細(xì)胞焦亡在糖尿病創(chuàng)面愈合中的研究進(jìn)展

竺仕林，葛星月，楊雅量，李文武，姚明哲，唐乾利

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院/廣西高校桂西地區(qū)高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色533000）

糖尿病患者損傷后創(chuàng)面愈合延緩或終年難愈，是糖尿病比較嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致殘的重要原因之一，嚴(yán)重威脅著患者的健康。糖尿病創(chuàng)面難以愈合的機(jī)制之一是過度的炎癥反應(yīng)，而此與細(xì)胞焦亡過程有關(guān)。細(xì)胞焦亡是一種以Gasdermin 為關(guān)鍵介導(dǎo)因子的程序性細(xì)胞死亡過程［1］，是機(jī)體很重要的一種非特異性免疫機(jī)制，其能夠在感知外源性病原體的同時識別內(nèi)源性危險信號，并拮抗這些危險因素。焦亡的特征是Gasdermin 家族蛋白介導(dǎo)的孔形成、細(xì)胞裂解和促炎細(xì)胞因子的釋放。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞焦亡時，細(xì)胞膜上會出現(xiàn)1～2 nm 的小孔，并伴隨細(xì)胞腫脹，胞內(nèi)物質(zhì)（如炎癥因子、炎癥小體復(fù)合物等）經(jīng)由小孔流出，隨后細(xì)胞膜裂解，染色質(zhì)降解，細(xì)胞死亡，進(jìn)而誘發(fā)級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)。近年來，許多研究者將細(xì)胞焦亡通路作為糖尿病創(chuàng)面治療中的重要關(guān)注對象，通過拮抗細(xì)胞焦亡以達(dá)到促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的效果。本研究對近兩年來細(xì)胞焦亡在糖尿病創(chuàng)面愈合中作用的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，討論糖尿病創(chuàng)面中靶向細(xì)胞焦亡的分子與通路，以期為臨床治療糖尿病創(chuàng)面提供新的思路和突破口。

1 細(xì)胞焦亡的起源和發(fā)展

1989 年，Black 等［2-4］首次發(fā)現(xiàn)了一種能夠特異性切割白介素1β（IL-1β）前體上特定位點(diǎn)并將其轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霫L-1β 的蛋白酶。起初研究者將其稱為白細(xì) 胞 介 素-1 轉(zhuǎn) 化 酶（interleukin-1 converting enzyme， ICE），隨后這種特異性蛋白酶被命名為半胱天 冬 酶-1（Caspase-1）［5，6］。1992 年，Zychlinsky 等［7］發(fā)現(xiàn)志賀菌能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的“凋亡”，并且這種細(xì)胞的“凋亡”與Caspase-1 有著密不可分的聯(lián)系。2001 年，D'Souza 等［8］認(rèn)為這種新發(fā)現(xiàn)的“凋亡”與之前所認(rèn)識的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死均有所不同，其特征是在細(xì)胞質(zhì)膜中形成孔，細(xì)胞腫脹和破裂以及細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)容物滲漏，是溶解性和炎性細(xì)胞死亡的一種形式，于是將這種炎癥程序細(xì)胞死亡定義為“細(xì)胞 焦 亡”（pyroptosis）。2015 年，2 篇 發(fā) 表 于Nature的文章認(rèn)為Gasdermin D 被炎性Caspase 裂解然后產(chǎn)生的一個小分子結(jié)構(gòu)能夠使細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡［9，10］。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)焦亡在宿主防御細(xì)胞內(nèi)病原體感染和各種非感染性疾病中起著重要作用，可發(fā)生于不同類型的細(xì)胞中。此后，關(guān)于細(xì)胞焦亡的研究進(jìn)入了高速發(fā)展時期，細(xì)胞焦亡成為了免疫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

2 細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白分子

2.1 Caspase 家族

最初，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ICE 和線蟲細(xì)胞凋亡基因編碼 的cell death mutant 3（CED-3）具 有 相 同 的 起源［11］，于是將其命名為CED-3/ICE 家族蛋白，但隨后又發(fā)現(xiàn)了一系列的同源蛋白，遂將其統(tǒng)一命名為Caspase1～10［12］，其中“c”意味著它們擁有半胱氨酸（cysteine）蛋白酶的催化功能，“aspase”指它們可以作用于天冬氨酸殘基，這也是這類蛋白酶特有的作用機(jī)制。之后，研究者們又發(fā)現(xiàn)了鼠源Caspase11和Caspase12，牛 源Caspase13，人 源Caspase14。Caspase 家族蛋白在哺乳動物細(xì)胞的凋亡和焦亡中起著不可或缺的作用。在細(xì)胞凋亡中，一部分Caspase 如Caspase-8/9/10 可以識別來自細(xì)胞內(nèi)外的危險信號進(jìn)而激活另一部分Caspase 如Caspase-3/6/7，隨后切割和激活下游因子引發(fā)細(xì)胞凋亡［13］。而在細(xì)胞焦亡中起重要作用的Caspase 被稱為炎性Caspase，包括Caspase-1/4/5/11/12/13/14［14］，其中導(dǎo)致細(xì)胞焦亡發(fā)生最關(guān)鍵的因子是Caspase-1 和Caspase-4/5/11［15］。Caspase 家族見圖1。

圖1 Caspase 家族Fig 1 Caspase family

2.2 Gasdermin 家族

Gasdermin 的名字來源于僅在小鼠的胃腸道（局限于食道和胃）和皮膚上皮細(xì)胞中低水平表達(dá)的基因Gsdma1［16］。其中，在人體各器官中進(jìn)行表達(dá) 的Gasdermin 家 族 成 員 有GSDMA，GSDMB，GSDMC， GSDMD， GSDME（DFNA5）和PJVK（DFNB59），而在小鼠各器官中進(jìn)行表達(dá)的Gasdermin 家 族 成 員 有Gsdma1，Gsdma2，Gsdma3， Gsdmc1， Gsdmc2， Gsdmc3， Gsdmc4，Gsdmd［17］。其中PJVK 只含有一個N 端結(jié)構(gòu)域，其余成員則含有2 個結(jié)構(gòu)域分別為N 端結(jié)構(gòu)域和C 端結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域在生理狀態(tài)下相互結(jié)合抑制。其中N 端結(jié)構(gòu)域的大量表達(dá)可以產(chǎn)生細(xì)胞膜的破孔作用導(dǎo)致細(xì)胞焦亡［18］。被關(guān)注最多的是，GSDMD 能被活化的Caspase-1/4/5/11 切斷結(jié)構(gòu)域連接點(diǎn)而產(chǎn)生上述2個結(jié)構(gòu)域［9］，其中N 端可以和多種細(xì)胞膜上的脂類物質(zhì)結(jié)合形成寡聚體，然后形成孔洞，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜［18］。有報道指出，GSDME 的2 個結(jié)構(gòu)域之間包含一個可以被人為切割的位點(diǎn)，研究者發(fā)現(xiàn)可以利用Caspase-3 切割該位點(diǎn)產(chǎn)生活化的N 端結(jié)構(gòu)域從而人為誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生［19］。

3 細(xì)胞焦亡分子機(jī)制通路

3.1 炎癥小體激活的焦亡

3.1.1 炎癥小體 炎癥小體是多蛋白復(fù)合物，在感知病原體相關(guān)分子模式 （PAMP）或危險相關(guān)分子模式（DAMP）后聚集在細(xì)胞質(zhì)中，炎癥小體的激活是 焦 亡 的 起 點(diǎn)［20］。2002 年，Martinon 等［21］提 出 了“炎癥小體”的概念，認(rèn)為這個由納赫特（domain present in neuronal apoptosis inhibitory protein（NAIP）， CIITA， HET-E， TP1， NACHT）家族成員NALP1、含有CARD 的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD， ASC）和Caspase-1 組成的蛋白復(fù)合物介導(dǎo)了Caspase-1 的激活和IL-1β 的成熟，并類比細(xì)胞色素-c（Cytochrome-c），凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）和Caspase-9 形成的凋亡小體將其命名為炎癥小體。炎癥小體中的模式識別受體（PRRs）主要包含：NLRP1， NLRP3， NLRP6， NLRP7， NLRC4， NLRC5和PYRIN（pyrin and HIN domaintein）以 及AIM2（absent in melanoma 2）等［22］。

3.1.2 經(jīng)典炎癥小體信號通路 胞質(zhì)中存在的模式識別受體如NLRP3 等可以識別外源微生物相關(guān)的保守分子（PAMPs）或損傷相關(guān)的內(nèi)源信號（DAMPs），隨后活化并寡聚，接著結(jié)合接頭蛋白ASC 和Caspase-1 組裝形成炎癥小體，然后Caspase-1 會切割GSDMD，加工一些炎癥因子如pro-IL-1β 和pro-IL-18。GSDMD 被 切 割 后 產(chǎn) 生 的N 端結(jié)構(gòu)域會將細(xì)胞膜破孔透化形成GSDMD 孔，同時促進(jìn)成熟的IL-1β 和IL-18 的釋放，之后細(xì)胞逐漸裂解，引發(fā)細(xì)胞焦亡。在細(xì)胞膜沒有完全裂解之前，GSDMD 孔還可以釋放許多大分子物質(zhì)或結(jié)合物比如白細(xì)胞介素1α（IL-1α），危險分子如高遷移率族蛋白-1（HMGB-1），甚至整個炎癥小體復(fù)合物［23，24］。

3.1.3 非經(jīng)典炎癥小體信號通路 Caspase-4/5/11可以直接識別來自革蘭陰性菌的脂多糖（LPS）隨后活化并寡聚，其切割GSDMD 產(chǎn)生的N 端結(jié)構(gòu)域有細(xì)胞膜破孔性并允許鉀離子的釋放，在此期間一些特定的炎癥小體如NLRP3 也能因此活化進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的成熟。同時，GSDMD 孔使得細(xì)胞膜裂解導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，許多細(xì)胞因子得以釋放［24］。

3.2 非炎癥小體激活的焦亡

在生理狀態(tài)下，GSDMD 的2 個結(jié)構(gòu)域能夠互相抑制而不表現(xiàn)出生物學(xué)作用，但是被激活的Caspase-1/4/5/11 可以特異性識別其結(jié)合位點(diǎn)并破壞從而獲得具有細(xì)胞膜破孔性的N 端結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞焦亡。研究者發(fā)現(xiàn)，將GSDMD 的切割位點(diǎn)改為Caspase-3 識別序列，可以使得原本正在進(jìn)行的Caspase-3 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榻雇?，說明N 端結(jié)構(gòu)域本身就可以引發(fā)細(xì)胞焦亡［9］。此外，GSDMD的同族蛋白GSDME 及其切割產(chǎn)生的N 端結(jié)構(gòu)域也具有這樣的生物學(xué)特點(diǎn)［19］。

3.3 Gasdermin D-N 端結(jié)構(gòu)域的負(fù)反饋調(diào)控作用

最新的研究表明，GSDMD 的N 端結(jié)構(gòu)域可以直接靶向作用并抑制Caspase-1/11 從而緩和炎癥小體的激活以抑制焦亡下游環(huán)節(jié)的觸發(fā)。研究者確認(rèn)了GSDMD 的N 端結(jié)構(gòu)域的β1-β2 環(huán)中的RFWK模體為關(guān)鍵分子結(jié)構(gòu)，并設(shè)計了一種類似分子表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗炎作用［25］。

4 糖尿病創(chuàng)面中靶向細(xì)胞焦亡的分子與通路

4.1 間隙連接蛋白（Cx43）/活性氧（ROS）信號通路

研究表明，活性氧在NLPR3 炎癥小體的激活過程中起著非常重要的作用［26］，大量的活性氧可誘導(dǎo)硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并結(jié)合NLRP3 蛋白從而激活NLRP3炎癥小體［27］促進(jìn)細(xì)胞焦亡。而活性氧是少數(shù)幾種可以通過由血管間隙連接通訊的主要連接蛋白Cx43［28］組 成 的Cx43 通 道 來 傳 遞 信 號 的 分 子 之一［29］。近年來，生物活性玻璃在軟組織，尤其是創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的前景［30］。有研究團(tuán)隊結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生物活性玻璃（bioactive glass，BG）可以通過下調(diào)Cx43/ROS 信號通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞焦亡來促進(jìn)創(chuàng)面愈合。生物玻璃與創(chuàng)面體液接觸后，通過離子交換在創(chuàng)面形成碳酸羥基磷灰石（hydroxy-carbonate-apatite，HCA）結(jié)構(gòu)，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上Cx43 蛋白以降低ROS 活性水平，從而抑制NLRP3 炎癥小體對caspase-1 的激活，減弱GSDMD 的破孔活性，最終抑制內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡，促進(jìn)血管的形成加速創(chuàng)面愈合［28］。而活性氧在作為NLPR3 的“觸發(fā)器”的同時，也大量產(chǎn)生于炎癥反應(yīng)后期免疫細(xì)胞激活和浸潤的過程中，是NLPR3 的“效 應(yīng) 器”［26］。抑 制 活 性 氧 的 生 成 不 僅 可 以減少其對細(xì)胞的直接損傷，更可以借此抑制細(xì)胞焦亡，減少持續(xù)炎癥對機(jī)體的損害，促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)。糖尿病患者皮膚受損后氧化應(yīng)激加強(qiáng)，成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為改變，修復(fù)細(xì)胞功能改變，創(chuàng)面修復(fù)困難［31］，以活性氧作為糖尿病難愈合創(chuàng)面的治療靶點(diǎn)，應(yīng)可取到較好療效。

4.2 中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellulartraps， NETs）

被激活的中性粒細(xì)胞會將DNA、組蛋白和顆粒酶（如中性粒細(xì)胞彈性酶）等釋放到胞外組成一種纖維性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被稱為中性粒細(xì)胞胞外 陷 阱（neutrophil extracellular traps， NETs）［32］。過度的NET 會延緩糖尿病患者的傷口愈合［33］，有團(tuán)隊通過體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)糖尿病創(chuàng)面愈合小鼠模型（寬型、NLRP3-/-、Casp-1-/-和GSDMD-/-小鼠）證明了NLRP3 /Caspase-1/ GSDMD 通路可激活糖尿病創(chuàng)面組織中性粒細(xì)胞的釋放，從而導(dǎo)致NET 的形成，而GSDMD基因缺失可避免NET 的形成［34］。同時發(fā)現(xiàn)可以直接共價修飾Cys191 的雙硫侖能通過抑制GSDMD 孔的產(chǎn)生來減少NET 的形成從而促進(jìn)NETs 介導(dǎo)的糖尿病足潰瘍的愈合［35］。該團(tuán)隊將著眼點(diǎn)放于細(xì)胞焦亡下游的通路和因子，提供了一種新的研究思路。

4.3 毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體（HF-MSC-Exo）

近些年來，外泌體成為了再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［36］，有研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA H19 在毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體（HF-MSC-Exo）中高表達(dá)，且HF-MSCs-Exo 可促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HF-MSCs-Exo 可以抑制Caspase-1 的激活和GSDMD 的裂解從而抑制細(xì)胞焦亡來促進(jìn)糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面的愈合過程［37］。該研究確定了HF-MSCs-Exo 在NLRP3 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號通路中的作用，但其作用的具體環(huán)節(jié)和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，考慮到攜帶lncRNA 的外泌體在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的巨大潛力，筆者認(rèn)為其將來或可成為糖尿病難愈合創(chuàng)面的一大重要治療方法，值得深入探索和研究。

4.4 穿孔素-2（P-2）和AIM2 炎癥小體

有研究報道駐留在糖尿病足部潰瘍（DFUs）表皮內(nèi)的金黃色葡萄球菌會觸發(fā)AIM2 炎癥小體的激活并誘導(dǎo)焦亡，而穿孔素-2 可以顯著抑制金黃色葡萄球菌在DFUs 的表皮細(xì)胞內(nèi)積聚［38］，但與此同時，金黃色葡萄球菌也能抑制人類皮膚中的P-2［39］。該團(tuán)隊指出，若在DFUs 組織中P-2 被抑制并且有金黃色葡萄球菌的積聚，即使沒有臨床感染跡象，也可以認(rèn)為患者具有較高的感染和進(jìn)一步并發(fā)癥的風(fēng)險［38］。該團(tuán)隊將著眼點(diǎn)放于金黃色葡萄球菌對細(xì)胞焦亡的誘導(dǎo)作用及其共同產(chǎn)生的延長糖尿病創(chuàng)面愈合的生物學(xué)效應(yīng)，證明了以抑制細(xì)胞焦亡為目的而靶向于細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌對治療糖尿病難愈合創(chuàng)面有著積極的意義。

4.5 NLRP3 炎性小體的調(diào)控

許多研究表明，通過調(diào)控NLRP3 炎癥小體的激活可以有效控制糖尿病創(chuàng)面修復(fù)過程中細(xì)胞焦亡的發(fā)生。復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院劉堅軍團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，去泛素化酶USP30 可以通過去泛素化NLRP3 來激活NLRP3 炎癥小體，而使用USP30 抑制劑MF-094 治療可以導(dǎo)致NLRP3 及其下游的Caspase-1 蛋白水平下降從而促進(jìn)糖尿病大鼠傷口愈合［40］。同時，也有研究者發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA 依賴性蛋白激酶（PKR）和NALP3 在高糖+LPS 刺激的巨噬細(xì)胞以及糖尿病創(chuàng)面中均表達(dá)上調(diào)，使用PKR 特異性抑制劑C16 抑制PKR 可以減少巨噬細(xì)胞和糖尿病創(chuàng)面中NALP3、Caspase-1、IL-1β 的表達(dá)，加速糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的過程［41］。該研究明確了PKR-NLRP3 鏈在糖尿病創(chuàng)面細(xì)胞焦亡過程中的生理重要性。此外，一些中藥成分也被發(fā)現(xiàn)可以參與調(diào)控NLRP3 炎癥小體。在糖尿病小鼠創(chuàng)口愈合早期，染料木素可使NLRP3 炎癥小體恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，并改善炎癥（TNFα、iNOS、COX2 和NFκB）和抗氧化防御系統(tǒng)（Nrf2、HO-1、GPx 和過氧化氫酶）［42］。薰衣草精油可以通過抑制巨噬細(xì)胞的焦亡來減少炎癥因子的產(chǎn)生，改善炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)包括LPS 誘導(dǎo)的糖尿病創(chuàng)面在內(nèi)的慢性創(chuàng)面的愈合［43］。芍藥苷可通過抑制趨化因子受體CXCR2 有效抑制NLRP3 炎癥小體的表達(dá)水平，控制炎癥，促進(jìn)DFUs 大鼠的創(chuàng)面愈合［44］。

5 討論

近年來，許多研究表明細(xì)胞焦亡在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，通過抑制細(xì)胞焦亡可以有效預(yù)防和治療糖尿病的并發(fā)癥。在糖尿病的狀態(tài)下，累計的晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）通過產(chǎn)生ROS 促進(jìn)NLRP3 炎癥小體持續(xù)激活可導(dǎo)致角膜傷口愈合延遲和神經(jīng)再生受損，從遺傳學(xué)和藥理學(xué)上阻斷AGEs/ROS/ NLRP3 軸可以顯著促進(jìn)糖尿病角膜傷口愈合和神經(jīng)再生［45］。而H3 松弛素可以通過抑制P2X7 受體（P2X7R）介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活來緩解高血糖引起的視網(wǎng)膜病變［46］。但是在糖尿病創(chuàng)面愈合方向上細(xì)胞焦亡的研究才剛剛起步。許多研究通過檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)因子的表達(dá)水平變化，來探索某因素對細(xì)胞焦亡的影響，但其具體作用的靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制很少有進(jìn)一步研究。遂筆者收集近年來在該領(lǐng)域的研究成果進(jìn)行綜述，對糖尿病創(chuàng)面中靶向細(xì)胞焦亡的分子通路作用機(jī)制進(jìn)行論述，期望對糖尿病難愈合創(chuàng)面的臨床治療和糖尿病創(chuàng)面中細(xì)胞焦亡的機(jī)制研究提供新的思路與方向。希望各位研究者能進(jìn)一步探索這些已明確的治療藥物或方式對細(xì)胞焦亡的精準(zhǔn)作用位點(diǎn)，以尋找更為直接、快速、有效的治療方案，早日攻克糖尿病慢性難愈合創(chuàng)面這一大臨床難題。

作者貢獻(xiàn)度說明：

竺仕林：選題、檢索整理文獻(xiàn)、起草論文、修訂論文；葛星月：選題、提供項(xiàng)目基金支持；楊雅量：整理文獻(xiàn)、修訂論文；李文武：整理文獻(xiàn)、修訂論文；姚明哲：選題、修訂論文；唐乾利：選題、修訂論文、終審論文、提供項(xiàng)目基金支持、指導(dǎo)性支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。