)ODC1抑制H82、H69細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對鉑類藥物的敏感性.

關(guān)鍵詞：鳥氨酸脫羧酶1（ODC1）；小細(xì)胞肺癌（SCLC）；增殖；凋亡；藥物敏感性

中圖分類號：R73-3""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：10001565（2024）02017309

Effects of ODC1 downregulation on the proliferation， apoptosis， and sensitivity to platinum drugs of human SCLC cells H82 and H69

GAO Xiangpeng1，2， WANG Xiaofang1， HE Wenyi1，2， LI Yumiao1， SONG Jin1， JIA Youchao1

（1. Hebei Key Laboratory of Cancer Radiotherapy and Chemotherapy， Department of Medical Oncology， Affiliated Hospital of Hebei University， Baoding 071000，China；2. School of Clinical Medicine， Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： To explore the effect of the downregulation of ornithine decarboxylase1 （ODC1） on the proliferation， apoptosis and platinum drugs sensitivity of human small cell lung cancer（SCLC） cells H82 and H69， the expression levels of ODC1 of the human SCLC cell lines were examined. H82 and H69 cells were infected with the LV-NC/ODC1-RNAi lentivirus， then the expression of ODC1 at the mRNA and protein levels was determined by real-time fluorescent quantitative PCR（q-PCR） and immunoblot assay（Western blot）. CCK-8 assay， colony formation assay， flow cytometry and Western blot were used to detect

收稿日期：20221116;修回日期：20230421

基金項目：

河北大學(xué)研究生創(chuàng)新項目（HBU2022ss002）;2021年政府資助省級醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才項目——小細(xì)胞肺癌基礎(chǔ)及轉(zhuǎn)化創(chuàng)新團(tuán)隊

第一作者：高翔鵬（1987—），男，河北大學(xué)碩士研究生，主要從事淋巴瘤、實體瘤的臨床診治及基礎(chǔ)研究.E-mail：821408156@qq.com

通信作者：賈友超（1981—），男，滿族，河北大學(xué)附屬醫(yī)院主任醫(yī)師，主要從事淋巴瘤、實體瘤的臨床診治及基礎(chǔ)研究.E-mail：youchaojia@163.com

宋瑾（1982—），女，河北大學(xué)附屬醫(yī)院主管護(hù)師，主要從事腫瘤護(hù)理研究.E-mail：2705251562@qq.com

the changes of cell proliferation，apoptosis and sensitivity to platinum drugs after downregulation of ODC1. As a result， ODC1 was mostly highly expressed in human SCLC cell lines; the proliferation of human SCLC cells H82 and H69 slowed down; their apoptosis significantly increased and drugs sensitivity was enhanced. In summary， downregulation of ODC1 can inhibits the proliferation of human SCLC cells H82 and H69， promotes cell apoptosis， and enhances cell sensitivity to platinum drugs.

Key words： ornithine decarboxylase1（ODC1）; small cell lung cancer（SCLC）; proliferation; apoptosis; drugs sensitivity

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）是侵襲性最高的肺癌病理類型，占所有類型的10%～15%，具有惡性程度高、生長迅速、容易耐藥、易早期轉(zhuǎn)移等特點，目前主要治療手段仍為傳統(tǒng)的化療和放療，預(yù)后極差，亟待高效的治療方案改善其臨床預(yù)后［1］.

鳥氨酸脫羧酶1（ornithine decarboxylase1，ODC1）是生物體內(nèi)多胺合成的第1個限速酶，其可以介導(dǎo)鳥氨酸生成腐胺，從而調(diào)控體內(nèi)多胺的合成，該酶持續(xù)高活性可引起多胺的異常累積［2］.多胺是生物體內(nèi)的一種有機(jī)小分子，生物學(xué)作用極為廣泛，參與包括人在內(nèi)的幾乎所有動植物的基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞周期等［3］，相關(guān)研究證實，多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞內(nèi)多胺的異常累積密切相關(guān)［4-6］.ODC1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，是一個極具價值的潛在的腫瘤診斷與預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點.然而，ODC1在SCLC中的潛在作用機(jī)制鮮見報道，有待進(jìn)一步探索.本研究旨在探討ODC1在SCLC中的分子功能及其對鉑類藥物敏感性的影響，為靶向治療SCLC尋找新的途徑.

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 細(xì)胞系

人SCLC細(xì)胞系H82細(xì)胞購自ATCC，人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H69購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心.

1.1.2" 試劑與抗體

1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibico公司）；RNAi-慢病毒（上海吉凱基因科技有限公司）；Anti-ODC-1 antibody（Abcam）；GAPDH Mouse monoclonal antibody（Proteintech）；Trizol（AcrylCarrier）；抗青霉素鏈霉素、HEPES溶液和PBS緩沖液（Solarbio）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和q-PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份公司）；BCL-2、BAX、Cytochrome3、Caspase3、cleaved-Caspase3、PARP，cleaved-PARP、Cyclin B1、Cyclin A2、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2、GAPDH抗體均購自CST公司.

1.2" 方法

1.2.1" ODC1低表達(dá)人SCLC細(xì)胞模型的構(gòu)建與驗證

取對數(shù)生長期的人SCLC細(xì)胞，計數(shù)，按照慢病毒感染手冊將LV-NC/ODC1-RNAi分別感染細(xì)胞；取感染后處于對數(shù)生長期的細(xì)胞提取RNA，并用oligo（dT）18作引物將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為第1鏈，再以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因ODC1（以GAPDH作為內(nèi)參）.PCR擴(kuò)增參數(shù)如下：在94 ℃ 預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，25個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min結(jié)束擴(kuò)增.PCR引物設(shè)計見表1.用RAPI裂解液提取對數(shù)生長期細(xì)胞蛋白，BCA法測定總蛋白含量.蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜.TBST室溫封閉1 h，一抗（體積比1∶1 000）孵育過夜，二抗（體積比1∶5 000）室溫孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色3 min，化學(xué)發(fā)光儀檢測目的蛋白表達(dá).

1.2.2" 細(xì)胞增殖實驗

收集處于對數(shù)生長期的H82、H69對照組和實驗組細(xì)胞，離心計數(shù)，以每孔1×104 個細(xì)胞平鋪于96孔板中，37 ℃培養(yǎng).分別于24、48、72、96、120 h加入CCK-8溶液（10 μL/孔），孵育4 h后用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處OD值.

1.2.3" 軟瓊脂克隆實驗

制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%與0.7%的瓊脂糖凝膠，高壓滅菌后置于55 ℃水浴鍋中，1.2%瓊脂糖凝膠與2×1 640培養(yǎng)基1∶1（體積比）混合，加入至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1.5 mL/孔；收集對數(shù)生長期的H82/H69對照組及實驗組細(xì)胞，離心計數(shù)，0.7%瓊脂糖凝膠與2×1 640培養(yǎng)基1∶1（體積比）混勻，加入適量細(xì)胞懸液（含5×103 個細(xì)胞）充分混勻，每孔加入1 mL，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，約2～3周后終止培養(yǎng)，拍照計數(shù).

1.2.4" 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集對數(shù)生長期的H82、H69對照組和實驗組細(xì)胞各（1～10）×105 個，用預(yù)冷PBS離心洗滌.用雙蒸水稀釋5×Binding Buffer為1×Binding Buffer工作液，取500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞.每管加入5 μL的Annexin V-APC和10 μL 7-AAD.輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min.最后上機(jī)進(jìn)行分析.

1.2.5" CCK-8檢測藥物敏感性

收集對數(shù)生長期的H82、H69對照組和實驗組細(xì)胞，離心計數(shù)，將細(xì)胞重懸于順鉑濃度為0、1、2、4、8、16、32、64 nmol/mL的培養(yǎng)基中，以1×104 個/孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120 h加入CCK-8溶液（10 μL/孔），孵育4 h后用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處OD值，計算順鉑抑制率.

1.3" 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件、GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖，實驗計量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；對于多組實驗結(jié)果比較，采用單因素方差分析.以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2" 結(jié)果

2.1" ODC1在人SCLC細(xì)胞系中的表達(dá)

分別提取人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及SCLC細(xì)胞系H69、H209、DMS153、H446、H82、H2066、H841、DMS114、SW1271、H526、H211的RNA，q-PCR檢測ODC1在正常肺上皮及SCLC細(xì)胞系中的表達(dá)情況（以GAPDH作為內(nèi)參），結(jié)果如圖1，ODC1在SCLC細(xì)胞系H82、H69、H526等10種細(xì)胞系中表達(dá)高于正常肺上皮細(xì)胞，在H446細(xì)胞系中的表達(dá)低于正常肺上皮細(xì)胞.

與對照組相比，***P＜0.001

2.2" shODC1慢病毒載體感染人SCLC細(xì)胞H82、H69

shODC1慢病毒載體感染人SCLC H82、H69細(xì)胞72 h后在熒光顯微鏡下觀察可見對照組及實驗組細(xì)胞均產(chǎn)生綠色熒光，表明慢病毒感染成功.利用q-PCR和Western blot分別檢測各細(xì)胞ODC1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，與對照組相比，H82-shODC1-1、H82-shODC1-2、H69-shODC1-1、H69-shODC1-2組ODC1 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯降低（Plt;0.001，圖2），結(jié)果表明ODC1低表達(dá)人SCLC細(xì)胞模型構(gòu)建成功.

2.3" 下調(diào)ODC1對H82、H69細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測下調(diào)ODC1對人SCLC細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果顯示，24、48、72、96、120 h實驗組H82-shODC1-1、H82-shODC1-2、H69-shODC1-1、H69-shODC1-2細(xì)胞的OD值明顯低于對照組（Plt;0.001，圖3），且隨著培養(yǎng)時間的增加抑制率明顯增高，表明下調(diào)ODC1抑制了人SCLC細(xì)胞H82、H69的增殖.

2.4" 下調(diào)ODC1對H82、H69細(xì)胞克隆能力的影響

軟瓊脂克隆實驗檢測下調(diào)ODC1對人SCLC細(xì)胞克隆能力的影響.結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組H82-shODC1-1、H82-shODC1-2、H69-shODC1-1、H69-shODC1-2細(xì)胞形成的克隆數(shù)量明顯減少（P＜0.001，圖4），且細(xì)胞克隆團(tuán)體積明顯減小.表明下調(diào)ODC1抑制了人SCLC細(xì)胞H82、H69的克隆能力.

2.5" 下調(diào)ODC1對H82、H69細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡.結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組H82-shODC1-1、H82-shODC1-2、H69-shODC1-1、H69-shODC1-2的凋亡細(xì)胞顯著增加（P＜0.001，圖5），表明下調(diào)ODC1促進(jìn)人SCLC細(xì)胞H82、H69凋亡.

2.6" 下調(diào)ODC1對H82、H69細(xì)胞凋亡途徑的影響

Western blot結(jié)果顯示：下調(diào)ODC1后線粒體凋亡途徑Caspase通路相關(guān)的抗凋亡蛋白BCL-2、Caspase、PARP表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白BAX表達(dá)上調(diào)，Cytochrome-C，cleaved-Caspase3，cleaved-PARP

也顯著上調(diào)（圖6），表明下調(diào)ODC1通過激活線粒體介導(dǎo)的Caspase凋亡途徑誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H82、H69凋亡.

2.7" 下調(diào)ODC1對H82、H69細(xì)胞分裂周期的影響

Western blot結(jié)果顯示：下調(diào)ODC1后，與對照組相比，實驗組H82-shODC1-1、H82-shODC1-2細(xì)胞Cyclin B1表達(dá)上調(diào)，Cyclin A2、CDK2表達(dá)下調(diào)，表明細(xì)胞阻滯于G2/M期；與對照組相比，實驗組H69-shODC1-1、H69-shODC1-2細(xì)胞Cyclin D1、CDK2表達(dá)上調(diào)，Cyclin E1表達(dá)下調(diào)，表明細(xì)胞阻滯于G1期（圖7）.

2.8" 下調(diào)ODC1對H82、H69細(xì)胞鉑類藥物敏感性的影響

使用不同濃度順鉑處理慢病毒感染的人SCLC細(xì)胞，結(jié)果如圖8和表2.與對照相比，實驗組H82-shODC1-1、H82-shODC1-2、H69-shODC1-1、H69-shODC1-2經(jīng)不同濃度順鉑處理后細(xì)胞的藥物敏感性增強(qiáng)，且呈現(xiàn)明顯的時間依賴性，尤其是H69細(xì)胞，表明下調(diào)ODC1增強(qiáng)了人SCLC細(xì)胞H82、H69對鉑類藥物的敏感性.

3" 討論

正常生理狀態(tài)下，多胺通過靜電作用與細(xì)胞內(nèi)含有多價陰離子的大分子化合物結(jié)合，從而促進(jìn)生物體復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等生物過程，為細(xì)胞的存活與增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)［2］.大量研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多胺代謝異常密切相關(guān)［7］.ODC基因包括ODC1和ODC2，ODC1定位于2p25.1，普遍存在于生物體內(nèi)，是多胺生物合成過程中的關(guān)鍵酶之一.據(jù)報道，ODC1的高表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)：Hogarty等［8］研究表明，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中敲低ODC1基因的表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖；此外多胺拮抗劑療法可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和進(jìn)展［9］；在一項60例子宮內(nèi)膜癌患者的隊列研究中使用定量實時聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）證實，ODC1表達(dá)升高可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌PFS（無進(jìn)展生存期）縮短［10］；ODC1可作為前列腺癌組織診斷的上皮特異性生物標(biāo)記物［11］，另有相關(guān)文獻(xiàn)報道［12］，ODC1可用于評估人類前列腺癌的侵襲性.本研究發(fā)現(xiàn)，ODC1在SCLC細(xì)胞系中多數(shù)高表達(dá)，下調(diào)ODC1后抑制SCLC細(xì)胞增殖，引發(fā)細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞的藥物敏感性.

Ye等［13］發(fā)現(xiàn)ODC1在人肝細(xì)胞癌（HCC）組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，體外降低ODC1的表達(dá)可抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，并且可通過調(diào)控AKT/GSK3β/β-catenin通路及其相關(guān)下游蛋白，逆轉(zhuǎn)腫瘤酸性微環(huán)境導(dǎo)致的不良影響；此外敲低ODC1也可通過降低HCC細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝而抑制腫瘤生長［14］.本研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)ODC1的表達(dá)后，人SCLC細(xì)胞H82、H69增殖能力和單細(xì)胞克隆能力明顯下降，說明ODC1高表達(dá)促進(jìn)了人SCLC細(xì)胞H82、H69的增殖，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展.ODC1過度表達(dá)可引起細(xì)胞內(nèi)腐胺水平升高，從而抑制甲基汞誘導(dǎo)的線粒體功能障礙相關(guān)性細(xì)胞凋亡［15］；ODC1可減弱巨噬細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)，并抑制ROS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的凋亡［16］，這使得ODC1成為潛在治療靶點.本研究中下調(diào)ODC1后，人SCLC細(xì)胞H82、H69凋亡明顯增加，又進(jìn)一步檢測了細(xì)胞凋亡的內(nèi)部線粒體介導(dǎo)的Caspase信號通路相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞抗凋亡蛋白BCL-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白BAX及Cytochrome C、cleaved-Caspase3、cleaved-PARP表達(dá)上調(diào)，說明下調(diào)ODC1可以依賴內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞H82、H69凋亡.本研究進(jìn)一步檢測了下調(diào)ODC1后人SCLC細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示H82實驗組細(xì)胞Cyclin B1表達(dá)上調(diào)，Cyclin A2表達(dá)下調(diào)，H69實驗組細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)上調(diào)，Cyclin E1表達(dá)下調(diào)，表明H82、H69細(xì)胞分別阻滯于G2/M期與G1期.另外，三陰性乳腺癌（TNBC）患者樣本中ODC1表達(dá)水平升高，使用ODC1抑制劑二氟甲基鳥氨酸（DFMO）治療可使TNBC對化療的敏感性增強(qiáng)，提示ODC1可能是TNBC患者的一種靶向治療敏感點［17］，本研究使用不同濃度順鉑處理對照組及實驗組細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)下調(diào)ODC1增強(qiáng)了SCLC細(xì)胞H82、H69對鉑類藥物的敏感性，表明靶向ODC1可能提高小細(xì)胞肺癌的化療效果.

ODC1是生物體內(nèi)多胺代謝過程中的關(guān)鍵酶，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多胺代謝異常密切相關(guān)，本研究內(nèi)容還需進(jìn)一步地深入探討，旨在為今后SCLC的診斷、預(yù)后及靶向治療提供新的研究思路和方向.

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（責(zé)任編輯：趙藏賞）