中藥單體調(diào)控肌腱干細(xì)胞成骨分化促進(jìn)腱骨愈合的研究進(jìn)展*

楊 慶,汪小敏,楊超強(qiáng),王宜燦,康天泰,張虎林

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院,甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院北院骨科,甘肅 蘭州 730000)

隨著健身運(yùn)動(dòng)的普及,肌腱和韌帶損傷變得十分常見(jiàn)。肌腱和韌帶損傷位置廣泛,以肩袖(rotator cuff,RC)、髕腱和跟腱為主[1]。一般情況下,臨床對(duì)于RC和前交叉韌帶(anterior cruciate ligament,ACL)附著點(diǎn)的損傷常采用手術(shù)重建的方式進(jìn)行治療。該手術(shù)通常是通過(guò)以肌腱為移植物將其插入骨隧道中以促進(jìn)腱骨愈合。研究表明,RC修復(fù)術(shù)后和ACL重建術(shù)后平均再撕裂率分別為94%和11.7%[2-3];此外,腱骨愈合不良還會(huì)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)松弛、軟骨和半月板損傷及創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎等[4-6]。研究[7]表明,纖維軟骨區(qū)的再生對(duì)于腱骨愈合十分重要。腱骨愈合的機(jī)制十分復(fù)雜,目前尚未完全闡明,肌腱-骨連接處新骨的生成是評(píng)價(jià)其愈合的主要指標(biāo)。研究[8]表明,通過(guò)種植間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化可有效促進(jìn)腱骨愈合。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種存在于全身器官間質(zhì)和結(jié)締組織中的成體干細(xì)胞,具有自我修復(fù)和多向分化潛能。根據(jù)其來(lái)源可將其分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)、肌腱干細(xì)胞(tendon-derived stem cells, TDSCs)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSCs)、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial mesenchymal stem cells,SMSCs)。這些間充質(zhì)干細(xì)胞可以自我再生并潛在地分化為不同的細(xì)胞類(lèi)型,促進(jìn)組織修復(fù)和再生[9]。此前BMMSCs被認(rèn)為是促進(jìn)腱骨愈合的最佳種子細(xì)胞,但近來(lái)研究[10]表明TDSCs的增殖分化能力強(qiáng)于BMMSCs,比BMMSCs表現(xiàn)出更多成軟骨和成骨標(biāo)志物,經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)其成脂分化、成軟骨分化、成骨分化均強(qiáng)于BMMSCs。TDSCs成骨分化在促進(jìn)腱骨愈合方面表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢(shì),具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。筆者對(duì)中藥單體調(diào)控TDSCs成骨分化促進(jìn)腱骨愈合的研究進(jìn)行綜述,以期為臨床促進(jìn)腱骨愈合提供新的思路。

1 肌腱干細(xì)胞成骨分化促進(jìn)腱骨愈合

1.1 正常腱骨止點(diǎn)的解剖結(jié)構(gòu)及腱骨愈合過(guò)程

腱骨止點(diǎn)是連接肌腱和骨骼的獨(dú)特分層過(guò)渡組織,根據(jù)是否存在纖維軟骨層分為直接止點(diǎn)和間接止點(diǎn),兩者結(jié)構(gòu)、成分和機(jī)械性能完全不同[11-12]。直接止點(diǎn)存在纖維軟骨層,由肌腱/韌帶、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨和骨4種不同類(lèi)型的組織組成,如RC和前后交叉韌帶的腱骨界面。間接止點(diǎn)不存在纖維軟骨層,由致密的纖維組織將韌帶直接連接到骨膜,如內(nèi)側(cè)副韌帶腱骨界面[9]。腱骨愈合過(guò)程包括炎癥期、纖維增殖期、改造塑期3個(gè)階段[13-16]。早在1997年,有學(xué)者[17]構(gòu)建兔腱骨愈合模型,通過(guò)常規(guī)組織學(xué)和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原的免疫組織化學(xué)定位發(fā)現(xiàn),手術(shù)后1周可以在腱骨界面觀(guān)察到炎癥細(xì)胞,手術(shù)后2周可以在腱骨界面觀(guān)察到疤痕組織,手術(shù)后4周可以在腱骨界面觀(guān)察到疤痕組織重組形成的致密結(jié)締組織基質(zhì),手術(shù)后第6周可以在腱骨界面觀(guān)察到夏貝氏纖維。

1.2 TDSCs成骨分化促進(jìn)腱骨愈合研究進(jìn)展

肌腱是一種致密的結(jié)締組織,通常呈索狀或膜狀,位于肌肉末端與骨骼連接處,主要由腱纖維構(gòu)成,主要作用為連接骨骼和肌肉引起關(guān)節(jié)活動(dòng)。由于肌腱屬于低細(xì)胞密度、低血管組織,其損傷后愈合效果較差[18]。TDSCs來(lái)源于肌腱,由Bi等[19]于2007年首次在離體組織分離獲得。TDSCs外形呈鵝卵石形,較普通的腱鞘細(xì)胞體積更小、細(xì)胞核更大[20]。Zhang等[20]研究表明,TDSCs體外可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞,在體內(nèi)也能夠形成類(lèi)似于肌腱、軟骨或骨組織樣結(jié)構(gòu)。在腱骨愈合纖維增殖期,M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子招募間充質(zhì)干細(xì)胞,促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至損傷部位;M2型巨噬細(xì)胞則促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和定向成骨分化[21]。除此之外,巨噬細(xì)胞分泌的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)對(duì)TDSCs具有分化誘導(dǎo)活性,能誘導(dǎo)TDSCs細(xì)胞成骨分化、成脂分化及成軟骨分化,進(jìn)而促進(jìn)腱骨愈合[22]。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn),前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶b(protein kinase b,Akt)信號(hào)通路誘導(dǎo)BMP-2信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)表達(dá),BMP-2隨后激活Smad蛋白(small mothers against decapentaplegic,Smad)磷酸化,誘導(dǎo)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor-2,Runx2)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)表達(dá)促進(jìn)TDSCs成骨分化。綜上可知,TDSCs成骨分化能促進(jìn)腱骨愈合。

2 中醫(yī)學(xué)對(duì)腱骨愈合的認(rèn)識(shí)

腱骨愈合屬中醫(yī)學(xué)“筋骨病”范疇,其病位在筋和骨。廣義的筋是指筋膜、肌腱、韌帶、關(guān)節(jié)軟骨盤(pán)、腱鞘等軟組織。筋與骨共同構(gòu)成關(guān)節(jié),從而約束骨骼,主司關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)?！端貑?wèn)·痿論篇》曰:“宗筋主束骨而利機(jī)關(guān)也?！敝嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為,筋骨病的病因主要有外因和內(nèi)因兩類(lèi),外因主要為外力傷害和外感六淫,內(nèi)因則與年老體虛、慢性勞損、肝腎虧虛等密切相關(guān)?！吨T病源候論》曰:“肝主筋而藏血,腎主骨而生髓,虛勞損血耗髓,故傷筋骨也。”肝藏血,在體和筋。肝血濡養(yǎng)全身筋脈,肝血充足則筋強(qiáng),運(yùn)動(dòng)靈活有力。若肝血不足,筋失濡養(yǎng),則筋骨運(yùn)動(dòng)能力減退。腎在體和骨,生髓。腎精生髓而充骨,腎精充足則骨強(qiáng)。若腎精不足,則骨髓失養(yǎng),骨失所養(yǎng)易發(fā)生骨病。因此,中醫(yī)學(xué)治療筋骨病注重“筋骨并重”,常以滋補(bǔ)肝腎為治則。如:沈錦濤[24]基于“筋骨并重”理論,以滋補(bǔ)肝腎為治則,采用中藥續(xù)斷治療兔前交叉韌帶重建術(shù)后模型,證明中藥續(xù)斷可以增加腱骨愈合界面骨小梁數(shù)量,提高骨密度,促進(jìn)成纖維細(xì)胞和夏貝氏纖維增加,促進(jìn)成骨,從而促進(jìn)腱骨愈合;楊偉毅等[25]構(gòu)建兔前交叉韌帶重建術(shù)后模型,將其分為溫補(bǔ)腎陽(yáng)組、空白對(duì)照組、滋補(bǔ)腎陰組,采用中藥干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),滋補(bǔ)腎陰組腱骨愈合界面成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和膠原纖維增殖優(yōu)于溫補(bǔ)腎陽(yáng)組和空白對(duì)照組,得出補(bǔ)腎中藥可以促進(jìn)腱骨愈合。以上研究從組織學(xué)角度探討了腱骨愈合機(jī)制,但其相關(guān)信號(hào)通路及作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

3 中藥單體調(diào)控TDSCs促進(jìn)成骨分化

現(xiàn)有研究表明,中藥單體促進(jìn)TDSCs成骨分化進(jìn)而促進(jìn)腱骨愈合主要通過(guò)促進(jìn)成骨因子的表達(dá),調(diào)控β-連環(huán)素(β-catenin)信號(hào)通路、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路,誘導(dǎo)TDSCs成骨分化,從而促進(jìn)腱骨愈合。Runx2是一種成骨轉(zhuǎn)錄因子,是細(xì)胞成骨分化的早期標(biāo)志。OCN是Runx2下游基因,由成骨細(xì)胞表達(dá),是細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的標(biāo)志。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)與骨的鈣化密切相關(guān)。黃芩素又名黃芪苷元,是黃芩的主要有效成分之一。江華基等[26]通過(guò)建立大鼠關(guān)節(jié)外骨隧道-游離肌腱移植模型,發(fā)現(xiàn)黃芩素能通過(guò)促進(jìn)TDSCs ALP分泌和礦化,以及Runx2、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(osterix,OSX)、OCN、Ⅰ型膠原蛋白α1 (collagen type I alpha 1,Col1α1)表達(dá),誘導(dǎo)TDSCs成骨分化,進(jìn)而促進(jìn)腱骨愈合。同時(shí),蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示,黃芩素能夠促進(jìn)TDSCs β-catenin蛋白的表達(dá),使用Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑分泌型蛋白Dickkopf-1可以顯著抑制黃芩素的促成骨作用,由此推斷黃芩素可以通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)TDSCs成骨分化,進(jìn)而促進(jìn)腱骨愈合,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究[26]。骨碎補(bǔ)總黃酮是黃酮類(lèi)化合物,是中藥骨碎補(bǔ)干燥根莖的主要有效成分之一。張新濤等[27]通過(guò)大鼠關(guān)節(jié)外骨隧道-游離肌腱移植造模發(fā)現(xiàn),大鼠跟腱干細(xì)胞經(jīng)骨碎補(bǔ)總黃酮處理后,成骨因子Runx2、OCN及ALP、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)增加,mTOR信號(hào)通路標(biāo)記物磷酸化核糖體蛋白S6在TDSCs中增多,磷酸化真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1減少,進(jìn)而誘導(dǎo)TDSCs成骨和成血管,最終促進(jìn)腱骨愈合。此結(jié)果表明,骨碎補(bǔ)總黃酮調(diào)控TDSCs成骨分化進(jìn)而促進(jìn)腱骨愈合與mTOR信號(hào)通路密切相關(guān)。然而,該實(shí)驗(yàn)存在局限性,未完全明確骨碎補(bǔ)總黃酮調(diào)控TDSCs mTOR信號(hào)通路促進(jìn)腱骨愈合的機(jī)制,且實(shí)驗(yàn)所用強(qiáng)骨膠囊含有多種成分,可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏倚。三七總皂苷是三七的主要活性物質(zhì)。史友剛等[28]通過(guò)ALP染色、茜素紅染色觀(guān)察及對(duì)Runx2、Osx mRNA、β-catenin蛋白表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn):在三七總皂苷的干預(yù)下,Runx2、Osx mRNA、β-catenin蛋白表達(dá)量的表達(dá)量均增加;此外,三七總皂苷對(duì)TDSCs的促增殖和成骨分化作用與其質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān),以100 mg/L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為較佳。此結(jié)果表明,三七總皂苷體外誘導(dǎo)TDSCs向成骨細(xì)胞定向分化可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。劉曉華等[29]在前期實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí),三七總皂苷可提高重建ACL腱骨愈合處成骨能力,機(jī)制可能與TDSCs成骨分化有關(guān);研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),三七總皂苷能促進(jìn)TDSCs成骨標(biāo)志物骨ALP表達(dá)量增加,增強(qiáng)裸鼠皮下異位成骨能力。綜上,三七總皂苷可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)TDSCs成骨分化,進(jìn)而促進(jìn)腱骨愈合。白黎蘆醇是虎杖的干燥根莖提取物,具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎和抗分解代謝特性,有治療骨質(zhì)疏松癥和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)骨丟失的潛力[30]。王文等[31]從髕腱組織中分離TDSCs進(jìn)行體外培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能夠抑制β-catenin蛋白表達(dá),誘導(dǎo)成骨因子Runx2、OCN表達(dá),促進(jìn)TDSCs礦鹽沉積,進(jìn)而促進(jìn)TDSCs的成骨分化,得出白藜蘆醇可以體外誘導(dǎo)并促進(jìn)人肌腱干細(xì)胞的成骨分化,可能通過(guò)調(diào)節(jié)β-catenin信號(hào)通路來(lái)調(diào)控。小白菊內(nèi)酯是一種倍半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物,具有多種藥理活性,一般由木蘭科或菊科植物提取。周倩等[32]研究表明,小白菊內(nèi)酯在和花木蘭葉片中含量最高,厚樸葉片次之。厚樸作為傳統(tǒng)中藥,在提取小白菊內(nèi)酯方面有天然優(yōu)勢(shì)。腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。李知玻等[33]研究表明,TNF-α能抑制成骨細(xì)胞生長(zhǎng)。許華亮等[34]研究發(fā)現(xiàn),小白菊內(nèi)酯可以抑制TDSCs被TNF-α刺激后NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p65的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)Runx2和下游基因OCN的表達(dá),表明小白菊內(nèi)酯可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)途徑和炎癥反應(yīng)促進(jìn)TDSCs成骨分化。由此可知,小白菊內(nèi)酯可能是促進(jìn)TDSCs成骨分化進(jìn)而促進(jìn)腱骨愈合的潛在有效中藥單體。

4 小 結(jié)

綜上所述,TDSCs成骨分化對(duì)促進(jìn)腱骨愈合有重要意義。我國(guó)中藥種類(lèi)繁多,質(zhì)量?jī)?yōu)良,具有簡(jiǎn)、便、廉、效等特點(diǎn)。近年來(lái)隨著研究的不斷深入,越來(lái)越多的證據(jù)表明中藥單體在促進(jìn)TDSCs成骨分化進(jìn)而促進(jìn)腱骨愈合方面具有巨大的應(yīng)用前景,其主要通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路及提高成骨因子的表達(dá)促進(jìn)TDSCs成骨分化達(dá)到腱骨愈合的目的。但由于TDSCs成骨分化機(jī)制復(fù)雜,中藥單體調(diào)控TDSCs成骨分化的確切機(jī)制尚未完全清楚,有待臨床進(jìn)一步深入研究。除此以外,中藥單體調(diào)控TDSCs成骨分化促進(jìn)腱骨愈合的研究較少,且實(shí)驗(yàn)多為體外細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物造模較少,缺乏大量臨床觀(guān)察研究,有待進(jìn)一步深入研究。因此,今后當(dāng)利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù),從多信號(hào)通路、多基因、多靶點(diǎn)等方面進(jìn)一步深入研究中藥單體調(diào)控TDSCs成骨分化促進(jìn)腱骨愈合的機(jī)制,挖掘出更多有效中藥單體,以促進(jìn)臨床腱骨愈合。