肝細(xì)胞癌干性分型及其預(yù)后基因GSDMC 的研究

包 凌，龔旋坤，龐 青，陳 曉

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，安徽 蚌埠 233000）

肝 細(xì) 胞 性 肝 癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤。肝細(xì)胞癌的相對(duì) 5 年生存率約為 18%［1］。目前已知肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素有慢性乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、黃曲霉素、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎和各種代謝性疾病［2］。不幸的是，由于腫瘤異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)微環(huán)境，患者對(duì)抗癌治療反應(yīng)較差［3-5］。

最近的證據(jù)表明，腫瘤異質(zhì)性是由具有干細(xì)胞或干細(xì)胞特征的細(xì)胞亞群驅(qū)動(dòng)的，稱為癌癥干細(xì)胞（cancer stem cells， CSCs）［6，7］。癌 癥 干 細(xì) 胞 也 稱 為腫瘤起始細(xì)胞，具有通過(guò)自動(dòng)修復(fù)進(jìn)行自我更新的能力。肝細(xì)胞與干細(xì)胞具有相似的特征，如在特定條件下自我更新和無(wú)限增殖［8-10］。重要的是，癌癥干細(xì)胞在肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)，復(fù)發(fā)和耐藥性中起著至關(guān)重要的作用［11］。此外，廣泛的研究表明，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment， TME）在促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲性和干性方面具有重要作用［12-14］。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞存在的周圍微環(huán)境，包括周圍的血管、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓源性炎性細(xì)胞、各種信號(hào)分子和細(xì)胞外基質(zhì)。CSCs 可以通過(guò)TME調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)非CSC 轉(zhuǎn)化為CSC，這一過(guò)程進(jìn)一步導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良［15］。此外，CSC的內(nèi)在信號(hào)可以重塑TME，導(dǎo)致血管生成，膠原蛋白重塑和PD-1 / PD-L1 介導(dǎo)的免疫逃逸［16］。因此，全面了解高度異質(zhì)的CSC 及其與TME 的動(dòng)態(tài)相互作用對(duì)于探索CSC 靶向治療策略和提高當(dāng)前免疫療法的有效性至關(guān)重要。

在這項(xiàng)研究中，利用ssGSEA 算法和26 個(gè)公共干性基因集來(lái)全面了解HCC 的干性景觀。通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類確定了兩種干性亞型。隨后采用加權(quán)基因 共 表 達(dá) 網(wǎng) 絡(luò) 分 析 （weighted correlation network analysis，WGCNA）來(lái)鑒定與干性亞型和預(yù)后相關(guān)的基因。基于Cox 回歸和隨機(jī)森林生存分析，構(gòu)建了一個(gè)干性風(fēng)險(xiǎn)模型。此外，研究干性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與預(yù)后、TME 模式以及化療和免疫治療對(duì)肝細(xì)胞癌的療效之間的相關(guān)性?？傮w而言，研究結(jié)果表明，干性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以有效預(yù)測(cè)HCC 患者預(yù)后和免疫治療反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 HCC 細(xì)胞系（Huh-7、SUN-449 和SMMC-7721）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，永生化正常肝細(xì)胞系LO2 購(gòu)自上海通培生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 臨床樣本收集于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科2019 年1 月～2021 年12 月手術(shù)切除的所需樣本組織。細(xì)胞組織快速裂解液和蛋白酶抑制劑購(gòu)自雅酶生物技術(shù)公司，BCA 蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒、1%青霉素-鏈霉素購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，兔多克隆抗體GSDMC 和抗兔IgG 抗體購(gòu)自Proteintech 公 司，Dulbecco 的 改 良Eale 培 養(yǎng) 基、PMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司，10%胎牛血清購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，Trizol 購(gòu)自上海賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，cDNA 試劑盒購(gòu)自維諾贊科技有限公司。該研究已獲得倫理學(xué)的批準(zhǔn)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院委員會(huì)（2023YJS12 0），并獲得了所有患者的個(gè)體同意。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備和預(yù)處理 從TCGA（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）獲 得 了HCC 樣 本 數(shù) 據(jù)集，TCGA 是一個(gè)公開(kāi)可用的數(shù)據(jù)庫(kù)，可提供33 種癌癥類型的匹配正常樣本［17］。數(shù)據(jù)集包括HCC 樣本的臨床注釋和生存時(shí)間。

1.2.2 HCC 干性亞型的共識(shí)聚類 為了鑒定HCC中的干性亞型，采用了StemChecker，這是一種基于網(wǎng)絡(luò)的工具，用于探索基因集中的干性特征［18］。使用StemChecker 檢索了26 個(gè)干性基因集，并對(duì)其進(jìn)行了預(yù)處理以進(jìn)行后續(xù)分析。使用基因集變異分析GSVAR 包［19］進(jìn)行單樣本基因集富集分析，定量評(píng)估每個(gè)HCC 樣本中26 個(gè)基因集的干性富集評(píng)分。利用K-means 聚類方法進(jìn)行1 000 次迭代，然后使用ConsensusClusterPlus R 包執(zhí)行無(wú)監(jiān)督共識(shí)聚類，以確?？煽啃?。

1.2.3 TME 細(xì)胞組成和ESTIMATE 評(píng)分 采用CIBERSORT 用于 根據(jù)基因表 達(dá)譜［20］表征復(fù)雜組織中的細(xì)胞組成，以計(jì)算HCC 樣品中22 個(gè)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)。此外，使用“estimate”R 包［21］評(píng)估了每個(gè)HCC 樣本的免疫和基質(zhì)評(píng)分。

1.2.4 化療敏感性和免疫治療反應(yīng) 為了預(yù)測(cè)臨床化療反應(yīng)，使用“pRRophetic”R 包，它可以預(yù)測(cè)基線腫瘤基因表達(dá)的反應(yīng)［22］。通過(guò) “pRRophetic”R 包計(jì)算半抑制濃度 （half maximal inhibitory concentration， IC50）來(lái)評(píng)估幾種藥物（吉西他濱、多柔比星、博來(lái)霉素、依托泊苷和米多龍林）的敏感性。為了評(píng)估免疫治療反應(yīng)，采用TIDE，這是http：//tide.dfci.harvard.edu/提供的在線工具，可根據(jù)基因表達(dá)預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)。

1.2.5 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 選擇方差最高的前3 000 個(gè)基因，使用“WGCNA”R 包構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)［23］。使用適當(dāng)?shù)膬纾≧2=0.9）轉(zhuǎn)換為拓?fù)渚仃?，使用?dòng)態(tài)樹(shù)切割方法對(duì)模塊進(jìn)行劃分，并根據(jù)0.25高度的截止值合并類似的模塊。使用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)評(píng)估模塊與基因表達(dá)特征之間的關(guān)系。與基因表達(dá)特征相關(guān)性最高的模塊被選為使用“clusterProfiler”R 包進(jìn)一步進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）。

1.2.6 預(yù)后模型的構(gòu)建 進(jìn)行Cox 回歸分析，從關(guān)鍵模塊中識(shí)別總生存期相關(guān)基因。然后使用這些總生存期相關(guān)基因構(gòu)建隨機(jī)森林生存模型，以評(píng)估每個(gè)基因的重要性。根據(jù)相對(duì)重要性選擇前4 個(gè)基因進(jìn)行Cox 回歸分析，構(gòu)建預(yù)后模型。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Huh-7 和LO2 細(xì)胞在Dulbecco 的 改 良Eale 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng)，SUN-449 和SMMC-7721 細(xì)胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37.5 ℃和5%CO2中孵育。當(dāng)Huh-7 細(xì)胞密度在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中達(dá)到70%至80%時(shí)，在Huh-7 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GSDMC 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。

擁軍優(yōu)屬，增強(qiáng)軍人軍屬榮譽(yù)感和成就感，關(guān)系到國(guó)防建設(shè)可持續(xù)發(fā)展的大局。擁政愛(ài)民，體現(xiàn)人民軍隊(duì)的性質(zhì)和宗旨，是我軍特有的政治優(yōu)勢(shì)。人武部作為軍隊(duì)與地方政府的橋梁和紐帶，要堅(jiān)持全心全意為人民服務(wù)的宗旨，主動(dòng)作為，以實(shí)際行動(dòng)贏得地方政府和人民群眾的尊重和支持；適應(yīng)新形勢(shì)，創(chuàng)新工作方法，引導(dǎo)廣大民兵預(yù)備役人員積極參與精準(zhǔn)扶貧，支持地方經(jīng)濟(jì)建設(shè)；依靠地方黨委、政府解決軍人軍屬后顧之憂，努力開(kāi)創(chuàng)擁軍優(yōu)屬、擁政愛(ài)民的新局面。

1.2.8 RNA 提取和qRT-PCR 使用Trizol 試劑從Huh-7，SUN-449，SMMC-7721 和LO2 中 提 取 總RNA，然后根據(jù)制造商的說(shuō)明使用cDNA 制備試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行定量PCR。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。用于檢測(cè)GSDMC和GAPDH表達(dá)如下：GSDMC前 引 物：5'-TCCATGTGTGGAACGCATTAGC-3'，GSDMC后 引 物：5'-CAAACTGACGTAATTTGGTGGC-3'；GAPDH前 引 物5'-CAA-TGACCCCTTCATTGACC-3'，GAPDH后引物5'-GACAAGCTTCCCGTTC-TCAG-3'。

1.2.9 Western Blot 從配對(duì)的HCC 和鄰近的正常組織中提取蛋白質(zhì)。使用BCA 蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。 取等量的蛋白樣品行SDS-PAGE 電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用無(wú)蛋白快速封閉溶液密封30 min。加入一抗并在 4 ℃ 下孵育過(guò)夜。 然后用PBST 洗滌膜3 次與二抗稀釋室溫?fù)u床孵育2 h。ECL-plus 檢 測(cè) PVDF 膜 上 的 蛋 白 信 號(hào)，曝 光 并顯影。

1.2.10 免疫組織化學(xué) 將HCC 組織和配對(duì)的相鄰良性組織樣品置于二甲苯中并用梯度級(jí)乙醇水合進(jìn)行脫蠟，然后在檸檬酸鹽緩沖液中加熱以進(jìn)行抗原回收。淬滅過(guò)氧化物酶活性后，將切片與抗體在4 °C 下孵育過(guò)夜。次日將二抗在室溫下孵育1 h，然后脫水密封，最后在顯微鏡下檢查。

1.2.11 成球?qū)嶒?yàn) NC-Huh-7 細(xì)胞和OE-Huh-7 細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用PBS 洗滌，然后用無(wú)血清DMEM / F12 懸浮。每個(gè)孔用15 000 個(gè)細(xì)胞處理，最初僅加入1 mL 球形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將腫瘤細(xì)胞接種到6 孔康寧平板中，每2 天加入球形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基。第1 天、第3 天、第7 天、第14 天拍攝，14 d 后每孔計(jì)數(shù)腫瘤球狀體（直徑＞100 mm）。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R 軟件（版本4.1.0）進(jìn)行?！癵gplot2”R 包（版本：3.3.6）用于圖形表示。分別使用“生存”R 包（版本：3.4-0）和“randomForest”R 包（版本：4.7-1.1）進(jìn)行單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸和隨機(jī)森林分析?！癵lmnet”R 包（版本：4.1-4）用于構(gòu)建預(yù)后模型。GraphPad Prism 9.0用于分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并使用配對(duì)的t檢驗(yàn)分析組間的差異。每個(gè)測(cè)試重復(fù)3 次，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定HCC 的干性亞型

該研究共納入了328 個(gè)HCC 樣本。計(jì)算每位患者26 個(gè)干性基因集的富集評(píng)分，并通過(guò)共識(shí)聚類分析鑒定出兩個(gè)不同的干性集群，標(biāo)記為C1 和C2（圖1A，B）。與C2 集群相比，C1 集群中26 個(gè)干性基因集的富集得分顯著更高（圖1C）。

圖1 鑒定HCC 的干性亞型Fig 1 Identification of the stemness subtypes of HCC

2.2 C1、C2 生存分析

Kaplan-Meier 生存分析顯示，兩個(gè)集群之間的OS 存在顯著差異，C2 患者的OS 優(yōu)于C1（圖2A）。在調(diào)整年齡、性別和分期后，這種關(guān)系仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C2 患者的風(fēng)險(xiǎn)比低于C1（HR： 0.667 7，95% CI： 0.451 2 to 0.988 0）（圖2B）。

圖2 C1、C2 生存分析Fig 2 Survival analysis of C1 and C2

2.3 C1、C2 與TME 和ESTIMATE 分?jǐn)?shù)的相關(guān)性及化療敏感性和免疫治療反應(yīng)分析

通過(guò)使用CIBERSORT 算法評(píng)估22 種免疫細(xì)胞類型的浸潤(rùn)水平，進(jìn)一步評(píng)估了TME。5 種免疫細(xì)胞（即肥大細(xì)胞靜息狀態(tài)、CD4+ T 記憶細(xì)胞靜息狀態(tài)、樹(shù)突狀細(xì)胞靜息狀態(tài)、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和肥大細(xì)胞活化狀態(tài)的浸潤(rùn)水平在C1 和C2 之間差異顯著。C1 具有較高的浸潤(rùn)水平的CD4+ T 記憶細(xì)胞靜息狀態(tài)，樹(shù)突狀細(xì)胞靜息狀態(tài)、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，C2具有較高的浸潤(rùn)水平的肥大細(xì)胞靜息和活化狀態(tài)（圖3A）。此外，基于ESTIMATE 算法，與C1 相比， C2 的免疫評(píng)分，基質(zhì)評(píng)分和ESTIMATE 評(píng)分更高。（圖3B）。評(píng)估C1 和C2 亞型患者對(duì)通常用于HCC 治療的五種化療藥物的敏感性。吉西他濱、多柔比星、博萊霉素、依托泊苷和米哚妥林的半抑制濃度在C2 中顯著較高，表明C2 對(duì)這些化療藥物的敏感性高于C1（圖3C）。此外，該研究使用 TIDE算法評(píng)估了C1 和 C2 中患者的免疫治療反應(yīng)。與化療敏感性一致，與C1 相比， C2 免疫治療反應(yīng)更好（圖3D）。

圖3 C1、C2 與TME 和ESTIMATE 分?jǐn)?shù)的相關(guān)性及化療敏感性和免疫治療反應(yīng)分析Fig 3 Correlation of C1 and C2 with TME and ESTIMATE scores and analysis of chemotherapy sensitivity and immunotherapy response

2.4 識(shí)別 C2 相關(guān)模塊

C2 亞型患者化療藥物的敏感性高于C1，免疫治療反應(yīng)更好，因此進(jìn)行了WGCNA 以確定與該亞型相關(guān)的預(yù)后基因。使用方差最高的前3 000 個(gè)基因構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，β=4，R2=0.9（圖4A）。將模塊特征基因進(jìn)行聚類，截止高度為 0.25，總共生成了10 個(gè)模塊（圖 4B）。洋紅色模塊與C2 負(fù)相關(guān)最強(qiáng)（r=-0.34，P=0.000 4）（圖4C），因此被確定為進(jìn)一步分析的關(guān)鍵模塊。

圖4 識(shí)別 C2 相關(guān)模塊Fig 4 Identification of C2-associated module

2.5 預(yù)后模型的構(gòu)建

洋紅色模塊總共包含117 個(gè)基因。單變量Cox回歸分析確定36 個(gè)基因?yàn)镺S 相關(guān)基因。在這些基因中，GSDMC、AOC1、OTX1和CASC9被隨機(jī)森林生存分析確定為最重要的基因（圖5A）。基于對(duì)這4 個(gè)基因的LASSO 回歸分析構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。分析顯示與C1 相比， C2 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較低（圖5B）。使用中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為臨界值，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier 生存分析表明，與高風(fēng)險(xiǎn)組相比，低風(fēng)險(xiǎn)組具有更好的OS（圖5C）。使用桑葚圖可視化基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的兩個(gè)集群中患者的分布（圖5D）。

圖5 預(yù)后模型的構(gòu)建Fig 5 Construction of prognostic model

2.6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與TME、ESTIMATE 評(píng)分和免疫治療反應(yīng)的相關(guān)性

與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高危組肥大細(xì)胞靜息狀態(tài)和M2 巨噬細(xì)胞的比例更高（圖6A）。相反，低風(fēng)險(xiǎn)組的濾泡輔助性T 細(xì)胞比例升高。此外，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高危組的基質(zhì)評(píng)分和ESTIMATE 評(píng)分更高（圖6B）。高危組和低危組對(duì)五種化療藥物的敏感性無(wú)顯著差異（圖6C）。然而，與高危組相比，低風(fēng)險(xiǎn)組的患者表現(xiàn)出更高的免疫治療反應(yīng)（圖6D）。

圖6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與TME、ESTIMATE 評(píng)分和免疫治療反應(yīng)的相關(guān)性Fig 6 Correlation of risk score and TME， ESTIMATE score， and immunotherapy response

2.7 GSDMC 在HCC 細(xì)胞和組織中下調(diào)

通過(guò)隨機(jī)森林生存分析將GSDMC確定為最重要的基因，因此研究了GSDMC對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞和肝癌組織的影響。為探究GSDMC在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，選取正常肝細(xì)胞系LO2 和3 個(gè)肝癌細(xì)胞系Huh-7、SUN-449 和SMMC-7721 進(jìn) 行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與正常肝細(xì)胞相比，Huh-7、SUN-449 和SMMC-7721 種肝癌細(xì)胞系的GSDMC mRNA 表達(dá)水平顯著降低（圖7A）， 結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001 3；P=0.003 7；P=0.002 6）。還發(fā)現(xiàn)，在這3 個(gè)肝癌細(xì)胞系中，GSDMC在SMMC-7721 中的表達(dá)最高，在Huh-7 中的表達(dá)最低。因此，選擇了Huh-7 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后，對(duì)4對(duì)HCC 組織樣品進(jìn)行WB 以檢測(cè)GSDMC 的蛋白質(zhì)水平。與癌旁組織相比，GSDMC在癌組織中的表達(dá)較低（圖7B），在4 例肝癌組織及配對(duì)的癌旁組織中，GSDMC在肝癌組織和癌旁組織的表達(dá)中位數(shù)分別為0.340 9 和0.809 1，其蛋白水平表達(dá)在肝癌組織中低于癌旁組織，P=0.048 4（圖7C），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用免疫組化檢測(cè)GSDMC在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)（圖7D），結(jié)果顯示GSDMC在肝癌組織中下調(diào)。

圖7 GSDMC 在HCC 細(xì)胞和組織中下調(diào)性Fig 7 GSDMC was downregulated in HCC cells and tissues

2.8 過(guò)表達(dá)GSDMC 抑制HCC 細(xì)胞的干性

隨后，進(jìn)一步評(píng)估了GSDMC對(duì)肝癌細(xì)胞干性的影響。使用qRT-PCR 分析評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明GSDMC 成功轉(zhuǎn)染到Huh-7 細(xì)胞中（P=0.002）（圖8A）。采用細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)評(píng)估GSDMC是否影響HCC 的干性，結(jié)果表明，與對(duì)照細(xì)胞相比，GSDMC在Huh-7 細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)顯著降低了球體形成（圖8B）。進(jìn)一步的定量分析表明，GSDMC減少了球體/每個(gè)視野的數(shù)量（P=0.029）（圖8C），表明GSDMC抑制HCC 細(xì)胞的干性。

圖8 過(guò)表達(dá)GSDMC 抑制HCC 細(xì)胞的干性Fig 8 Overexpression of GSDMC attenuates CSC traits of HCC cells

3 討論

本研究對(duì)大規(guī)模肝細(xì)胞癌患者群體進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，旨在揭示與CSC 相關(guān)的26個(gè)基因集的分子特征，研究CSC 亞型相關(guān)的基因表達(dá)模式可能有助于患者的特異性療法。此外，通過(guò)隨機(jī)森林生存分析確定GSDMC是最重要的一個(gè)預(yù)后基因。后經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GSDMC在HCC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)降低，GSDMC抑制HCC 細(xì)胞的干性。

利用26 個(gè)干細(xì)胞基因集的ssGSEA 評(píng)分，進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類以區(qū)分兩種的干細(xì)胞亞型。C2 亞型26個(gè)干性基因集的富集得分低，生存期更長(zhǎng)，預(yù)后更好，肥大細(xì)胞浸潤(rùn)更顯著，對(duì)免疫療法反應(yīng)率更高。C2 的生存結(jié)局明顯優(yōu)于C1。為探究化療和免疫治療對(duì)HCC 的聯(lián)合治療是否有更好的療效，以便進(jìn)一步研究。本研究分析了各種藥物對(duì)C1 和C2 患者的影響。結(jié)果表明，吉西他濱、多柔比星、博來(lái)霉素、依托泊苷和米哚妥林的IC50在C2 中顯著更高，表明與C1 相比，C2 患者對(duì)這些化療藥物更敏感。這意味著進(jìn)一步的研究可以集中在HCC 患者的聯(lián)合治療上。因此，隨后進(jìn)行了WGCNA 以確定與C2 亞型的關(guān)鍵模塊和基因。從該分析中，洋紅色模塊成為關(guān)鍵模塊，由117 個(gè)候選關(guān)鍵基因組成。然后進(jìn)行單變量Cox 和隨機(jī)森林生存分析，以搜索洋紅色模塊內(nèi)的預(yù)后基因，最后鑒定出具有預(yù)后相關(guān)性的4 個(gè)基因（GSDMC，AOC1，OTX1，CASC9）。

根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，肝癌患者隨后被分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組。高危組肥大細(xì)胞靜息狀態(tài)和M2 巨噬細(xì)胞的比例較高，而低危組的濾泡輔助性T 細(xì)胞水平升高。M2 巨噬細(xì)胞，在大多數(shù)實(shí)體惡性腫瘤中被稱為腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞，在增殖、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用［24］。濾泡輔助性T 細(xì)胞來(lái)源或 B 細(xì)胞相關(guān)惡性腫瘤中濾泡輔助性T 細(xì)胞數(shù)量的增加通常與不良預(yù)后有關(guān)，而在各種非淋巴細(xì)胞來(lái)源的實(shí)體器官腫瘤類型中，它預(yù)示更好的預(yù)后［25］。關(guān)于本研究中確定的四個(gè)干性模型基因，GSDMC上調(diào)與結(jié)直腸癌，乳腺癌和黑色素瘤的不良臨床結(jié)果有關(guān)［26-28］。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GSDMC表達(dá)在幾種食管鱗狀細(xì)胞癌病例中受到抑制，這表明其作為腫瘤抑制基因的作用［29］。在本研究中，GSDMC在HCC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)降低。球體形成實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR 表明GSDMC抑制HCC 干細(xì)胞表型。

本研究有局限性。首先，研究中的數(shù)據(jù)是從公共數(shù)據(jù)庫(kù)而不是本研究數(shù)據(jù)中獲取。其次，基于生物信息學(xué)鑒定了與HCC 干性相關(guān)的模型基因，需要進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)來(lái)研究其作為靶標(biāo)的能力，以提高免疫治療和化療療效。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

包凌：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)執(zhí)行、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和論文撰寫(xiě)；龔旋坤：參與部分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)檢索及部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)；陳曉：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文撰寫(xiě)指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。