乳酸菌生物膜的形成、特性及應(yīng)用研究

姚尚杰 金垚 黃鈞 周榮清 吳重德

摘要：大多數(shù)乳酸菌作為益生菌被人們熟知并廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。生物膜是細菌應(yīng)對不利環(huán)境的自然生長狀態(tài)。而近些年的相關(guān)研究揭示了乳酸菌生物膜的成膜規(guī)律和優(yōu)良特性，也初步探究了乳酸菌生物膜在生產(chǎn)中的應(yīng)用。為進一步調(diào)控和利用乳酸菌生物膜，對乳酸菌生物膜的深入研究和理解十分必要。文章綜述了乳酸菌生物膜的形成、細胞黏附胞外聚合物在生物膜形成中的作用，以及乳酸菌與酵母菌的混菌生物膜形成和酵母-乳酸菌相互作用，介紹了乳酸菌生物膜在抗逆、抑菌、食品生產(chǎn)、人體健康等方面的應(yīng)用，以期為人們了解乳酸菌生物膜和對其進行更深入的研究和應(yīng)用提供幫助。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；生物膜；混菌生物膜；抗逆；抗菌；應(yīng)用

中圖分類號：TS201.3 ?????文獻標(biāo)志碼：A ????文章編號：1000-9973（2024）04-0212-09

Study on Formation， Characteristics and Application of Lactic

Acid Bacteria Biofilms

YAO Shang-jie1，2， JIN Yao1， HUANG Jun1， ZHOU Rong-qing1， WU Chong-de1*

（1.College of Biomass Science and Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065，

China；2.Guizhou Xijiu Co.， Ltd.， Zunyi 636600， China）

Abstract： Most lactic acid bacteria are well known as probiotics and widely used in the field of food. Biofilms are the natural growth state of bacteria in response to adverse environments. In recent years， relevant studies have revealed the formation regulation and excellent characteristics of lactic acid bacteria biofilms， and the application of lactic acid bacteria biofilms in production has been preliminarily explored. In order to further regulate and utilize lactic acid bacteria biofilms， it is necessary to study and understand lactic acid bacteria biofilms in depth. In this paper， the formation of lactic acid bacteria biofilms， the roles of cell adhesion extracellular polymer in the biofilm formation， as well as the formation of mixed-bacteria biofilms of lactic acid bacteria and yeast and the interactions between yeast and lactic acid bacteria are reviewed， and the application of lactic acid bacteria biofilms in stress resistance， bacteriostat， food production， human health and other aspects is introdiced， so as to provide assistance for people to understand lactic acid bacteria biofilms and further research and apply them.

Key words： lactic acid bacteria; biofilm; mixed-bacteria biofilm; stress resistance; bacteriostat; application

收稿日期：2023-10-07

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31871787，32272280）

作者簡介：姚尚杰（1995—），男，博士研究生，研究方向：食品微生物。

*通信作者：吳重德（1982—），男，教授，博士，研究方向：傳統(tǒng)發(fā)酵食品。

細菌往往以懸浮或聚集狀態(tài)存在于自然環(huán)境中，而聚集狀態(tài)的細胞和胞外基質(zhì)的聚集體又被稱為生物膜[1]。特別是在不良環(huán)境中，細菌傾向于以生物膜的形式生長，生物膜則為細菌提供保護屏障[2]。細菌生物膜的形成和構(gòu)成在環(huán)境、醫(yī)療和口腔等領(lǐng)域已有很多研究，而食品生產(chǎn)和加工過程中的生物膜研究在近幾年才有較多報道。大多數(shù)乳酸菌可以作為有益菌參與到以發(fā)酵食品為主的食品加工過程中，也可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物、抑制致病菌等方式保護人體健康[3—4]。乳酸菌生物膜的形成被認為有利于乳酸菌的環(huán)境適應(yīng)能力和益生特性[5-6]。因此，了解乳酸菌的形成，特別是在發(fā)酵食品中生物膜的形成及生物膜的特性有利于進一步發(fā)揮乳酸菌對發(fā)酵產(chǎn)業(yè)和人類健康的積極作用。

1 乳酸菌生物膜的形成過程

乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌，主要包括Lactococcus spp.、Lactobacillus spp.、Pediococcus spp.、Enterococcus spp.、Streptococcus spp.、Bifidobacterium spp.、Leuconostoc spp.、Weissella spp.、Carnobacterium spp.和Tetragenococcus spp.。目前在奶酪、酸奶、啤酒、泡菜、大曲、醋、發(fā)酵橄欖、發(fā)酵魚和發(fā)酵雞肉等食品或生產(chǎn)環(huán)境中均有乳酸菌生物膜的報道，見表1。

但目前對乳酸菌生物膜的形成過程鮮有研究，一般采用細菌生物膜的成膜規(guī)律來解釋乳酸菌的生物膜形成，主要包括細胞團的形成和細胞對物體表面的初步黏附、細胞簇的形成和發(fā)展、胞外聚合物的產(chǎn)生、生物膜成熟和生物膜分散等步驟[7]。乳酸菌的初步黏附被普遍認為是可逆黏附，可以在非生物體表面如生產(chǎn)設(shè)備的不銹鋼表面，也可以在生物表面[8-9]。朱寒劍等[10]認為缺乏乳酸菌參與運動的鞭毛無法聚集在一起，以沉降等被動固定方式聚集并黏附于物體表面。乳酸菌細胞表面間或細胞表面和物體表面間的疏水性作用和靜電作用在非特異性黏附過程中起到了主導(dǎo)作用。龔虹等[11]對包括德氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和戊糖片球菌在內(nèi)的5株乳酸菌的黏附力與生物膜、疏水性和自凝集特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)具有較好疏水性和自聚集能力的乳酸菌成膜能力也較好。Giaouris等[12]在對天然乳酸乳球菌的表面理化分析的研究中，發(fā)現(xiàn)了處于低離子強度懸浮介質(zhì)中乳酸菌的黏附性、疏水性和低電負性之間有顯著相關(guān)性，黏附菌株多為疏水或低電荷菌株，同時靜電相互作用的存在會引起帶負電荷最多的親水菌株的黏附性下降。因此，對物體材料表面理化改性可以提高乳酸菌對物體的黏附，如通過酸酐基團將具有正電荷和親水性殼聚糖結(jié)合到聚丙烯表面，成功實現(xiàn)較高的乳酸菌生物量在表面沉積，隨后形成生物膜[13]。包括菌毛在內(nèi)的乳酸菌細胞表面蛋白被證明在黏附和聚集中起至關(guān)重要的作用[14]。Drame等[15]的研究表明一些能夠表達菌毛的乳酸菌能夠形成更復(fù)雜的、高異質(zhì)性的、粗糙的生物膜。另一項研究揭示了菌毛與其他表面蛋白相互作用的能力，表明菌毛參與了乳酸菌間同質(zhì)相互作用，從而影響生物膜的結(jié)構(gòu)[16]。一些表面蛋白可以促進戊糖乳桿菌對橄欖表皮的黏附，如戊糖乳桿菌基因enoA1 和?gpi編碼的定位于細胞表面并能與橄欖表皮某些特定成分黏附的胞質(zhì)酶，由基因obaC編碼的可以結(jié)合表皮蠟的一些脂質(zhì)的脂肪酸結(jié)合蛋白[17]。AggLb是副干酪乳桿菌中聚集促進蛋白，其N端的6個連續(xù)的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在被認為決定了AggLb上某些結(jié)構(gòu)的形成，這些結(jié)構(gòu)在膠原蛋白與纖維連接蛋白的結(jié)合中發(fā)揮作用，同時促進了細胞自聚集[18]。

乳酸菌增殖和胞外聚合物的生成積累是生物膜形成的重要步驟，并推動生物膜逐步走向成熟[19]。對于成熟的乳酸菌生物膜，其厚度達到整個生物膜形成過程的頂峰，細胞和胞外聚合物的量達到最高。同時成熟生物膜中細胞運動能力也遠低于懸浮細胞[20]。在一些研究中，成熟的乳酸菌生物膜表現(xiàn)出多層復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，Yao等[21]的研究中嗜鹽四聯(lián)球菌形成了12 μm厚的生物膜，在生物膜的表層中活細胞數(shù)量多于死細胞，而底層中死細胞數(shù)量較多。Ambulkar等[22]也利用激光共聚焦技術(shù)觀察到了培養(yǎng)24 h后植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌成熟生物膜，相比于培養(yǎng)4 h后的生物膜，成熟生物膜的厚度較大且平坦均勻，同時可觀察到中空孔道，這些孔道可為成熟生物膜中的細胞提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。得益于堅固的三維結(jié)構(gòu)和胞外聚合物的存在，相比于新生的生物膜，成熟生物膜對抗生素、消毒劑等有更強的抗性[23]。

2 乳酸菌生物膜的組成

目前在食品領(lǐng)域依然缺乏對乳酸菌生物膜胞外聚合物組成的系統(tǒng)性研究，多數(shù)學(xué)者以細菌生物膜胞外聚合物的組成來解釋乳酸菌生物膜胞外聚合物的組成。少數(shù)研究間接地探究了乳酸菌生物膜胞外聚合物的組成，Yunda等[31]利用傅里葉變換紅外光譜觀察到了鼠李糖乳桿菌生物膜中核酸、磷脂和多糖在不同培養(yǎng)基中隨著培養(yǎng)時間的變化而變化。Yao等[21]和丹彤等[32]通過使用DNase I和蛋白酶K處理植物乳桿菌生物膜，表明了胞外DNA（eDNA）和生物膜基質(zhì)蛋白是生物膜的重要組成部分。

胞外聚合物中多糖可分為單一單糖構(gòu)成的同多糖和兩種或兩種以上的單糖構(gòu)成的雜多糖。雜多糖通常由3～8種類型的單糖構(gòu)成的重復(fù)單元組成，其中單糖包括葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖等，除單糖外還可能含有葡糖胺、半乳糖胺、葡萄糖醛酸等[32]。Zhang等[33]利用陰離子交換色譜和脈沖安培檢測器鑒定出嗜鹽四聯(lián)球菌兩種胞外多糖（exopoly sacharides substances，EPS）的單糖組成，其中一種EPS的單糖組成為半乳糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸，另一種EPS的單糖組成為甘露糖和葡萄糖。一些研究表明乳酸菌生物膜的形成與胞外多糖的產(chǎn)量無相關(guān)性，而胞外多糖的黏度可以影響乳酸菌生物膜的形成活性[34]。目前，多糖對乳酸菌細胞黏附的影響仍不確定，如研究表明胞外多糖的產(chǎn)生能夠掩蓋約翰遜乳桿菌表面負責(zé)細胞間相互作用的結(jié)構(gòu)，同時使細胞表面的負電荷減小，親水性增強，從而降低了細胞黏附和自聚集[35]。而在另一些報道中，胞外多糖的存在提高了乳酸菌細胞黏附和在腸道環(huán)境中定植繁殖的持久性。胞外多糖這種對細胞黏附水平影響的差異被認為與多糖的組成、大小、濃度和殘基位置有關(guān)[36]。

eDNA也是生物膜的重要組成部分，多個研究通過DNA酶處理證明了eDNA在乳酸菌生物膜中的存在和作用[23]。生物膜胞外聚合物中的eDNA被認為來自細胞活性分泌和裂解釋放，后者在腸球菌和植物乳桿菌中有報道[37]。不同菌株的裂解行為會造成生物膜中eDNA水平的差異[38]。一些理化應(yīng)激如亞致死熱和氧化應(yīng)激暴露可能促進乳酸菌釋放eDNA進而提高生物膜對應(yīng)激的抵抗能力[39]。eDNA可以和N-乙酰氨基葡萄糖協(xié)同形成生物膜，通過共價附著的膜脂蛋白與細胞表面相互作用促進細胞的聚集和生物膜的形成，也可以通過陽離子如Ca2+橋接介導(dǎo)細菌的聚集和生物膜的形成[40-41]。除有助于生物膜基質(zhì)的內(nèi)聚性外，eDNA的存在還有利于生物膜的黏彈性和機械穩(wěn)定性。

直接參與生物膜形成的蛋白質(zhì)除黏附相關(guān)的表面蛋白外，還包括由乳酸菌細胞經(jīng)分泌系統(tǒng)分泌到胞外聚合物中的基質(zhì)蛋白。如植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum WCFS1）的223個胞外蛋白中166個蛋白通過錨定或共價結(jié)合的方式存在于細胞表面，57個蛋白被預(yù)測會被分泌到基質(zhì)中[42]。目前人們對基質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能的認識仍較少?；|(zhì)蛋白被認為可以促進細菌黏附和早期生物膜的積累，以及在胞外聚合物網(wǎng)絡(luò)中起支架作用，有利于生物膜的穩(wěn)定性[43]。此外，胞外聚合物中蛋白質(zhì)和碳水化合物的比例關(guān)系到生物膜的疏水性、表面活性、表面張力和附著效率等[44]。

3 乳酸菌生物膜形成的調(diào)控機制

細菌生物膜的形成離不開包括群體感應(yīng)、環(huán)二腺苷酸（cyclic-di-adenylate monophosphate，c-di-AMP）信號系統(tǒng)、環(huán)磷酸腺苷酸-受體蛋白（cAMP-CRP）信號系統(tǒng)等在內(nèi)的信號系統(tǒng)的調(diào)控[45]（見圖1）。在目前已有的報道中，群體感應(yīng)信號系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)參與了乳酸菌生物膜的形成和調(diào)控。乳酸菌作為革蘭氏陽性菌一般以自誘導(dǎo)肽和LuxS 蛋白催化合成的呋喃酮酰硼酸二酯（autoinducer-2，AI-2）作為信號分子[46]。在明串珠菌中，LuxS/AI-2群體感應(yīng)中pfs和luxS基因的表達與AI-2產(chǎn)量一致，且兩種基因的表達量和AI-2產(chǎn)量在生物膜細胞中均高于懸浮細胞的量[47]。在Gu等[48]的研究中，人工合成的AI-2提高了弗朗西斯乳桿菌的細胞密度，增強了細菌的凝聚力，并促進了生物膜的形成和對膽鹽的抗性[49]。外源添加的AI-2能夠改變植物乳桿菌細菌生長、形態(tài)表征、生物膜發(fā)育、EPS含量及相關(guān)基因表達，進而影響生物膜形成和環(huán)境耐受性。群體系統(tǒng)還被認為能夠調(diào)節(jié)乳酸菌的初始黏附能力，有益于提高乳酸菌的益生效果[50]。環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）為存在于細胞質(zhì)中的第二信使，被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控細菌生物膜的形成。一方面，當(dāng)細胞質(zhì)c-di-GMP濃度增加時，細菌的運動性受到抑制，轉(zhuǎn)變?yōu)榈瓦\動性或無活性，細菌的低運動性不僅有利于細胞對物料表面的附著，而且對生物膜的成熟也有重要作用[20]。另一方面，c-di-GMP的增加可導(dǎo)致胞外多糖合成基因的轉(zhuǎn)錄增加，進而促進生物膜的形成[51]。而c-di-GMP在乳酸菌生物膜形成中的作用的報道目前仍較少。Liu等[52]通過比較基因組和靶基因驗證的方法鑒定出假小鏈雙歧桿菌胞外多糖基因和c-di-GMP基因的產(chǎn)生和降解，表明c-di-GMP可以通過調(diào)節(jié)胞外多糖的產(chǎn)生來促進該菌生物膜的形成。He等[53]確認了嗜酸乳桿菌中c-di-GMP代謝的相關(guān)基因包括dgcA、pdeA、pdeB、nrnA、gtsA和gtsB，同時通過生物信息學(xué)和生化分析試驗證明了這些相關(guān)基因共同參與調(diào)節(jié)了嗜酸乳桿菌胞外聚合物的形成和共聚集。乳酸菌培養(yǎng)環(huán)境中的多個因素包括培養(yǎng)基中的碳源、金屬離子、pH、鹽濃度、溫度、二氧化碳濃度等也同樣會影響乳酸菌生物膜的形成[10，54-55]。此外，一些非信號系統(tǒng)相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)也能夠改變?nèi)樗峋锬さ男纬?。如白藜蘆醇可以改變副干酪乳桿菌表面的理化性質(zhì)，從而增強細胞的聚集，進而促進黏附和生物膜的形成[56]。5-羥色胺能夠促進屎腸球菌中群體感應(yīng)信號肽轉(zhuǎn)運，提高了一些黏附相關(guān)的蛋白豐度，提升了細胞自聚集能力和生物膜形成能力[57]。

4 乳酸菌與酵母菌的混菌生物膜形成及微生物間相互作用

在自然環(huán)境中，不同微生物多以群落形式共同生活在一起。在傳統(tǒng)發(fā)酵食品如白酒、醬油、食醋、豆瓣醬、奶酪等的生產(chǎn)過程中，豐富的營養(yǎng)和自然接種的開放式或半開放式的發(fā)酵方式為微生物復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)的形成和演變提供了基礎(chǔ)。同時，這些微生物群落總是以多物種生物膜的形式存在并發(fā)揮作用。混菌生物膜中可能存在物質(zhì)共享、營養(yǎng)交叉喂養(yǎng)、解毒作用、交叉呼吸、細胞外電子轉(zhuǎn)移和基因轉(zhuǎn)移等微生物間合作，以及剝削競爭和干擾競爭等競爭[58]。微生物間的競爭使得生物膜保持短暫的穩(wěn)定，隨著生物膜的發(fā)展，強競爭者占據(jù)生物膜的優(yōu)勢生態(tài)位，而弱競爭者將存活于一隅或被完全排除，或生物膜解體。在高細胞密度條件下，細胞間的合作有利于生物膜的形成，同時，一些混菌生物膜比單菌生物膜表現(xiàn)出對不利環(huán)境更高的適應(yīng)度[59]。乳酸菌同樣被發(fā)現(xiàn)能夠與酵母菌等真菌和細菌共同形成混菌生物膜。對乳酸菌與其他微生物的混菌生物膜形成、發(fā)展、特性和微生物間的相互作用的研究有利于加深人們對乳酸菌在食品發(fā)酵、人體健康中的作用的認識和控制有害微生物生物膜的形成。

酵母菌和乳酸菌均是被人們熟知且廣泛利用的微生物，在包括白酒大曲、辣椒醬、醬油、發(fā)酵魚等在內(nèi)的多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，酵母菌和乳酸菌被發(fā)現(xiàn)同時存在，并在驅(qū)動發(fā)酵的進行和風(fēng)味形成中發(fā)揮著重要作用[60]。此外，酵母菌與乳酸菌被報道能夠通過營養(yǎng)代謝產(chǎn)物交換（包括糖類、氨基酸、丙酮酸、維生素等）、群體感應(yīng)及生物膜包被等模式進行相互作用[61]。任曉鏷等[62]研究了5株釀酒酵母對6株乳桿菌（包括植物乳桿菌、類植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、副干酪乳桿菌（2株）和開菲爾乳桿菌）生物膜形成的影響，結(jié)果表明釀酒酵母菌對乳桿菌成膜有促進和抑制作用，具有菌株特異性。此外，釀酒酵母培養(yǎng)后無細胞上清液，被發(fā)現(xiàn)有益于乳酸乳球菌和植物乳桿菌聚集并形成生物膜的能力，促進益生菌生產(chǎn)乳酸，表明酵母的代謝物對乳酸菌成膜有積極影響[63]。早期的一些研究已經(jīng)表明酵母菌和乳酸菌可以形成混菌生物膜，而酵母菌和乳酸菌細胞間的直接接觸和聚集是混菌生物膜形成前期的關(guān)鍵[64]。如對于從福山壺醋中分離得到的植物乳桿菌和釀酒酵母，植物乳桿菌細胞通過細胞-細胞直接接觸黏附在酵母細胞上是混合物種生物膜形成過程中必要的一步[65]。而乳酸菌表面某種甘露糖特異性黏附蛋白與酵母菌表面的甘露聚糖結(jié)合被認為是黏附的主要促成因素。如Fu等[66]發(fā)現(xiàn)開菲爾乳桿菌的表面蛋白在與釀酒酵母的穩(wěn)定生物膜結(jié)合中起著重要作用，同時分子對接研究表明釀酒酵母表面的甘露聚糖與開菲爾乳桿菌表面的蛋白的疏水殘基結(jié)合。在Wada等[67]的研究中，顯微觀察結(jié)果表明含有甘露糖的酵母和含有甘露糖結(jié)合蛋白的乳酸菌形成了亞毫米大小的共聚集體，而缺乏相應(yīng)組成的酵母和/或乳酸菌菌株則彼此分散。相對而言，一些酵母菌細胞表面蛋白，如一種在清酒釀造過程中參與泡沫形成的糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨定蛋白Awa1p會抑制酵母細胞與植物乳桿菌之間的黏附，進而阻礙混菌生物膜的形成[68]。在非特異性黏附方面，較強的疏水性和較弱的Zeta電位貢獻了開菲爾中馬氏克魯維酵母較強的聚集能力，進而促進了馬氏克魯維酵母與開菲爾中乳酸菌的聚集和生物膜的形成，該過程被認為導(dǎo)致了開菲爾顆粒的初始形成[69]。一些乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖參與到乳酸菌誘導(dǎo)酵母在親水材料表面的聚集，如開菲爾中霍氏乳桿菌生成的葡聚糖，其大小和結(jié)構(gòu)不同于其他乳酸菌生成的葡聚糖[70]。在一些發(fā)酵過程中，乳酸菌和酵母菌混菌生物膜的形成也依賴于其他微生物，如在大曲發(fā)酵的前期階段，低淀粉酶活性的乳酸菌和釀酒酵母難以以浮游細胞的形式在富淀粉環(huán)境中存活，從而形成了一個混合物種的生物膜，并與強大的淀粉酶生產(chǎn)者如芽孢桿菌和根霉共存。在生物膜結(jié)構(gòu)方面，Hirayama等[71]對植物乳桿菌ML11-11和釀酒酵母的混菌生物膜進行觀察，發(fā)現(xiàn)混菌生物膜呈雙層結(jié)構(gòu)，植物乳桿菌ML11-11附著于培養(yǎng)基中的載物玻璃片表面構(gòu)成生物膜的底層，并通過直接接觸與釀酒酵母黏附實現(xiàn)酵母菌的固著，生物膜的上層則由ML11-11和酵母細胞以混合種群的形式占據(jù)。乳酸菌和酵母菌混菌生物膜的形成除有利于提高微生物在不利環(huán)境中的適應(yīng)度外，生物膜的高細胞密度能夠促進乳酸菌和酵母菌間的相互作用，如酵母的高酶活可為乳酸菌提供更豐富的養(yǎng)分，有利于乳酸菌生物量的提高[72]。此外，酵母有氧呼吸消耗發(fā)酵系統(tǒng)中的氧氣，缺氧環(huán)境促進乳酸菌產(chǎn)生胞外聚合物，進一步促進生物膜的形成[73]。

5 乳酸菌生物膜的特性

5.1 抗逆

與大多數(shù)細菌相同，當(dāng)面對不利環(huán)境脅迫時，乳酸菌也傾向于以生物膜的形式生存。如在Aoudia等[74]的研究中，植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌能夠在高濃度的膽汁和黏液中形成生物膜。乳酸菌生物膜被報道對乳酸菌耐受消毒劑（如乙醇、次氯酸鈉）、酸（如乙酸、檸檬酸、乳酸和蘋果酸）、堿、膽鹽、模擬人工胃腸液、抗生素（如恩諾沙星、磺胺嘧啶、四環(huán)素和土霉素）脅迫均有一定的保護作用[5，28，75]。這種保護作用被認為主要歸功于生物膜胞外聚合物屏蔽了有毒化合物、抗生素和酶等對被包埋細胞的侵害，有害物質(zhì)的擴散可被胞外聚合物阻礙，因此，位于生物膜深層的菌株可能獲得更好的保護。胞外聚合物的生物活性和數(shù)量被證實直接關(guān)系到乳酸菌的生存[55]。胞外多糖作為胞外聚合物重要組分之一，能夠在細胞周圍形成胞外網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提供保護屏障[76]。eDNA的存在被發(fā)現(xiàn)也可以保護生物膜內(nèi)乳酸菌細胞免受一些有害化學(xué)物質(zhì)如次氯酸鈉的損傷[77]。一些基因的表達關(guān)系到乳酸菌生物膜的形成及抗逆能力，如基因ftsH編碼AAA（ATPase associated with different cellular activities）家族中的FtsH蛋白，一種普遍存在的膜結(jié)合、ATP依賴性金屬蛋白酶，基因ftsH的表達缺乏使植物乳桿菌對升高的溫度和鹽濃度表現(xiàn)出顯著的敏感性，還降低了植物乳桿菌非生物表面形成生物膜的能力[78]。另有l(wèi)uxS基因在LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)中負責(zé)信號分子AI-2的合成，該基因的缺失降低了發(fā)酵乳桿菌生物膜中脂肪酸、胞外多糖、蛋白質(zhì)和eDNA的水平，降低了發(fā)酵乳桿菌生物膜的形成，并降低了發(fā)酵乳桿菌對酸、膽鹽、高溫和高滲環(huán)境的抵抗力[79]。在E等[80]的研究中，鉀離子增加了植物乳桿菌LIP-1中l(wèi)uxS基因的表達，增加了群體感應(yīng)信號AI-2的合成，促進了生物膜的形成，提高了凍干成活率。此外，在嗜熱鏈球菌分別與保加利亞桿菌、瑞士乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌和副干酪乳桿菌混合培養(yǎng)中，混菌生物膜的形成量明顯多于單一菌株生物膜[81]，更多的生物膜量有利于其對微生物的保護。而混菌生物膜內(nèi)菌株之間相互作用也有助于細菌抵抗升高的溫度、不適當(dāng)?shù)膒H值、滲透壓、金屬離子、抗生素和其他微生物。

5.2 抑菌

多數(shù)乳酸菌作為益生菌表現(xiàn)出對致病微生物和食品腐敗菌的抑菌活性，而這種抑菌活性大多建立在其生長代謝過程中產(chǎn)生的抗菌化合物如乳酸、H2O2、細菌素等的基礎(chǔ)上[82]。如Hossain等[83]收集并利用彎曲乳桿菌和植物乳桿菌的后生元抑制單核增生李斯特菌懸浮細胞的生長及其生物膜在食品表面上的污染，后生元中有機酸和細菌素發(fā)揮著抗菌作用。一些乳酸菌如鼠李糖乳桿菌和短乳桿菌可產(chǎn)生的糖脂類生物表面活性劑，其對有害菌的生長無抑制性，但可通過抑制細菌在物體表面的附著表現(xiàn)出強大的抗黏附和抗被膜能力[84]。植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等產(chǎn)生的脂磷壁酸能抑制糞腸桿菌生物膜的形成和破壞預(yù)先形成的生物膜[85]。近些年對乳酸菌生物膜的研究表明乳酸菌生物膜在抗菌方面的應(yīng)用同樣有較好的前景。如從巴西風(fēng)干牛肉上分離的乳酸乳球菌、米酒乳桿菌、彎曲乳桿菌等能夠生成保護性生物膜，并防止單核增生李斯特菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成[86]。從發(fā)酵魚和發(fā)酵雞肉中分離得到的戊球菌和屎腸球菌能夠聚集形成生物膜，防止蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和腸道沙門氏菌形成生物膜，同時自聚集率高的乳酸菌表現(xiàn)出更強的抑菌能力[27]。相比于乳酸菌懸浮細胞，生物膜的形成能夠增強乳酸菌的抑菌能力[87]。生物膜的形成可以阻止有害菌在表面的黏附和生物膜的形成，而一些乳酸菌生物膜可以捕獲有害菌懸浮細胞或成膜細胞進而控制或殺死有害菌[88]。在復(fù)雜的發(fā)酵環(huán)境中，生物膜的抗逆性能和穩(wěn)定性有利于乳酸菌持續(xù)性地發(fā)揮抑菌性能。此外，一些乳酸菌如嗜酸乳桿菌的細菌素產(chǎn)生與該菌生物膜形成有較強的相關(guān)性[89]。

6 乳酸菌生物膜在食品工業(yè)中的作用

長久以來，乳酸菌在食品發(fā)酵劑、口服菌劑、家畜養(yǎng)殖、細菌代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面的應(yīng)用大多不涉及生物膜的形成。而目前乳酸菌生物膜在抗菌、抗逆等方面的優(yōu)勢日益受到人們的重視，其在食品生產(chǎn)、人體健康中的潛力逐步被開發(fā)和利用。在復(fù)雜的發(fā)酵環(huán)境中生物膜的形成有利于乳酸菌對食品發(fā)酵進程的推動。乳酸菌生物膜在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用見表2。由表2可知，乳酸菌生物膜的高脅迫耐受性被用于提高乳酸菌在食品發(fā)酵中的環(huán)境適應(yīng)性，保證乳酸菌在復(fù)雜環(huán)境中較優(yōu)的生物量并發(fā)揮益生功能；乳酸菌生物膜的抗菌能力被用于減少或排除食品生產(chǎn)中的有害菌，保障食品的安全，也有助于延長食品的貯藏期，提高食品的安全性并延長其保質(zhì)期；乳酸菌生物膜被用作食品起始發(fā)酵劑，有利于延長微生物作為發(fā)酵劑的使用時間，也可能推動特征口感和風(fēng)味的形成。除了在食品發(fā)酵中的應(yīng)用外，乳酸菌生物膜在其他行業(yè)也發(fā)揮著積極作用。在食品安全方面，鼠李糖乳桿菌生物膜被發(fā)現(xiàn)能夠通過結(jié)合的方式去除牛奶中的黃曲霉毒素M1[90]。在疾病防治方面，羅伊氏乳桿菌生物膜在降低壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生率中發(fā)揮著抗菌和抗炎作用[91]。在污染防治方面，乳酸菌生物膜能夠去除鎘、鉛、鈷等重金屬[92]。

7 展望

目前，人們對乳酸菌的研究和應(yīng)用依然主要基于懸浮細胞的形式。而對乳酸菌生物膜有限的研究和了解使得部分學(xué)者借用細菌生物膜的形成和調(diào)控規(guī)律解析乳酸菌生物膜的形成機理和調(diào)控方法，這不利于人們認識和利用乳酸菌生物膜。同時，懸浮細胞的低細胞活力、表層細胞的脫離、生物膜成熟后的細胞釋放、不完全明了的調(diào)控機制和生物膜內(nèi)部受限的物質(zhì)擴散等限制了乳酸菌生物膜的應(yīng)用。而乳酸菌生物膜仍在優(yōu)化發(fā)酵食品生產(chǎn)、改善產(chǎn)品質(zhì)量和風(fēng)味、抑制有害微生物、生產(chǎn)高價值產(chǎn)物等方面有著重要的應(yīng)用前景。

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