基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究紅景天苷治療新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的作用機(jī)制

陳茹佳,劉建霞,閔加威

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是指因圍產(chǎn)期新生兒腦部血流量減少、宮內(nèi)窘迫、臍帶繞頸等引起的腦組織缺氧缺血性損傷,主要表現(xiàn)有新生兒意識(shí)、肌張力改變及原始反射異常,可能引起新生兒死亡和智力低下、癲癇、腦癱等近遠(yuǎn)期后遺癥[1],給患兒家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。目前,臨床上治療HIBD的主要方法有糾正酸中毒、吸氧和亞低溫治療等[2],但這些方法并不能有效修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞,在改善患兒遠(yuǎn)期預(yù)后方面效果不顯著,故需要開發(fā)新的預(yù)防或協(xié)同治療手段。紅景天苷是中藥薔薇科草本植物紅景天的主要有效成分,本質(zhì)是苯丙烷類糖苷化合物(C14H20O7),安全性高且藥理作用廣泛。研究表明,紅景天苷通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等途徑發(fā)揮抗缺氧、抗氧化、抗炎癥、抗衰老、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[3-8],然而紅景天苷在新生兒HIBD中的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種系統(tǒng)性的醫(yī)藥研究新模式,能夠有效建立藥物活性成分與疾病作用靶點(diǎn)之間的內(nèi)在聯(lián)系[9],現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于探索單一成分或中醫(yī)藥制劑發(fā)揮藥效的途徑方式[10]。基于此,本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,探討紅景天苷治療HIBD的可能機(jī)制,解析關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路,并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證紅景天苷治療新生小鼠HIBD的實(shí)際效果,為臨床深入研究紅景天苷治療新生兒HIBD提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料及儀器

1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57BL/6小鼠購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[SCXK(鄂)2020-0018],飼養(yǎng)于中南民族大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,環(huán)境溫度18～22 ℃,相對(duì)濕度50%～60%,12 h循環(huán)照明,飼養(yǎng)密度為每10只小鼠0.09～0.63 m2。

2)藥物與試劑:紅景天苷購(gòu)自MCE公司;HE染液套裝(G1003)、Bax抗體(2772)、Bcl-2抗體(3498)、Cleaved-caspase-3抗體(9661)購(gòu)自Cell Signaling Technology(美國(guó))。

3)主要儀器:小動(dòng)物麻醉機(jī)(R500IE);全自動(dòng)常壓持續(xù)性缺氧(富氧)裝置(XBS-03);大小鼠抓力測(cè)定儀(YLS-13A);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(C280)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1)藥物靶點(diǎn)篩選:從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并下載紅景天苷2D結(jié)構(gòu)的SDF文件和SMILES結(jié)構(gòu)式。將SMILES結(jié)構(gòu)式輸入Similarity Ensemble Approach(SEA)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出藥物相關(guān)靶點(diǎn)。使用SDF文件搜索Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)和Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置種屬為“Homo sapiens”進(jìn)行靶點(diǎn)篩選。

2)疾病靶點(diǎn)篩選:使用DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)分別以“neonatal hypoxia ischemia brain damage”“neonatal hypoxia ischemia encephalopathy”“neonatal hypoxic ischemic encephalopthy”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,將獲得的相關(guān)靶點(diǎn)基因合并后刪除重復(fù)得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

3)“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)篩選:對(duì)所有收集到的靶點(diǎn)進(jìn)行Uniprot ID轉(zhuǎn)換,統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“Gene name”。將紅景天苷作用靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1在線軟件做圖工具平臺(tái),繪制韋恩圖,二者取交集后獲得紅景天苷-HIBD交集靶點(diǎn)。

4)潛在靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:將紅景天苷-HIBD共同靶點(diǎn)上傳STRING數(shù)據(jù)庫(kù),將生物種類設(shè)定為“Homo Sapiens”,最小互相作用閾值設(shè)定為0.4,隱藏不相連蛋白,其余設(shè)置為默認(rèn),構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件,通過(guò)“Network Analyzer”得出相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù),degree排序后,選取degree前10位基因作為核心靶點(diǎn)。

5)GO功能和KEGG通路富集分析:將紅景天苷-HIBD潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),利用GraphPad Prism軟件,分別從生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)層面進(jìn)行GO功能富集分析。同時(shí),將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),利用微生信在線工具,通過(guò)選取前20位通路形成KEGG通路富集分析條形圖,進(jìn)而找出紅景天苷-HIBD作用關(guān)鍵通路。

1.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1)模型制備:選取鼠齡10 d、平均體質(zhì)量5 g的小鼠,基于Rice Vannucci方法[11]建立HIBD模型。用4%異氟烷麻醉小鼠,固定并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈,縫合傷口后回籠恢復(fù)。2 h后,將小鼠置于37 ℃、含10%氧氣和90%氮?dú)獾暮銣厝毖跸渲腥毖? h。模型制備完成后,由尾部提起小鼠,當(dāng)觀察到小鼠頭部產(chǎn)生單側(cè)偏轉(zhuǎn)現(xiàn)象,判斷模型制備成功。

2)實(shí)驗(yàn)分組:將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=21)、缺氧缺血組(n=21)、安慰劑組(n=21)和紅景天苷組(n=21)。其中,假手術(shù)組僅進(jìn)行麻醉、在切開暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈后直接縫合傷口;缺氧缺血組完成整個(gè)模型制備過(guò)程;基于文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果[12-13]和實(shí)驗(yàn)室前期工作,造模后,紅景天苷組按100 mg/kg用二甲基亞砜(DMSO)稀釋紅景天苷后腹部注射給藥1次;安慰劑組不給藥,只腹部注射按100 mg/kg用DMSO稀釋的生理鹽水。

3)TTC染色:造模后24 h,將小鼠過(guò)量麻醉處死,剪刀斷頭,剖開頸部皮膚,剪開腦膜,去掉嗅球小腦,取出各實(shí)驗(yàn)組小鼠完整腦組織(n=6),冷凍切片,厚度1～2 mm。配制2%TTC染液,浸沒(méi)切片,37 ℃避光孵育10～15 min。孵育完成后,回收染液,滴加4%多聚甲醛至完全覆蓋切片,在4 ℃下固定過(guò)夜。使用掃描儀觀察攝片,使用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析梗死區(qū)域。

4)HE染色:造模后24 h,將小鼠過(guò)量麻醉處死,剪刀斷頭,剖開頸部皮膚,剪開腦膜,去掉嗅球小腦,取出各實(shí)驗(yàn)組小鼠完整腦組織(n=3),制備石蠟切片進(jìn)行HE染色。脫蠟后,使用蘇木素染液染色3～5 min,分化返藍(lán)后流水沖洗。梯度乙醇脫水后,使用伊紅染液染色5 min,再次脫水后用中性樹膠封片。染色結(jié)束后,細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)呈紅色。使用尼康DS-U3相機(jī)×20物鏡在頂葉皮層、海馬CA1區(qū)域采集圖像。

5)Western blot:造模后24 h,將小鼠過(guò)量麻醉處死,剪刀斷頭,剖開頸部皮膚,剪開腦膜,去掉嗅球小腦,收集各實(shí)驗(yàn)組小鼠腦損傷側(cè)腦組織(n=6),加入裂解液,獲取裂解液混合物。4 ℃下15 000 r/min離心15 min,獲得上清。將上清與5×loading buffer按4︰1混合煮沸,獲得所需樣品。采用雅酶快速配膠試劑盒配制電泳凝膠,跑電泳轉(zhuǎn)膜后,獲得目的條帶,并用一抗、二抗孵育。利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影,使用Quantity One 4.6.1軟件對(duì)獲取的蛋白印記進(jìn)行分析。

6)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)行為評(píng)估:在造模后21 d開展行為學(xué)測(cè)試,各實(shí)驗(yàn)組小鼠(n=6)按照順序完成Y迷宮實(shí)驗(yàn)[14-16]、拉力測(cè)試[17]和角落實(shí)驗(yàn)[18],不提前訓(xùn)練小鼠以便獲得客觀數(shù)據(jù)。a.Y迷宮實(shí)驗(yàn):Y迷宮由3個(gè)不透明手臂呈120°布置,測(cè)試時(shí)將小鼠放置于迷宮任意一臂末端,并允許其探索任意一個(gè)手臂,實(shí)驗(yàn)時(shí)間8 min。觀察小鼠進(jìn)入各臂順序,記錄總進(jìn)臂次數(shù)(小鼠4只腳均進(jìn)入迷宮臂記為1次)和自發(fā)交替次數(shù)(依次連續(xù)進(jìn)入全部3個(gè)手臂記為1次),計(jì)算自發(fā)交替行為概率。自發(fā)交替行為概率=自發(fā)交替次數(shù)/(總進(jìn)臂次數(shù)-2)×100%。b.拉力測(cè)試:實(shí)驗(yàn)采用YLS13A拉力系統(tǒng)測(cè)量小鼠腦損傷對(duì)側(cè)前肢力量,每只小鼠實(shí)驗(yàn)3次,取平均值進(jìn)行分析,以便評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)能力。c.角落實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)在2塊紙板形成的30°角落中開展,通過(guò)觀察小鼠的活動(dòng)軌跡,記錄小鼠在20次實(shí)驗(yàn)中右轉(zhuǎn)的次數(shù),以便評(píng)估小鼠記憶能力。右轉(zhuǎn)率=(右轉(zhuǎn)次數(shù)/20)×100%,以右側(cè)胡須接觸角落壁記為小鼠右轉(zhuǎn)。

7)腦萎縮量化:小鼠完成行為學(xué)測(cè)試后,取腦組織,采用高精度天平(精確值:0.000 1 g)分別對(duì)損傷對(duì)側(cè)和同側(cè)腦組織進(jìn)行稱重。腦組織損失百分比=損傷同側(cè)半腦重量/損傷對(duì)側(cè)半腦重量×100%[19]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以上所有實(shí)驗(yàn)每組至少進(jìn)行3次,操作人員嚴(yán)格遵守雙盲實(shí)驗(yàn)流程。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件處理數(shù)據(jù),采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析,使用Tukey/鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行2組以上分析。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)搜索結(jié)果

1)藥物靶點(diǎn)搜索結(jié)果:搜索Swiss Target Prediction、SEA和pharm Mapper數(shù)據(jù)庫(kù),共獲得靶點(diǎn)182個(gè),刪除重復(fù)項(xiàng),最終獲得有效藥物靶點(diǎn)176個(gè)。

2)疾病靶點(diǎn)搜索結(jié)果:搜索Gene Cards、OMIM和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù),共獲得靶點(diǎn)2 980個(gè),刪除重復(fù)項(xiàng),最終獲得有效疾病靶點(diǎn)2 173個(gè)。

2.2 交集靶點(diǎn)Venn圖

綜合藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)結(jié)果,利用Venny2.1繪制“藥物-疾病”靶點(diǎn)交集Venn圖(圖1),得到交集靶點(diǎn)61個(gè)。

圖1 紅景天苷治療缺氧缺血性腦損傷小鼠實(shí)驗(yàn)交集靶點(diǎn)Venn圖

2.3 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3. 9. 1軟件構(gòu)建潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò),刪除無(wú)相互作用的靶點(diǎn)后剩余有效靶點(diǎn)59個(gè),見(jiàn)圖2。通過(guò)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析篩選出前10位核心靶點(diǎn),構(gòu)建核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。分析顯示,Akt1、IL6、EGFR、HSP90AA1、ESR1、PPARG、SRC、FGF2、KDR、IL2可能為紅景天苷治療HIBD的重要靶點(diǎn)。

PPI為蛋白質(zhì)相互作用。

PPI為蛋白質(zhì)相互作用。

2.4 GO功能富集分析結(jié)果

GO功能富集結(jié)果前10個(gè)條目見(jiàn)圖4。BP主要富集到信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控;CC主要富集到細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞膜、胞外區(qū)域;MF主要富集到蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合。

圖4 紅景天苷治療缺氧缺血性腦損傷小鼠實(shí)驗(yàn)潛在靶點(diǎn)GO功能富集分析

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析顯著性居前20位的信號(hào)通路氣泡圖見(jiàn)圖5。KEGG通路富集分析結(jié)果表明,PI3K-Akt、Rap1、Estrogen等信號(hào)通路與紅景天苷-HIBD潛在靶點(diǎn)作用機(jī)制緊密聯(lián)系。

圖5 紅景天苷治療缺氧缺血性腦損傷小鼠實(shí)驗(yàn)潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.6 紅景天苷對(duì)新生小鼠HIBD誘導(dǎo)腦梗死體積的影響

TTC染色結(jié)果示:假手術(shù)組小鼠腦組織完整,未見(jiàn)腦梗死區(qū)域;缺氧缺血組和安慰劑組小鼠腦組織出現(xiàn)明顯白色梗死區(qū)域;紅景天苷組小鼠腦組織梗死區(qū)域相比缺氧缺血組和安慰劑組明顯減小。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析,結(jié)果見(jiàn)圖6。與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組腦梗死體積顯著縮小(P<0.01),提示紅景天苷治療可有效緩解HIBD誘導(dǎo)的腦梗死。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷;與紅景天苷組比較,①P<0.01。

2.7 紅景天苷對(duì)新生小鼠HIBD誘導(dǎo)的頂葉皮層神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元損傷的影響

HE染色結(jié)果見(jiàn)圖7,假手術(shù)組的頂葉皮層神經(jīng)元形態(tài)完整、排列整齊,層次清晰、形態(tài)及數(shù)量正常,染色均勻;海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊,可見(jiàn)清晰的海馬結(jié)構(gòu)形態(tài);缺氧缺血組和安慰劑組出現(xiàn)大量空泡,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)萎縮、分布紊亂、排列松散,細(xì)胞胞質(zhì)空泡化,細(xì)胞核固縮;紅景天苷組神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、排列得到明顯改善,空泡減少。結(jié)果顯示,紅景天苷治療逆轉(zhuǎn)了新生小鼠HIBD后腦損傷同側(cè)頂葉皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)損傷。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷。

2.8 紅景天苷可激活PI3K/Akt信號(hào)通路、減少新生小鼠HIBD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

Western blot結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)圖8。從蛋白條帶看(圖8a),紅景天苷組p-PI3K和p-Akt表達(dá)量相較缺氧缺血組和安慰劑組明顯增多,PI3K和Akt表達(dá)量明顯減少。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看(圖8b、8c),與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05、P<0.01),說(shuō)明紅景天苷促進(jìn)了PI3K和Akt的磷酸化,提升了磷酸化的PI3K和Akt占比,激活了PI3K/Akt信號(hào)通路。從蛋白條帶看,紅景天苷組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平較缺氧缺血組和安慰劑組均有升高;紅景天苷組促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平較假手術(shù)組變化不大,但缺氧缺血組和安慰劑組Bax表達(dá)水平相較假手術(shù)組明顯升高。為衡量Bcl-2和Bax表達(dá)的綜合作用,分析二者的相對(duì)含量(圖8d),紅景天苷組Bcl-2/Bax表達(dá)水平較假手術(shù)組、缺氧缺血組和安慰劑組均顯著升高(P<0.01),說(shuō)明紅景天苷治療使小鼠體內(nèi)抗凋亡蛋白相較促凋亡蛋白表達(dá)更有力。此外,從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看(圖8e),缺氧缺血組和安慰劑組促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表達(dá)水平相較假手術(shù)組升高明顯;紅景天苷組Cleaved-caspase-3表達(dá)水平相較假手術(shù)組升高不明顯。這些結(jié)果表明,紅景天苷可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路、減少新生小鼠HIBD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷;8a.Western blot檢測(cè)各組新生小鼠PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)圖;8b～8e.各蛋白表達(dá)水平的定量分析;與假手術(shù)組比較,①P<0.01;與紅景天苷組比較,②P<0.05,③P<0.01。

2.9 紅景天苷對(duì)新生小鼠HIBD誘導(dǎo)的長(zhǎng)期神經(jīng)功能和腦萎縮的影響

Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9a,與假手術(shù)組相比,缺氧缺血組和安慰劑組小鼠表現(xiàn)較低的自發(fā)交替率;而與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組自發(fā)交替成功的比率明顯提高(P<0.01)。拉力測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖9b,與假手術(shù)組相比,缺氧缺血組和安慰劑組損傷側(cè)對(duì)側(cè)前肢拉力明顯降低;而與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組小鼠損傷側(cè)對(duì)側(cè)前肢拉力顯著增強(qiáng)(P<0.01)。角落實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9c,與假手術(shù)組相比,缺氧缺血組和安慰劑組小鼠明顯更傾向于右轉(zhuǎn);而與缺氧缺血組相比,紅景天苷組小鼠右轉(zhuǎn)率明顯降低(P<0.01)。假手術(shù)組小鼠的腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完好,而缺氧缺血組和安慰劑組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的腦萎縮和腦組織丟失;紅景天苷治療后,腦萎縮情況得到改善。小鼠損傷同側(cè)和對(duì)側(cè)大腦半球的質(zhì)量比分析見(jiàn)圖9d,與缺氧缺血組和安慰劑組相比,假手術(shù)組右腦出現(xiàn)了腦組織缺損;與缺氧缺血組相比,紅景天苷組提高了損傷同側(cè)和對(duì)側(cè)半球的質(zhì)量比(P<0.01),改善了右腦的組織丟失情況。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷;9a～9c為使用Y迷宮實(shí)驗(yàn)、拉力測(cè)試、角落實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組新生小鼠的神經(jīng)功能;9d采用損傷同側(cè)與對(duì)側(cè)半球的腦重量比評(píng)估腦組織丟失程度;與假手術(shù)組比較,①P<0.01;與紅景天苷組比較,②P<0.01。

3 討論

新生兒HIBD多是由圍產(chǎn)期窒息所引發(fā)的新生兒腦損傷疾病,隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,HIBD的神經(jīng)保護(hù)策略、神經(jīng)康復(fù)技術(shù)及相關(guān)基礎(chǔ)研究均取得了較大進(jìn)步,但目前針對(duì)HIBD尚無(wú)確切有效的治療方法。既往研究表明,紅景天苷有多種豐富的藥理作用,已被證實(shí)其可通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮腦缺血性神經(jīng)損傷保護(hù)作用[20-23],但其對(duì)新生兒HIBD的保護(hù)機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。為明確紅景天苷對(duì)HIBD作用的相關(guān)分子機(jī)制,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索紅景天苷治療新生兒HIBD的可能機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明,紅景天苷作用于HIBD的核心靶點(diǎn)包括Akt1、EGFR和IL6等。GO功能和KEGG通路富集分析顯示,紅景天苷治療HIBD涉及多種生物過(guò)程和多個(gè)信號(hào)通路,主要在調(diào)控細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用,相關(guān)性較高的信號(hào)通路包括PI3K/Akt、Rap1和Estrogen等,其中PI3K/Akt通路富集基因較多,同時(shí)Akt1是PPI網(wǎng)絡(luò)中的顯著靶點(diǎn),提示紅景天苷可能通過(guò)PI3K/Akt通路治療HIBD。

研究表明,PI3K/Akt信號(hào)通路是參與調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡等功能的重要信號(hào)通路,可以通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路,發(fā)揮相關(guān)神經(jīng)保護(hù)作用[24-28]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,PI3K激活后可磷酸化細(xì)胞膜表面的二磷酸磷脂肌醇,形成三磷酸磷脂肌醇(PIP3),PIP3通過(guò)與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合,促使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜并引發(fā)構(gòu)象改變,進(jìn)而磷酸化Akt的蘇氨酸和絲氨酸位點(diǎn)使Akt完全活化[29]。Akt作為細(xì)胞凋亡的強(qiáng)效抑制因子,對(duì)細(xì)胞凋亡起著重要調(diào)控作用。Akt1是Akt的3種亞型之一,能夠介導(dǎo)調(diào)整新陳代謝、細(xì)胞存活和血管生成等諸多生物學(xué)過(guò)程[30-31]?；罨腁kt進(jìn)一步磷酸化Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3等下游蛋白,從而介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及細(xì)胞周期和糖代謝的調(diào)控[32]。在新生兒HIBD發(fā)病過(guò)程中,細(xì)胞凋亡起著重要作用[33]。Bcl-2是重要的細(xì)胞凋亡抑制基因,而Bax具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用,Cleaved-caspase-3是凋亡過(guò)程主要執(zhí)行者,在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[34-35]。紅景天苷通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡內(nèi)源性途徑發(fā)揮HIBD保護(hù)作用[36],它能夠借助上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2或下調(diào)促凋亡因子Bax表達(dá)[37],抑制Cytochrome C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放,進(jìn)而下調(diào)Cleaved-caspase-3表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號(hào)通路和相關(guān)蛋白在治療HIBD過(guò)程中起重要作用,LI等[38]和陽(yáng)梅等[39]也分別借助刺囊酸和芍藥內(nèi)酯苷做出了探索性工作。

本研究驗(yàn)證了紅景天苷在調(diào)節(jié)HIBD小鼠腦組織凋亡方面的作用,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,紅景天苷可上調(diào)HIBD新生小鼠腦組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的蛋白表達(dá),降低促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表達(dá),同時(shí)上調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),提升Bcl-2/Bax相對(duì)表達(dá)水平,使得小鼠體內(nèi)抗凋亡蛋白較促凋亡蛋白表達(dá)更明顯。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,紅景天苷治療可明顯減輕HIBD新生小鼠腦損傷程度,降低腦梗死率,顯著改善小鼠腦損傷,提高小鼠的記憶和運(yùn)動(dòng)能力,有助于小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能障礙和腦萎縮的長(zhǎng)期恢復(fù)。

綜上,紅景天苷通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制神經(jīng)元凋亡,進(jìn)而對(duì)新生小鼠HIBD提供神經(jīng)保護(hù)。本研究提示紅景天苷是治療新生兒HIBD的潛在化合物,為臨床藥物的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究遵照了科學(xué)可行的實(shí)驗(yàn)方案,并通過(guò)了中南民族大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(2024-scuec-050),符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：文章的全部作者聲明,在課題研究和文章撰寫過(guò)程中不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：1)閔加威負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)論文框架,負(fù)責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿;2)陳茹佳負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作,研究過(guò)程的實(shí)施,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖示繪制,起草并修改論文;3)劉建霞負(fù)責(zé)藥物和疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法,圖示和結(jié)果編寫和修改。