長鏈脂酰輔酶A 合成酶4 調(diào)控鐵死亡在急性脊髓損傷治療中的研究進展

何天 白登彥 朱祥輝 張海軍

脊髓損傷（SCI）是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，根據(jù)病因不同可分為外傷性SCI（如車禍、跌倒引起椎體骨折、脫位并發(fā)脊髓受損等）和非外傷性SCI（如腫瘤、椎間盤壓迫脊髓等）。原發(fā)性損傷后數(shù)小時內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞會出現(xiàn)繼發(fā)性缺血、變性甚至死亡，而繼發(fā)性損傷則在組織學(xué)上表現(xiàn)為膠質(zhì)瘢痕和囊腔形成以及內(nèi)源性再髓鞘化和軸突再生不良[1]，可導(dǎo)致SCI 治療出現(xiàn)效果差、恢復(fù)慢、致殘率高等問題。因此，保證神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞存活成為治療的關(guān)鍵。近30年來，SCI 全球發(fā)病率有上升趨勢[2]。我國SCI 年患病率約37/100 萬，男性明顯多于女性，年齡在34.7～54.4 歲，主要病因為交通事故和高空墜落傷，其他原因有跌倒和煤礦作業(yè)等[3]。高昂的住院費用和高致殘率給SCI 患者帶來了巨大的經(jīng)濟和心理負擔(dān)。

細胞死亡是繼發(fā)性SCI 的最終階段。有研究證實，SCI 患者細胞會發(fā)生各種調(diào)節(jié)性細胞死亡（RCD），如焦亡、凋亡、自噬依賴性細胞死亡、程序性壞死以及PARP-1 依賴的細胞死亡[4-9]。2012 年，Dixon 等[10]發(fā)現(xiàn)了一種由erastin-system XC（-）介導(dǎo)的新型非凋亡性細胞死亡方式，并將其命名為鐵死亡。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)鐵死亡抑制劑可以減輕脊髓挫傷大鼠的鐵死亡，并促進其功能恢復(fù)[11]，為SCI 治療提供了新思路。

1 鐵死亡

1.1 鐵死亡概述

細胞死亡根據(jù)是否可調(diào)控，可分為RCD 和意外細胞死亡（ACD）。作為一種新型RCD，鐵死亡以鐵離子蓄積、活性氧積累、線粒體縮小及膜密度增加等形態(tài)學(xué)改變?yōu)樘卣?，可通過多種通路介導(dǎo)細胞死亡。谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）4 通路被認為是鐵死亡的主要信號通路，其中關(guān)鍵分子為GPX4 和長鏈脂酰輔酶A 合成酶（ACSL）4。ACSL4 可以促進脂質(zhì)過氧化，從而誘發(fā)鐵死亡，而GPX4 的作用則相反。總的來說，鐵死亡是否發(fā)生是由細胞內(nèi)ACSL4 介導(dǎo)的多不飽和脂肪酸（PUFA）過氧化與GPX4 等介導(dǎo)的抗過氧化是否平衡決定的。

1.2 鐵死亡發(fā)生機制

細胞外的3 價鐵離子在與轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）結(jié)合后，可被細胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR）1 識別，然后通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)并儲存在內(nèi)體中。前列腺6 跨膜上皮抗原（STEAP）3 可以將3 價鐵離子還原為2 價鐵離子，并在2 價金屬轉(zhuǎn)運體的介導(dǎo)下將2 價鐵離子轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中，最終由鐵蛋白中的銅藍蛋白將2 價鐵離子氧化為3 價鐵離子并儲存在鐵蛋白中。鐵蛋白可在維持細胞鐵含量方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)細胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)被破壞時，胞內(nèi)蓄積的亞鐵離子可以通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，從而促進脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。線粒體和NADPH 氧化酶（NOX）產(chǎn)生的超氧陰離子可將3 價鐵離子還原為2 價鐵離子，促進芬頓反應(yīng)發(fā)生[12]。

富含花生四烯酸（AA）和腎上腺酸（AdA）等PUFA 的細胞膜容易發(fā)生脂質(zhì)過氧化。AA 和AdA 可分別通過ACSL4 和磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶（LPCAT）3 轉(zhuǎn)化為多不飽和脂肪酸磷脂（PUFAPE），即游離PUFA 如AA 和AdA 經(jīng)過ACSL4 催化，可與CoA 結(jié)合生成PUFA-CoA（AA-CoA 和AdACoA），再經(jīng)過LPCAT3 催化，可與腦磷脂（PE）反應(yīng)生成PUFA-PE（AA-PE 和AdA-PE）[13-15]。15-脂氧合酶（15-LOX）可將AA-PE 氧化為單氧合PE（15-OH-AA-PE）、雙氧合PE（15-OOH-AA-PE）和三氧合PE（15-OOH-8-OH-AA-PE、15-OOH-9-OHAA-PE、15-OOH-12-OH-AA-PE）。在鐵死亡細胞模型中加入15-LOX 可以產(chǎn)生較多的三氧合PE 和較少的單氧合PE[13]，由此導(dǎo)致磷脂雙分子層厚度、滲透性和結(jié)構(gòu)的破壞[16-17]。脂質(zhì)過氧化既是正常的生理過程，可以受細胞調(diào)控，也可以通過自由基鏈式反應(yīng)進行，所以也會失控[18]。本質(zhì)上，自由基反應(yīng)是繞過限制三重態(tài)氧反應(yīng)性的自旋屏障，從而驅(qū)動更符合熱力學(xué)的脂質(zhì)過氧化，并導(dǎo)致細胞膜完整性和功能破壞的過程[17]。此外，過氧化脂質(zhì)的毒性作用也會造成細胞損傷。其中ACSL4的激活是一個正反饋過程[19-20]，鐵死亡誘導(dǎo)物可引起脂質(zhì)過氧化物的輕微積累，從而誘導(dǎo)β Ⅱ磷酸化蛋白激酶C（PKCβ Ⅱ）激活?；罨腜KCβ Ⅱ直接結(jié)合并磷酸化ACSL4，從而激活A(yù)CSL4，最終促進脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物形成。最后，脂質(zhì)過氧化物-PKCβ Ⅱ-ACSL4 正反饋閉環(huán)促進脂質(zhì)過氧化物達到致死水平，從而引發(fā)細胞鐵死亡。

1.3 鐵死亡的調(diào)控

GSH/GPX4 是公認的主要鐵死亡調(diào)節(jié)通路。細胞膜表面的胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運體[System XC（-）]可將胞外胱氨酸轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)，同時將胞內(nèi)等量的谷氨酸排出。胱氨酸進入細胞后被還原為半胱氨酸，并與甘氨酸、谷氨酸經(jīng)過一系列反應(yīng)生成GSH。GSH 作為還原劑，在 GPX4 的催化下，可以將有毒的過氧化脂質(zhì)還原為無毒的脂醇。erastin 可通過抑制System XC（-）重鏈SLC7A11 的活性來降低GSH的含量，進而導(dǎo)致過氧化脂質(zhì)蓄積，并誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，激活轉(zhuǎn)錄因子（ATF）3 可抑制SLC7A11 表達，從而發(fā)揮與erastin 相似的作用[21]。

除上述途徑外，調(diào)節(jié)鐵含量、脂質(zhì)過氧化物生成的酶也可以調(diào)控鐵死亡。Anandhan 等[22]發(fā)現(xiàn)，NFE2L2/NRF2敲除細胞可以改變能夠控制鐵蛋白合成和降解的蛋白如HERC2、F-box 富含亮氨酸重復(fù)蛋白（FBXL）5、鐵調(diào)控蛋白（IRP）2 和核受體共激活因子（NCOA）4 等的表達，從而損害鐵穩(wěn)態(tài)，并影響脂質(zhì)過氧化。生育酚和生育三烯酚可以抑制LOX[13]，提示維生素E 可能有抗鐵死亡作用。ACSL4 也可受到調(diào)控，具體詳見下頁圖1。

2 ACSL4

2.1 ACSL4 概述

ACSL4基因位于X 染色體中，其編碼的蛋白ACSL 包含5 個異構(gòu)體，分別為ACSL1、3、4、5、6。它們可以將游離的長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酰輔酶a，用于合成細胞脂質(zhì)和促進β 氧化降解。ACSL4在腎上腺、卵巢、睪丸和腦組織中含量豐富，主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、過氧化物酶體中[23]。鐵死亡發(fā)現(xiàn)者Dixon 等[14]發(fā)現(xiàn)，ACSL4可能在鐵死亡中發(fā)揮重要作用。

2.2 ACSL4 是鐵死亡的關(guān)鍵分子

Doll 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ACSL4缺陷同時敲除GPX4的小鼠胚胎成纖維細胞較單純敲除GPX4的細胞存活時間更長，提示ACSL4缺失對細胞抗鐵死亡有強大作用，且ACSL4與GPX4之間有著密不可分的關(guān)系。Kagan 等[13]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鐵死亡誘導(dǎo)劑處理后，ACSL4敲除細胞胞酯化氧合AA 含量較野生型細胞更低。而與ACSL4相比，其他ACSL家族成員表達的缺失對鐵死亡敏感性沒有任何影響，提示ACSL4缺失對鐵死亡具有特別意義[15]。

2.3 ACSL4 受到的調(diào)控

羅格列酮、吡格列酮和特羅格列酮等噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物可以靶向調(diào)控ACSL4，從而可以抑制細胞鐵死亡發(fā)生。動物實驗證實，羅格列酮可以顯著延長GPX4敲除小鼠的總體生存期[15]。但值得注意的是，動物和細胞實驗均表明，噻唑烷二酮類藥物在抗鐵死亡方面僅有預(yù)防作用，并不能發(fā)揮治療作用。目前已有實驗證實，羅格列酮可以促進少突膠質(zhì)細胞生成和小膠質(zhì)細胞生成，通過阻斷ACSL4 抑制鐵死亡，從而改善小鼠大腦缺血再灌注損傷[24]。

轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）1α 可以通過核轉(zhuǎn)位和基因表達調(diào)控介導(dǎo)對氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)。線粒體的變化對氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)至關(guān)重要。有研究表明，與低氧低糖處理的HIF-1α沉默SH-SY5Y 神經(jīng)母細胞瘤細胞系相比，非沉默組ACSL4表達水平明顯更高，并通過chip 實驗發(fā)現(xiàn)HIF-1α顯著富集于ACSL4的兩個保守啟動子區(qū)域（CNS1 和CNS2），可破壞ACSL4表達，從而增強細胞對鐵死亡的敏感性[25]。Wang 等[26]通過HK-2細胞chip 實驗也可以得出同樣結(jié)論。

抗真菌藥舍他康唑是一種FDA 批準的強效ACSL4抑制劑，它對人類ACSL4有較好的選擇性。此外，舍他康唑還能降低脂質(zhì)過氧化作用，由此保護對鐵死亡敏感的非致癌神經(jīng)元細胞系的細胞免受rsl3 誘導(dǎo)的鐵死亡[27]。這些都提示ACSL4抑制劑將來可能作為臨床有效抑制細胞鐵死亡的藥物。

3 SCI 和鐵死亡

近年有研究表明，鋅可以增加SCI 小鼠NRF2/HO-1的表達，從而抑制鐵死亡并降低炎癥因子水平，NRF2 抑制劑布魯薩托爾則可以逆轉(zhuǎn)鋅的作用[28]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可以調(diào)控鐵蛋白重鏈1 和鐵蛋白輕鏈的表達，從而調(diào)節(jié)鐵代謝紊亂，并促進SCI 大鼠肢體功能恢復(fù)[29]。向SCI 早期大鼠注射亞硒酸鈉可顯著降低鐵離子濃度以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛和4-羥基壬烯醛水平，提高GPX4蛋白及其mRNA 水平，并抑制神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞損傷，從而促進大鼠運動功能恢復(fù)[30]。大量實驗研究均表明，SCI 與鐵死亡之間有著密切的聯(lián)系。目前，僅少數(shù)文獻報道藥物干預(yù)SCI 模型可導(dǎo)致ACSL4 表達的變化。如用依達拉奉治療SCI 大鼠可上調(diào)GPX4和System XC（-），并下調(diào)ACSL4和5-LOX。目前針對ACSL4 的藥物尚未用于干預(yù)SCI模型的實驗。

疾病模型中被用作鐵死亡抑制劑的去鐵胺（DFO）可降低SCI 后總鐵離子、腫瘤壞死因子、白細胞介素-1、caspase-3 的表達水平，抑制凋亡和膠質(zhì)瘢痕形成，促進功能恢復(fù)，這表明鐵死亡在繼發(fā)性SCI 中可能發(fā)揮了重要作用。一些噻唑烷二酮類藥物在保護細胞免受鐵死亡損傷方面仍有局限性，此類藥物需提前用藥才能發(fā)揮抗鐵死亡作用。因此，在SCI 早期應(yīng)用羅格列酮可以使細胞有足夠的時間進行適當(dāng)?shù)牧字貥?gòu)，從而有望減少鐵死亡導(dǎo)致的繼發(fā)性膠質(zhì)瘢痕的形成，促進神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞恢復(fù)。已有實驗證實，羅格列酮在SCI 中應(yīng)用有效。Meng 等[31]通過KEGG 分析和實驗驗證發(fā)現(xiàn),羅格列酮可以降低推定激酶1 的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（FOX）O1 的表達，進而改善SCI 大鼠的運動功能，抑制炎癥反應(yīng)，并促進神經(jīng)干細胞的體內(nèi)增殖。羅格列酮+毛喉素[32]或羅格列酮+甲潑尼龍[33]聯(lián)合應(yīng)用較單一藥物應(yīng)用，大鼠的運動功能恢復(fù)均更好，提示羅格列酮通過激活脊髓中過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-γ 發(fā)揮抗炎和抗氧化作用。羅格列酮是否通過抑制ACSL4 引起的抗鐵死亡作用對SCI 后神經(jīng)起到保護作用尚不明確，而羅格列酮治療SCI 僅停留在動物實驗，尚未進行臨床試驗，其療效有待考察。

目前，SCI 與鐵死亡之間的研究主要聚焦于抗鐵死亡藥物與動物運動功能恢復(fù)的關(guān)聯(lián)。其中，抗鐵死亡藥物的作用機制主要為影響GSH/GPX4 軸，影響脂質(zhì)過氧化物形成和鐵離子蓄積的藥物較少。

4 結(jié)語

SCI 是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，因其損傷后治療效果差、恢復(fù)慢、致殘率高等問題，使得SCI 的治療及預(yù)防成為焦點話題。自2012 年鐵死亡被發(fā)現(xiàn)以來，已有足夠的證據(jù)支持鐵死亡與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切關(guān)系，鐵死亡的發(fā)現(xiàn)打開了SCI研究的一扇大門，對SCI 治療有著重要意義。

ACSL4 作為鐵死亡的關(guān)鍵分子，其基因缺陷有逆轉(zhuǎn)鐵死亡的作用，近兩年逐漸成為鐵死亡的研究熱點。它通過脂質(zhì)過氧化物-PKCβ Ⅱ-ACSL4正反饋引起脂質(zhì)過氧化物大量蓄積，由此造成細胞死亡，最終導(dǎo)致各系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。目前，ACSL4 主要集中在腫瘤研究領(lǐng)域，少見于SCI 研究，但ACSL4 可能是有潛力的SCI 治療靶點，因此可能成為未來SCI 預(yù)防和治療研究的方向。