超聲在骨組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展

王洋 肖龍飛 耿弼江 沈龍祥

骨移植是目前臨床治療創(chuàng)傷、感染和腫瘤所導(dǎo)致嚴(yán)重骨缺損的主要手段[1]。自體骨移植因其良好的生物活性和無免疫原性而被認(rèn)定為骨移植的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。然而，供體來源有限和術(shù)后感染等嚴(yán)重并發(fā)癥限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用[3]。為了解決上述問題，骨組織工程技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

骨組織工程是結(jié)合生命科學(xué)、生物工程和材料科學(xué)所形成的新興交叉學(xué)科，旨在為骨缺損修復(fù)提供新的解決方案[4]。正如沃爾夫定律和機(jī)械恒溫器假說所言[5]，機(jī)械刺激可用于促進(jìn)骨骼形成。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞都屬于刺激敏感細(xì)胞，單純將骨組織工程支架（BTES）填充到骨缺損處無法為周圍骨組織提供相應(yīng)的機(jī)械刺激，這可能導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)代謝減慢，不利于骨愈合[6]。近年來，除了將各種細(xì)胞和生物活性分子與BTES 相結(jié)合外，超聲波、光/熱和電/磁場等多種外源性物理刺激也被應(yīng)用到組織工程技術(shù)中，國內(nèi)外諸多研究表明它們對(duì)骨組織再生具有一定的促進(jìn)作用[7]。

超聲波是一種頻率大于20 kHz 的機(jī)械振動(dòng)波，其在介質(zhì)中傳播時(shí)可以引起粒子間的局部振動(dòng)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)。這種效應(yīng)可以增強(qiáng)細(xì)胞物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，引起細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)，從而促進(jìn)組織修復(fù)和再生[8]。此外，超聲波對(duì)生物組織有較強(qiáng)的穿透能力且安全性較高，可以對(duì)組織深處的細(xì)胞和材料進(jìn)行無創(chuàng)性干預(yù)[9]。低強(qiáng)度脈沖超聲（LIPUS）是一種聲強(qiáng)小于3 W/cm2、以脈沖形式輸出的超聲波[10]，其可以提供低強(qiáng)度的機(jī)械刺激，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生微機(jī)械作用[11]。早在1994 年和2000 年，LIPUS 就被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療新發(fā)骨折和骨不連[12-14]。

1 促進(jìn)細(xì)胞增殖與遷移

LIPUS 已被證實(shí)可以提高BTES 中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）和其他細(xì)胞的活力并促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。Carina 等[16]將雙鏈DNA 的含量作為鎂-羥基磷灰石/膠原復(fù)合支架上BMSC 增殖的衡量標(biāo)準(zhǔn)，觀察到經(jīng)LIPUS 處理14 d 后，雙鏈DNA的含量增加了1.7 倍。Yang 等[17]利用LIPUS 刺激大鼠BMSC，發(fā)現(xiàn)其存活率提高了19.57%，且對(duì)LIPUS 的參數(shù)進(jìn)一步調(diào)整后（6.92 V，1.02 MHz，7.3 min），BMSC 的存活率進(jìn)一步提高了5.36%。Xie 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 刺激可以驅(qū)動(dòng)BMSC從G0/G1 期轉(zhuǎn)變到S 期和G2/M 期，這可能是通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路和上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1 來實(shí)現(xiàn)的。Fan 等[19]使用CCK-8 法評(píng)估種植在鈦合金支架上BMSC 的活力和增殖情況，發(fā)現(xiàn)在LIPUS 刺激的第4 天和第7 天，細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)且數(shù)量顯著增加。Cai 等[20]在鈦合金表面制備了鈦酸鋇壓電陶瓷涂層，并應(yīng)用LIPUS 對(duì)附著其上的MC3T3-E1 細(xì)胞進(jìn)行刺激，結(jié)果表明MC3T3-E1 細(xì)胞的黏附和增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，其機(jī)制可能與L 型鈣離子通道開放和Cav1.2 蛋白增加有關(guān)。Puts等[21]研究LIPUS 對(duì)饑餓小鼠骨樣細(xì)胞存活的影響，用聚焦LIPUS 刺激10 min 后，細(xì)胞生長和存活基因及與細(xì)胞間通訊相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞活力得到改善。

LIPUS 促進(jìn)BMSC 遷移也得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。Chen 等[22]將LIPUS 預(yù)處理后的BMSC 注射到大鼠股骨缺損部位，結(jié)果表明LIPUS 可以促進(jìn)BMSC遷移，提高骨缺損愈合率，其機(jī)制可能與黏著斑激酶（FAK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2 信號(hào)通路激活有關(guān)。Wang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 在LIPUS 的刺激下可以向牙槽骨缺損區(qū)遷移和歸巢。Xia 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 刺激可以顯著激活細(xì)胞自噬，增加基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF）-1 和趨化因子受體CXCR4 的表達(dá)，促進(jìn)BMSC 遷移。此外，超聲可以激活機(jī)械感應(yīng)-整合素蛋白，促進(jìn)活化的整合素與黏著斑結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接[25]。

2 促進(jìn)成骨分化

研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 刺激可以促進(jìn)成骨分化，增加Ⅰ型膠原蛋白（COL1）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2、骨橋蛋白（OPN）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（RUNX）2 和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osx 等的表達(dá)[26-27]。Jin 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 可以在0.5%（v/v）脂質(zhì)微泡的存在下增強(qiáng)聚乳酸-乙醇酸/α-磷酸三鈣3D 打印支架上BMSC 的生長和成骨分化能力。Tang 等[29]用LIPUS 刺激苧麻基羧甲基纖維素，兩者的協(xié)同作用進(jìn)一步促進(jìn)了MC3T3-E1 細(xì)胞增殖和成骨分化。Setoguchi 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 與BMP-9 聯(lián)合作用可以顯著增加去分化脂肪細(xì)胞的成骨分化，但這種聯(lián)合作用可以被吲哚美辛所抑制。Camarero-Espinosa 等[31]使用聚己內(nèi)酯和聚乳酸制備了一種可降解的動(dòng)態(tài)Janus 支架，其在LIPUS 的刺激下可以發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，并促進(jìn)BMSC 增殖和成骨分化。Feng 等[32]比較1 MHz 和3.2 MHz 的LIPUS 對(duì)多孔鈦合金支架的成骨作用，結(jié)果表明相較于對(duì)照組，1 MHz 頻率組與3.2 MHz 頻率組支架上細(xì)胞的ALP活性和OCN 水平均有所提升，但此兩組之間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Yao 等[33]制備了一種環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸修飾的納米氣泡，發(fā)現(xiàn)LIPUS可促進(jìn)由肌動(dòng)蛋白微絲聚合、瞬時(shí)受體電位M7（TRPM7）調(diào)節(jié)和細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流誘導(dǎo)的BMSC 成骨分化。

3 促進(jìn)骨礦化與骨整合

LIPUS 被證明是促進(jìn)體內(nèi)外骨礦化的有效手段。Maung 等[34]用LIPUS 對(duì)小鼠骨膜來源細(xì)胞進(jìn)行處理，盡管未觀察到細(xì)胞增殖，但ALP 活性顯著增加，并有礦化結(jié)節(jié)形成。Jiang 等[35]用強(qiáng)度為100 mW/cm2的LIPUS 刺激脂肪干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可在體外誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成，并增加成骨相關(guān)基因和骨唾液蛋白的表達(dá)。Zhou 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，用LIPUS 刺激聚乙二醇二丙烯酸酯3D打印支架3 周，支架內(nèi)鈣沉積量增加10%以上。Kuang 等[37]研究證實(shí)，LIPUS 在體外對(duì)多孔陶瓷支架中的牙囊細(xì)胞具有促進(jìn)骨礦化的作用。而Das等[38]研究證實(shí)，在體外用超聲波刺激壓電聚乳酸納米纖維支架可以增強(qiáng)支架中BMSC 的成骨分化，從而改善骨礦化。Feng 等[32]的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，LIPUS 刺激3 周及6 周后，接種有MC3T3-E1 細(xì)胞的鈦合金支架鈣沉積量增加。

LIPUS 主要在早期促進(jìn)體內(nèi)植入物骨整合[39-40]，有學(xué)者推斷其促進(jìn)植入物骨整合可能與降鈣素基因相關(guān)肽α 的合成和分泌有關(guān)[41]。Liu 等[42]使用LIPUS 干預(yù)兔股骨和脛骨鈦合金植入物，3 周后植入物周圍骨組織密度、骨體積分?jǐn)?shù)及骨小梁厚度均顯著增加。Cao 等[43]測量接種有MC3T3-E1 細(xì)胞的鈦合金支架孔隙占有率，發(fā)現(xiàn)經(jīng)LIPUS 處理3 周和6 周后，支架孔中新生骨體積更大。Ruppert等[44]將LIPUS 與局部振動(dòng)器所產(chǎn)生的低幅度、高頻振動(dòng)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)LIPUS 刺激4 周，可促進(jìn)大鼠股骨鈦合金植入物周圍骨整合，該作用較振動(dòng)刺激器產(chǎn)生的效果更為顯著，而刺激8 周后兩者差異并不明顯。Zhou 等[45]用LIPUS 對(duì)卵巢切除大鼠股骨植入物進(jìn)行處理，2～4 周后鈦植入物周圍骨的骨體積分?jǐn)?shù)及植入物骨結(jié)合率顯著提高，證實(shí)LIPUS 能有效促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨組織中鈦合金植入物的骨整合。此外，Chen 等[46]發(fā)現(xiàn)，LIPUS與脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞的結(jié)合可以促進(jìn)兔髕骨與髕腱連接處的骨再生，愈合部位骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度和骨小梁數(shù)均顯著增加。

4 控制BTES 內(nèi)生物活性分子及藥物的釋放

超聲波因其顯著的組織穿透能力而非常適合作為植入物的刺激觸發(fā)器，這種高頻率振動(dòng)波所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)可以控制聲響應(yīng)BTES 中生物活性物質(zhì)及藥物的釋放速率，從而對(duì)骨再生產(chǎn)生有益影響[47]。Kennedy 等[48]開發(fā)了一種超聲波可爆破的海藻酸鹽壁膠囊以封裝BMP-2 功能化修飾的金納米顆粒溶液，當(dāng)膠囊受到超聲波沖擊后，膠囊內(nèi)金納米顆粒幾乎100%釋放，并誘導(dǎo)BMSC 的成骨分化。Zhu 等[49]將摻有BMP-2 負(fù)載微球的聚乳酸/聚乳酸-乙醇酸/聚己內(nèi)酯復(fù)合支架植入骨壞死部位，發(fā)現(xiàn)LIPUS 刺激可以促進(jìn)微球中BMP-2 的釋放，使得復(fù)合支架周圍新形成骨的骨密度、礦化程度和成骨蛋白表達(dá)均得到顯著改善。Moncion 等[50]制備了一種摻有負(fù)載堿性成纖維細(xì)胞生長因子的全氟化碳纖維蛋白水凝膠，水凝膠暴露于超聲波會(huì)導(dǎo)致全氟化碳結(jié)構(gòu)破壞，并加速堿性成纖維細(xì)胞生長因子的釋放速率，從而刺激骨缺損周圍血管生長。He 等[51]設(shè)計(jì)了一種由聚乳酸、海藻酸鹽和Ca2+交聯(lián)形成的聲學(xué)響應(yīng)支架，該支架中封裝了SDF-1 和BMP-2；脈沖超聲作用后，支架中Ca2+依賴性交聯(lián)被破壞，加速支架降解并釋放SDF-1和BMP-2，從而將宿主內(nèi)源性BMSC 募集并捕獲到骨缺損部位。另有研究報(bào)道，超聲波作用可使BTES 內(nèi)固體顆粒尺寸更小且分散程度更高，這也可能是BTES 內(nèi)顆粒得以更好發(fā)揮作用的原因[52-53]。

5 抗菌及抑制植入物炎癥反應(yīng)

超聲波可以在聲敏劑存在的情況下發(fā)揮有效的抗菌作用[54]。Wu 等[55]開發(fā)了一種金納米顆粒修飾的鈦酸鋇壓電納米復(fù)合材料，超聲波刺激后該納米復(fù)合材料的抗菌效率可達(dá)99.23%，并能促進(jìn)金黃色葡萄球菌感染傷口的愈合。此外，超聲波與其他物理刺激的協(xié)同作用可以進(jìn)一步提高抗菌效果[56]。Zeng 等[57]在鈦植入物表面覆蓋由黑磷和聚多巴胺組成的復(fù)合涂層，依次用超聲波和近紅外光對(duì)該涂層刺激10 min 和20 min 后，其表現(xiàn)出較高的抗菌活性（97.3%），并可顯著促進(jìn)體外成骨和體內(nèi)植入物的骨整合。

植入物植入骨缺損部位后會(huì)引起一系列免疫排斥反應(yīng)。首先大量蛋白質(zhì)分子在支架附近聚集，募集免疫細(xì)胞（中性粒細(xì)胞）并促使炎癥因子釋放，從而誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)[58]。在慢性炎癥期間，巨噬細(xì)胞聚集并形成異物巨細(xì)胞，它可以降解支架表面的生物材料，從而影響生物相容性。炎癥反應(yīng)消退后，大量肉芽組織形成，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維包膜，大量的纖維組織占據(jù)骨缺損部位，阻礙骨再生[59]。超聲波在抑制骨植入物炎癥反應(yīng)中的作用已被證實(shí)。此外，LIPUS 可抑制脂多糖誘導(dǎo)的p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化并延緩局部肌肉萎縮[60]，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，抑制核因子（NF）-κB信號(hào)通路激活，從而抑制炎癥反應(yīng)[61]。Wu 等[62]研究顯示，LIPUS 刺激后的極化鈦酸鋇/鈦合金支架周圍組織中出現(xiàn)高比例的CD68 CD206 M2 型巨噬細(xì)胞，極化鈦酸鋇/鈦合金支架可以通過抑制MAPK/c-Jun 氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路并激活巨噬細(xì)胞中的氧化磷酸化和三磷酸腺苷（ATP）合成來調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。

6 植入支架超聲成像

植入支架體內(nèi)環(huán)境的評(píng)估對(duì)于其臨床轉(zhuǎn)化起至關(guān)重要的作用[63]。Kim 等[64]在小鼠模型中首先使用了超聲彈性成像來評(píng)估聚（1,8-辛二醇-檸檬酸酯）支架降解，發(fā)現(xiàn)支架彈性模量與支架重量損失（降解）相關(guān)。隨后，Park 等[65]和Zhou 等[66]分別用超聲彈性成像評(píng)估聚氨酯組織結(jié)構(gòu)降解和聚乳酸-乙醇酸原位成型植入物降解。Prada 等[67]通過超聲波在豬顱骨缺損模型中實(shí)現(xiàn)了對(duì)聚烯烴基聚合物假體的成像。Harvestine 等[68]將BMSC 封裝在海藻酸鹽水凝膠中并在成骨條件下培養(yǎng)4 周，使用熒光壽命成像和超聲反向散射顯微鏡對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，線性回歸分析確定了成像參數(shù)（如熒光壽命、聲衰減系數(shù)等）與生化測試之間的強(qiáng)相關(guān)性，以此證明了超聲波應(yīng)用于骨組織工程植入物成像的可行性。Melchor 等[69]將接種人軟骨細(xì)胞的3D打印聚乳酸支架放入超聲波集成的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，通過對(duì)超聲波信號(hào)的分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)軟骨組織形成過程的無創(chuàng)實(shí)時(shí)監(jiān)測。

7 結(jié)語

超聲波作為一種兼具機(jī)械刺激和成像功能的技術(shù)，對(duì)骨組織工程具有十分積極的影響。LIPUS更是因?yàn)椴僮鞣奖?、療效確切等優(yōu)勢被批準(zhǔn)用于臨床治療骨折和骨不連，這為日后LIPUS 響應(yīng)性BETS 走向臨床提供了無限可能。然而，由于組織工程材料種類各異，LIPUS 各項(xiàng)參數(shù)（頻率、強(qiáng)度和時(shí)間）的最佳值未能確定，這是未來需進(jìn)一步研究的方向。此外，盡管大量研究已證實(shí)LIPUS對(duì)骨再生有利，但LIPUS 對(duì)BETS 本身的作用及其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，這將為新型LIPUS 響應(yīng)性材料的開發(fā)提供思路。