抗生素聯(lián)合宮腔灌注對(duì)反復(fù)種植失敗合并慢性子宮內(nèi)膜炎患者的作用及機(jī)制分析

劉榮娜,王 愷,包莉莉,魏蕊霞

目前對(duì)于反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure, RIF)仍然沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),臨床上常將接受3次及以上周期的胚胎移植,并且每次植入1或2枚的優(yōu)質(zhì)胚胎仍未獲臨床妊娠者稱為RIF,母體、胚胎因素以及二者相作用的微環(huán)境為RIF的主要原因[1]。慢性子宮內(nèi)膜炎(chronic endometritis, CE)癥狀不明顯,且在臨床中的發(fā)病率較低。但是越來越多的研究表明CE可以引起不孕,并導(dǎo)致胚胎移植失敗。目前CE的病因不明,多考慮是由細(xì)菌感染所致,盆腔炎、多次流產(chǎn)史等因素均可誘發(fā)該病,患者通常無典型臨床癥狀或癥狀輕微,易被忽略[2]。研究顯示,CE可促使子宮內(nèi)膜容受性降低進(jìn)而導(dǎo)致RIF,因此分析CE影響RIF的相關(guān)因素會(huì)對(duì)患者治療和預(yù)后有一定指導(dǎo)作用[3]。目前,臨床多針對(duì)CE患者進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性口服抗生素治療,可減輕患者炎癥反應(yīng),但因受藥物具體用量及患者實(shí)際情況的影響,易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,從而降低治療效果[4]。宮腔灌注作為一種對(duì)子宮局部沖洗治療的方式,通過在無菌條件下經(jīng)陰道向?qū)m腔內(nèi)部灌注藥物,使藥物能夠直接作用于子宮內(nèi)膜,發(fā)揮局部的抗炎作用,且對(duì)機(jī)體的損傷較小,臨床上常將其用于子宮內(nèi)膜炎、宮腔粘連等疾病的治療[5]。本研究旨在探討抗生素聯(lián)合宮腔灌注在RIF合并CE患者中的應(yīng)用及其作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1月—2022年5月于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受體外受精-胚胎移植助孕的160例RIF作為研究對(duì)象,根據(jù)是否合并CE分為CE組80例和非CE組80例。另將CE組依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為A組與B組,均為40例。A組年齡24～39(35.12±3.89)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)18～26(22.68±1.22)kg/m2。B組年齡25～38(34.57±4.21)歲;BMI 18～25(22.43±1.73)kg/m2。A組與B組上述一般資料經(jīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施(2021-KY-75),患者及家屬均自愿簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)及病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

診斷標(biāo)準(zhǔn):RIF參照《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專家共識(shí)》[6]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn):移植3次及以上或移植高評(píng)分卵裂期胚胎數(shù)4～6個(gè)或高評(píng)分囊胚數(shù)3個(gè)及以上均失敗;子宮內(nèi)膜經(jīng)CD138免疫組織化學(xué)染色,于400倍高倍鏡視野下發(fā)現(xiàn)典型漿細(xì)胞≥5個(gè),即診斷為CE[7]。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡<40歲;與上述診斷標(biāo)準(zhǔn)均相符合者;無精神障礙,可配合相關(guān)研究者;未合并惡性腫瘤者。排除標(biāo)準(zhǔn):年齡≥40歲;免疫功能障礙或患有強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫相關(guān)疾病者;經(jīng)檢查染色體異常者;合并其他對(duì)妊娠有嚴(yán)重影響疾病者;生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常者。

1.3 方法

1)免疫組織化學(xué)染色:所有患者于月經(jīng)干凈3～7 d在無同房史的狀態(tài)下行宮腔鏡檢查,術(shù)畢輕柔搔刮宮腔,所取內(nèi)膜組織標(biāo)本常規(guī)送病理科進(jìn)行CD138免疫組織化學(xué)染色。染色結(jié)果的判定由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師分別獨(dú)立對(duì)同一切片進(jìn)行閱讀,有分歧的切片由2位病理醫(yī)師對(duì)所獲取的結(jié)果進(jìn)行協(xié)商后確定。CD138染色后其特征為漿細(xì)胞膜顯示強(qiáng)陽性,而細(xì)胞質(zhì)顯示弱陽性,視野下可見到核圓但偏于細(xì)胞一側(cè),染色質(zhì)粗,沿核膜呈輻射狀排列。

2)治療:A組口服抗生素治療,甲硝唑片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H42021947,規(guī)格:0.2 g)0.4 g口服,2/d;左氧氟沙星片(山東齊都藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H20057913,規(guī)格:0.5 g)0.5 g口服,2/d。B組在此基礎(chǔ)上聯(lián)合宮腔灌注治療,患者保持膀胱截石位,以聚維酮碘進(jìn)行外陰消毒后,無菌狀態(tài)下使用人工授精管宮腔灌注10 mg地塞米松磷酸鈉注射液(重慶萊美藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H20080355,規(guī)格:10 mg)進(jìn)行治療,每3天灌注1次。2組均持續(xù)治療2周。

3)宮腔液的采集及檢測:在患者治療前、治療后的月經(jīng)干凈第3～5天采用生理鹽水擦凈陰道壁及宮頸口,用人工授精管輕輕插入宮腔內(nèi)緩慢注入生理鹽水3 mL,反復(fù)輕柔抽吸3次,收集宮腔沖洗液,然后放置于離心機(jī)進(jìn)行離心,離心轉(zhuǎn)速:3 000 r/min,離心時(shí)間:15 min,離心半徑:13.5 cm,離心結(jié)束后取上清液在-80 ℃環(huán)境保存,以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測宮腔液中白細(xì)胞介素-6(interleukin, IL-6)、IL-8、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平,具體操作步驟參考聯(lián)科生物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說明書。

4)子宮動(dòng)脈血流參數(shù)測評(píng):所有CE患者均于胚胎移植日(排卵后第3天或第5天)的前一天應(yīng)用GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀經(jīng)陰道超聲探頭檢測子宮動(dòng)脈參數(shù),包括搏動(dòng)指數(shù)、血流分支、子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)(endometrial-myometrial interface, EMI)低回聲區(qū)占肌層比例。

1.4 觀察指標(biāo)

1)統(tǒng)計(jì)并比較CE組與非CE組的基線資料,主要包括年齡、BMI、宮腔內(nèi)占位性病變情況、輸卵管積水、不孕年限、人工流產(chǎn)次數(shù)、是否患有子宮腺肌癥、繼發(fā)性不孕及宮腔鏡檢查異常(子宮內(nèi)膜增生樣改變、子宮內(nèi)膜炎性改變、宮腔粘連)情況。2)采用單因素及多因素Logistic回歸分析影響RIF患者CE的相關(guān)因素。3)A組、B組治療前后宮腔液炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α水平變化。4)比較A組、B組治療前后的子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)、血流分支、EMI低回聲區(qū)占肌層比例。5)比較A、B組生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎著床率、早期流產(chǎn)率,其中胚胎著床率=孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%,早期流產(chǎn)率=孕12周內(nèi)自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%;臨床妊娠主要是指患者移植術(shù)后35 d的超聲檢查結(jié)果顯示宮內(nèi)或?qū)m外有孕囊回聲,臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期例數(shù)×100%;生化妊娠主要是指患者移植術(shù)后14 d的血β-人絨毛膜促性腺激素高于正常水平,之后逐漸降低,并經(jīng)超聲檢查結(jié)果顯示宮內(nèi)或?qū)m外無孕囊回聲,生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/移植周期例數(shù)×100%。6)觀察患者治療過程中不良反應(yīng)發(fā)生情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CE組與非CE組基線資料

與非CE組比較,CE組年齡較大,宮腔內(nèi)占位性病變、輸卵管積水、子宮腺肌癥、人工流產(chǎn)次數(shù)≥2次、繼發(fā)性不孕、宮腔鏡檢查異常比例較高,不孕年限較長(P<0.05,P<0.01)。2組BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 CE組與非CE組RIF患者基線資料比較

2.2 RIF患者CE的相關(guān)影響因素

經(jīng)多因素Logistic分析顯示,年齡較大(≥33歲)、宮腔內(nèi)占位性病變、輸卵管積水、子宮腺肌癥、不孕年限較長(≥3.5年)、多次人工流產(chǎn)(≥2次)、繼發(fā)性不孕、宮腔鏡檢查異常均為RIF患者CE的相關(guān)影響因素(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 影響RIF患者CE的多因素Logistic回歸分析

2.3 A組與B組治療前后宮腔液中炎性因子水平變化

與治療前比較,治療后2組宮腔液中IL-6、IL-8、TNF-α水平均降低,其中B組低于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 A組與B組RIF合并CE患者治療前后宮腔液中炎性因子水平比較

2.4 A組與B組子宮動(dòng)脈血流參數(shù)變化

與治療前比較,治療后(在胚胎移植前一天進(jìn)行超聲檢測)2組子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)、EMI低回聲區(qū)占肌層比例均降低,且B組低于A組;治療后2組血流分支均增加,且B組多于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 A組與B組RIF合并CE患者治療前后子宮動(dòng)脈血流參數(shù)比較

2.5 A組與B組胚胎著床率、臨床妊娠率、生化妊娠率、早期流產(chǎn)率比較

A組總移植胚胎數(shù)為72個(gè),胚胎著床率為34.72%(25/72);B組總移植胚胎數(shù)為69個(gè),胚胎著床率為56.52%(39/69)。與A組比較,B組胚胎著床率、臨床妊娠率較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組生化妊娠率、早期流產(chǎn)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 A組與B組RIF合并CE患者臨床妊娠率、生化妊娠率、早期流產(chǎn)率比較[例(%)]

2.6 不良反應(yīng)比較

患者治療過程中均未出現(xiàn)不良反應(yīng)情況。

3 討論

RIF是目前輔助生殖技術(shù)中的一大難點(diǎn),有研究顯示其在不孕癥中的發(fā)生率為15%～20%[8-9]。有效的胚胎植入仍然是提高輔助生殖技術(shù)妊娠率的主要方法,特別是涉及體外受精-胚胎移植的妊娠率。胚胎植入是胚胎發(fā)育的一個(gè)復(fù)雜過程,涉及囊胚和子宮內(nèi)膜接受能力之間的時(shí)間協(xié)調(diào),研究表明許多RIF的發(fā)生與子宮內(nèi)膜形態(tài)、功能的異常有關(guān)。

CE是一種以子宮內(nèi)膜間質(zhì)異常漿細(xì)胞浸潤為特征的持續(xù)性輕微局部炎癥性疾病。通過高通量測序技術(shù)及常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)CE最常見的致病菌為糞腸球菌、腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、陰道加德納菌屬和支原體屬[10-11]。有研究表明,CE在不孕癥患者中的患病率約為39%[12],在RIF患者中可高達(dá)66%[13]。CE影響胚胎植入的主要機(jī)制在于對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的改變,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜微環(huán)境發(fā)生紊亂,免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)遭受破壞,進(jìn)而對(duì)胚胎植入造成影響[14]。有研究表明,隨著年齡增大,繼發(fā)性不孕比例有所增加,而且不孕年限越長,精卵結(jié)合障礙越嚴(yán)重,進(jìn)而胚胎著床失敗的風(fēng)險(xiǎn)也越高;宮腔內(nèi)占位性病變、人工流產(chǎn)次數(shù)較多,可對(duì)患者子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)形態(tài)產(chǎn)生影響,或可引發(fā)宮腔逆行感染,進(jìn)而破壞受精卵著床;子宮腺肌癥可造成子宮形態(tài)發(fā)生變化,進(jìn)而影響胚胎植入的整體質(zhì)量[15]。

目前,臨床上針對(duì)CE患者的治療多為抗生素經(jīng)驗(yàn)性用藥,常規(guī)給予甲硝唑、鹽酸多西環(huán)素等藥物口服后經(jīng)機(jī)體血液循環(huán)到達(dá)子宮內(nèi)膜的治療效果被大大削弱,臨床療效欠佳[16]。宮腔灌注作為一種局部給藥方式能夠改善患者子宮內(nèi)膜血流的異常狀態(tài),加快著床部位局部的血管生成及組織重構(gòu)進(jìn)程[17]。另外,借助沖洗的方式聯(lián)合灌洗液能使藥物與子宮內(nèi)膜充分接觸,提升藥物在子宮內(nèi)膜局部的有效濃度。子宮動(dòng)脈的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)可有效反映子宮內(nèi)膜血運(yùn)狀態(tài),與單獨(dú)應(yīng)用口服抗生素治療比較,聯(lián)合宮腔內(nèi)灌注能夠改善宮腔微環(huán)境使其適宜正常的胚胎著床,還可保持良好的子宮內(nèi)膜容受性,進(jìn)而提升患者的臨床妊娠率[18-19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),治療后B組子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)、EMI低回聲區(qū)占肌層比例均低于A組,血流分支多于A組,胚胎著床率、臨床妊娠率與A組比較均處于較高水平。表明抗生素聯(lián)合宮腔灌注治療可改善RIF合并CE患者的子宮內(nèi)膜容受性,提升臨床妊娠率與胚胎著床率,效果顯著。

由于CE被認(rèn)為是一種宮腔輕微炎癥反應(yīng),并且炎癥不會(huì)擴(kuò)散到全身,因此血液中炎性因子的表達(dá)差異并不明顯。然而,針對(duì)宮腔微生物群的炎癥反應(yīng)可以局部影響子宮內(nèi)膜微環(huán)境,局部炎癥會(huì)導(dǎo)致以產(chǎn)生促炎因子為主Th1細(xì)胞的過度表達(dá)。另有研究顯示,胚胎的種植過程主要受到子宮內(nèi)膜局部抗炎因子與促炎因子動(dòng)態(tài)平衡的影響,CE患者機(jī)體炎性細(xì)胞的持續(xù)性浸潤、滲出,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境發(fā)生改變,進(jìn)而對(duì)其接受胚胎的能力產(chǎn)生負(fù)面影響[20-21]。促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8等可損傷宮腔微環(huán)境進(jìn)而導(dǎo)致胚胎種植失敗或早期流產(chǎn);TNF-α是由淋巴細(xì)胞分泌的一種可溶性多肽細(xì)胞因子,而IL-6、IL-8是白細(xì)胞介素家族中的重要組成成員,當(dāng)機(jī)體處于感染狀態(tài)時(shí),這些細(xì)胞因子在患者體內(nèi)可呈現(xiàn)不同程度的高表達(dá),然后進(jìn)一步激活多形核白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞,同時(shí)釋放大量的自由基、蛋白酶等,加速花生四烯酸代謝,釋放血栓素、前列腺素、白三烯和一氧化氮等炎性介質(zhì),形成瀑布效應(yīng),導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生過度炎癥反應(yīng)。IL-6、IL-8等可對(duì)調(diào)控正常妊娠的內(nèi)分泌-細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)造成不良影響,胚胎植入過程中IL-6、IL-8可參與子宮內(nèi)膜局部血管生成、滋養(yǎng)層分化、胎盤發(fā)育等,促使不利于妊娠維持的免疫功能增強(qiáng),進(jìn)而導(dǎo)致不良的臨床妊娠結(jié)局[22]。因涉及醫(yī)學(xué)倫理問題,本研究未對(duì)RIF中無CE患者進(jìn)行宮腔液提取及檢測,但本研究結(jié)果顯示,治療后A、B組宮腔液中的炎性因子表達(dá)水平均降低,說明CE可能通過增加炎性因子的分泌調(diào)控子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境。

地塞米松作為一種糖皮質(zhì)激素,能對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬抗原的過程起到屏障作用,減少溶酶體酶的釋放;地塞米松還可以抑制自身抗體及各項(xiàng)促炎因子的產(chǎn)生與聚集,避免因炎癥反應(yīng)激活子宮內(nèi)膜局部免疫應(yīng)答進(jìn)程;地塞米松可調(diào)控子宮內(nèi)膜自然殺傷細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄過程,改善外周血Th1/Th2比例的失衡狀態(tài),糾正紊亂的子宮形態(tài)結(jié)構(gòu),緩解機(jī)體的炎癥反應(yīng)[23]。此外,有研究還顯示,應(yīng)用宮腔灌注治療并不會(huì)對(duì)宮腔造成損傷,降低患者胚胎種植率,是一項(xiàng)行之有效且安全的治療方式[24-25]。通過對(duì)本研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),抗生素聯(lián)合宮腔灌注治療可減輕RIF合并CE患者子宮內(nèi)膜局部的炎癥反應(yīng),改善生殖助孕結(jié)局。

本研究發(fā)現(xiàn),年齡偏大、宮腔內(nèi)占位性病變、輸卵管積水、子宮腺肌癥、不孕年限較長、多次人工流產(chǎn)、繼發(fā)性不孕、宮腔鏡檢查異?？赡芤餋E進(jìn)而導(dǎo)致RIF,臨床上口服抗生素聯(lián)合宮腔灌注地塞米松治療RIF合并CE可有效減輕子宮內(nèi)膜局部的炎癥反應(yīng),改善患者的子宮內(nèi)膜容受性,提升胚胎著床率及臨床妊娠率。因胚胎植入是受多因素影響的復(fù)雜過程,臨床上可進(jìn)行大樣本量、多中心的研究,以指導(dǎo)RIF合并CE患者的綜合干預(yù),達(dá)到改善預(yù)后及臨床妊娠結(jié)局的目的。