微生物加固研究可視化試驗系統(tǒng)的開發(fā)與應用

李俊 何想 張瑾璇 趙常 肖楊 劉漢龍

DOI：?10.11835/j.issn.2096-6717.2023.007

基金項目：國家自然科學基金（52078085）；重慶英才計劃優(yōu)秀科學家項目（cstc2021ycjh-bgzxm0051）

作者簡介：李俊（1998-?），男，主要從事微生物固化技術與土體改良研究，E-mail：lijuncqu03@163.com。

通信作者：何想（通信作者），男，博士，E-mail：medihe@163.com。

Received： 2022?11?02

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （No. 52078085）; Chongqing Talents Program （No. cstc2021ycjh-bgzxm0051）

Author brief： LI Jun （1998-?）， main research interests： bio-stabilization and soil improvement， E-mail： lijuncqu03@163.com.

corresponding author：HE Xiang （corresponding author），?PhD，?E-mail：?medihe@163.com.

（1. 重慶大學?土木工程學院，重慶?400045；?2. 南洋理工大學?土木與環(huán)境學院，新加坡?639798）

摘要：微生物加固是近十幾年來興起的綠色低碳建筑技術，在地基處理、邊坡治理、混凝土裂縫修復等方面具有較好的應用前景。微生物加固涉及復雜的生物-物理-化學動態(tài)過程，需要開發(fā)實時可視化系統(tǒng)對其反應機理和加固機制進行研究。分析微生物加固可視化系統(tǒng)研發(fā)的必要性，提出微生物加固可視化試驗系統(tǒng)由溶液輸送系統(tǒng)、微反應器、觀測系統(tǒng)、環(huán)境控制及監(jiān)測系統(tǒng)組成的主要構(gòu)造思路，其中溶液輸送系統(tǒng)用于進樣和控制流場邊界條件，微反應器作為反應模具，觀測系統(tǒng)用于反應過程的實時觀測，環(huán)境控制及監(jiān)測系統(tǒng)用于控制溫度、光照等外部環(huán)境條件并獲取流體壓力等反饋數(shù)據(jù)。研究以圖像處理為主，輔以環(huán)境監(jiān)測的試驗數(shù)據(jù)獲取方法，提出相應的試驗結(jié)果分析方法。結(jié)果表明：微生物加固可視化系統(tǒng)既能直接獲取加固過程圖像和滲透壓力變化數(shù)據(jù)，亦能與掃描電鏡等微觀試驗手段相結(jié)合進行材料表征和微觀力學特性分析；開發(fā)的試驗系統(tǒng)能用于微生物加固的微觀實時研究，為微生物加固微觀機制研究提供了新的手段，有利于揭示微生物加固機理。

關鍵詞：微生物加固；試驗系統(tǒng)；生物礦化；微生物誘導碳酸鈣沉淀；微流控

中圖分類號：TU415 ????文獻標志碼：A ????文章編號：2096-6717（2024）03-0073-07

Development and application of visualization test system for biocementation

LI Jun¹，?HE Xiang^1，2，?ZHANG Jinxuan¹，?ZHAO Chang¹，?XIAO Yang¹，?LIU Hanlong¹

（1. School of Civil Engineering， Chongqing University， Chongqing 400045， P. R. China；?2. School of Civil and Environmental Engineering， Nanyang Technological University， Singapore 639789， Singapore）

Abstract： Biocementation is a green and low-carbon building technique that has emerged in recent decades. It shows promising prospects in foundation treatment， slope treatment， and concrete crack repair. Biocementation involves complex bio-physical-chemical dynamic processes， requiring developing a real-time visualization system to figure out the regimes of reaction and reinforcement. The necessity of developing the visualization system for biocementation is analyzed. A framework of the visualization test system is established for biocementation， composing of a solution transport system， microreactor， observation system， as well as environmental control and monitoring system. The solution transport system is used for solution delivery and fixing of boundary conditions. The microreactor is used as a mold for reaction. The observation system is used to visualize the reaction process. The environmental control and monitoring system is used to control the environmental conditions such as temperature and light and also collect the feedback data including fluid pressure. The methods for test data acquisition are based on image processing associated with the data logged by the environmental monitors. Analytical approaches are also proposed to deal with the test data. Results show that the biocementation visualization system can not only directly obtain the image of the reinforcement process and the data of the osmotic pressure change， but also be combined with microscopic test methods such as scanning electron microscopy for material characterization and micro-mechanical characteristics analysis. It can be used for microscopic real-time research of biocementation， providing a new method for study of the microscopic mechanism of biocementation， which is conducive to revealing the mechanism of biocementation.

Keywords： biocementation；?test system；?biomineralization；?microbially-induced carbonate precipitation；?microfluidics

微生物加固是利用微生物新陳代謝作用過程或作用產(chǎn)物實現(xiàn)建筑、巖土地質(zhì)等材料工程性能改善的一系列工程技術總稱^[1]。作為近十幾年來興起的新技術，微生物加固與傳統(tǒng)加固技術存在顯著差異。從全壽命周期的角度來分析，相校于化學注漿、水泥等為代表的傳統(tǒng)加固技術，微生物加固在能量消耗、碳排放量及環(huán)境保護等方面較具優(yōu)勢^[2]。在全球氣候變暖及能源危機日益嚴峻的時代背景下，微生物加固技術符合長遠的發(fā)展趨勢，有望引領下一代工程加固技術，成為目前的研究熱點^[3-4]。

微生物加固技術按照作用途徑不同可分為微生物產(chǎn)氣^[5]、微生物礦化^[6]、微生物膜^[7-8]等。微生物礦化因其同時具備膠結(jié)土體、填充孔隙的能力，在邊坡防止侵蝕、地基防液化、地基防滲等工程案例^[9-11]中，顯示了良好的應用前景。總體說來，目前大部分研究基于傳統(tǒng)的力學及土木工程的知識體系，著重于探究加固前后材料工程力學特性的變化，并分析其影響因素，如飽和度^[12]、顆粒粒徑^[13]、纖維改性等^[14-15]。然而，微生物礦化加固涉及礦物材料的結(jié)晶、生長、沉積，多孔介質(zhì)中遷移等一系列復雜的生物-物理-化學動態(tài)過程，傳統(tǒng)的力學和土木工程學科的研究對象主要以靜態(tài)體的形式存在，無法捕捉動態(tài)反應過程揭示礦化加固的演化規(guī)律^[16]，而微生物礦化加固的演化規(guī)律對于探明礦化機理及加固機制具有重要的基礎理論意義^[17-18]。

可視化是生物、物理等學科的主要研究手段之一，也是巖土工程試驗研究領域的重要分支。早在20世紀90年代，有學者制備了可視化靜力觸探儀^[19]。21世紀初，Iskander等^[20-21]研發(fā)了透明土系統(tǒng)用于研究巖土工程中的應力和滲流問題，此后以數(shù)字圖像相關（DIC）和粒子圖像測速度（PIV）為基礎的巖土可視化技術大量用于研究各類巖土工程問題^[22]。然而，該技術并不能研究包含礦物生長等化學問題在內(nèi)的微生物加固研究。針對化學過程研究，20世紀有學者提出了微分析系統(tǒng)（μTAS）^[23]，通過將化學分析儀器微型化以達到反應更可控、檢測更便捷的目的，并由此發(fā)展了微流控技術^[24]。微流控技術的獨特優(yōu)點在于對于反應流體的可控性，此外由于反應腔室或管道常由石英、有機樹脂等透明材料制備形成^[25-26]，因此，通過常規(guī)的光學儀器即能觀測整個反應過程，適宜于礦物晶體的生長研究。將微流控技術應用于微生物加固試驗研究近年來逐漸成為研究熱門，相關成果不斷出現(xiàn)。

Wang等^[18]利用微流控技術研究了細菌的分布和碳酸鈣晶體的生長過程。何想等^[16]采用微流控技術研究了微生物加固過程中孔隙間碳酸鈣的膠結(jié)行為，并對顆粒尺度的碳酸鈣生長進行了量化^[17]。Xiao等^[27]研究了微生物礦化的動力學特性，分析了濃度、細菌分布等因素對晶體生長行為的影響^[28]。鑒于可視化試驗系統(tǒng)對于研究微生物加固機制的重要性，筆者在微流控技術的基礎上結(jié)合微生物加固的特點，自主研發(fā)了一套微生物加固可視化試驗系統(tǒng)^[27-28]，介紹系統(tǒng)的基本組成單元，簡述相應的分析方法，分析礦物膠結(jié)加固機理，為微生物加固技術的優(yōu)化及推廣應用提供基礎。

1 可視化系統(tǒng)組成

注漿法是微生物礦化加固技術中最主要的施工方法。注漿溶液通常分為兩種，分別為微生物/酶懸浮液和反應液（如尿素和氯化鈣混合液）^[29]。加固時將兩種溶液混合或先后注入待加固巖土體，隨后發(fā)生礦化反應生成礦物沉淀。室內(nèi)微生物加固試樣制備裝置通常包括蠕動泵、裝樣模具、溶液收集瓶等，其中蠕動泵用于輸送液體，裝樣模具為反應容器，溶液收集瓶為注漿溶液儲存收集器^[30]。此外，若需研究溫度、濕度的影響還需要溫控箱等環(huán)境控制設備并對溫度、壓力等環(huán)境參數(shù)進行監(jiān)測^[31]。借鑒室內(nèi)微生物加固試樣制備裝置，微生物礦化加固微型化系統(tǒng)需要包括溶液儲存、輸送設備及反應器，而為實現(xiàn)可視化還需要配備觀測設備。依據(jù)上述分析，將微生物加固可視化系統(tǒng)分為4個子系統(tǒng)，分別為溶液輸送系統(tǒng)、微反應系統(tǒng)、觀測系統(tǒng)、環(huán)境控制及監(jiān)測系統(tǒng)^[16]。

1.1 溶液輸送系統(tǒng)

溶液輸送系統(tǒng)主要由注射泵、注射器、導管、接頭組成，如圖1所示。由于微反應器所需的溶液量較少，因而注射泵要求的精度較高，通常為mL～μL量級。采用的為Harvard注射泵，精度可達1.28 pL/min。注射器需要較大的剛度且量程應與注射泵匹配，通常采用高硼硅玻璃制成，如采用Hamilton注射器。導管用于連接注射器和微反應器及廢液收集瓶，為防止導管接口處漏液，導管的兩端需先與接頭相聯(lián)。接頭的類型與所連接的裝置有關，如用于連接注射器的魯爾接頭，連接壓力傳感器的三通接頭及連接微反應器的鋼接頭等。需要指出的是，若導管的剛度足夠大，則無須使用鋼接頭。

1.2 微反應系統(tǒng)

微反應系統(tǒng)又被稱為微流控芯片，是微生物加固可視化系統(tǒng)的核心組成之一，也是研制流程最為復雜的子系統(tǒng)，其制備材料、結(jié)構(gòu)與所研究的具體問題有關。一般在常溫常壓的研究問題中，微反應系統(tǒng)的制備材料為硅膠/脂，如聚二甲基硅氧烷（PDMS），一方面由于其加工工藝成熟，另一方面因其透光率較高，如PDMS的透光率超過95%。然而，PDMS為彈性材料，容易變形，不適用于高壓問題研究。對于高壓問題，常使用二氧化硅制備微反應器。鑒于PDMS材料的微反應器應用最為廣泛，下面將以PDMS微反應器為例，介紹相應的制備方法。

未固化的PDMS為高黏度流塑狀液體，經(jīng)過熱固化后變成固態(tài)透明體，因而，可通過倒模法制備不同結(jié)構(gòu)的微反應器。簡單來說，制備PDMS的流程為倒模、固化、打孔、膠合4步。倒模是指將主劑和固化劑按一定比例（如10：1）充分混合除氣后導入模具中；固化指將模具及PDMS置于高溫條件下養(yǎng)護（如置于85 ℃的烘箱中養(yǎng)護2 h）；打孔是指將固化后的PDMS脫模并把含有管道結(jié)構(gòu)的區(qū)域切割出來，然后在預定的位置處用打孔器按壓打孔；膠合指將PDMS或玻璃片待膠合的面朝上進行等離子清洗，處理30～90 s后將待膠合面貼好并壓緊，等待1～2 min后，PDMS結(jié)構(gòu)與待膠合面將緊緊黏合。制備好的微反應器為包含連接導管的孔洞及內(nèi)部的管道/腔室（反應容器）在內(nèi)的微型立體結(jié)構(gòu)。圖2為Y形PDMS微流控芯片。

微反應器的管道結(jié)構(gòu)按拓撲形態(tài)可分為均質(zhì)多孔介質(zhì)、非均質(zhì)多孔介質(zhì)、填砂管道、晶體旅館等，而按照功能又可分為混合、擴散、液滴、篩選等結(jié)構(gòu)。根據(jù)上述管道制備步驟可知，管道機構(gòu)主要由模具決定，因而制備具有特定結(jié)構(gòu)的微反應器的前提是與之匹配的模具。初始模板通常由多層材料構(gòu)成，其基底材料為單晶硅，上面為二氧化硅層、光刻膠層或樹脂層等。模具的生產(chǎn)就是將特定結(jié)構(gòu)雕刻在初始模板上，模具生產(chǎn)工藝較多，包括軟蝕刻、光蝕刻、激光雕刻等。其中，光蝕刻具有加工精度高的特點，通常為制備模具的首選工藝。在光蝕刻技術中首先需要采用設計軟件（如Auto CAD等）設計需要的管道結(jié)構(gòu)圖形，并將其打印到掩膜板上。隨后把掩膜板置于初始模板的上方，紫外光通過掩模板和透鏡，把圖形投射到初始模板上，然后經(jīng)過一系列顯隱和刻蝕工藝將掩膜板上的圖形按一定比例大小復刻到模板上，得到微反應器模具。一般而言，微反應器模具為陽模，其管道結(jié)構(gòu)部分向上凸出，因此管道的深度由模具中管道結(jié)構(gòu)凸出的高度決定。在制備過程中管道結(jié)構(gòu)的凸出高度主要由初始模板光刻膠的厚度決定，當然顯隱及刻蝕工藝也會對精度產(chǎn)生一定的影響?？傮w說來，模具的制備是微反應系統(tǒng)制備過程中最關鍵和復雜的一部分，需要專業(yè)的技術人員，對于非精密加工/芯片加工技術出身的研究者具有一定的技術壁壘，但是由于微芯片技術的發(fā)展，目前市面上已有相關商業(yè)化公司可提供模具代加工服務，并且制備的精度可達1～2 μm，能夠滿足制備微反應器的需要。

1.3 觀測系統(tǒng)

觀測系統(tǒng)的主要作用是獲取反應過程的原始數(shù)字圖像，其主要設備包括觀測平臺、鏡頭、照相機及數(shù)據(jù)存儲器。由于微反應系統(tǒng)尺寸較小，需要經(jīng)過放大才能得到便于研究的圖像，因此，觀測系統(tǒng)配備的通常為放大鏡頭。觀測系統(tǒng)可以通過購買相應的設備進行搭建，亦可使用現(xiàn)有商業(yè)化設備，如以光學顯微鏡為基礎的各類顯微成像系統(tǒng)。圖像的質(zhì)量如清晰度、分辨率等主要受照相機和光源的影響，因而照相機也是觀測系統(tǒng)中成本最高的設備。若采用的相機相同，對于自行搭設系統(tǒng)，通常選擇的自由度高（如可使用光學支架和LED無影光源等），相對較為便宜，但是需要花費較多時間調(diào)試；而專業(yè)顯微成像系統(tǒng)集成度較高（如光源、鏡頭、載物臺等均安裝在一臺設備上），成本較高，購置方便，設備基本無須調(diào)試，且設備認可度較高。然而，值得注意的是，專業(yè)顯微成像系統(tǒng)種類較多，如從顯微鏡的物鏡和照明系統(tǒng)的相對位置來看可分為正置、倒置顯微鏡，從研究對象來看可分為生物和金相顯微鏡，而從照明光線來看可分為明場、暗場、相差、偏光等類型。對于微生物礦化研究而言，存在觀測細菌的需要，因而一般使用生物熒光顯微鏡，同時具有相差功能。此外，由于微反應系統(tǒng)安裝在觀測系統(tǒng)上，顯微鏡載物臺上需要較大的工作空間，采用倒置顯微鏡較為適宜。根據(jù)上述分析可知，帶相差的倒置生物熒光顯微鏡較適合微生物加固可視化觀測系統(tǒng)，圖3顯示了奧林巴斯倒置熒光顯微鏡及熒光場下觀測到的砂顆粒和微生物

1.4 環(huán)境控制及監(jiān)測系統(tǒng)

微生物加固可視化系統(tǒng)中的環(huán)境控制主要包括環(huán)境光、壓力、溫度的控制。環(huán)境光會影響觀測結(jié)果，因而微生物加固系統(tǒng)需要單獨的密閉空間，實現(xiàn)環(huán)境光隔絕。此外，該密閉空間還需具備隔熱功能，防止其與外界空間進行熱交換改變試驗溫度。

微生物礦化加固常以注漿的形式進行施工，加固過程中生成的礦物將顆粒間的孔隙膠結(jié)堵塞，從而導致滲透系數(shù)降低。在達西定律中，巖土體的滲透系數(shù)可通過測量水頭差、流量和滲透路徑得到。微反應系統(tǒng)中的流量可由溶液輸送系統(tǒng)中的精密注射泵進行測量，滲透路徑即反應器中反應區(qū)域溶液流入口和流出口之間的距離，而水頭差為流入口和流出口之間的壓力差，因而可在溶液流入口和流出口處布置壓力傳感器測量壓力差。

溫度對微生物礦化過程有較大影響，試驗過程中需要對環(huán)境溫度進行控制的設備包括注射器和微反應器。溫度控制的方式有兩種，其一是控制加固系統(tǒng)密閉空間的溫度，并通過監(jiān)測環(huán)境溫度提供反饋實現(xiàn)對反應溫度的控制；其二是通過在注射器和微反應器上粘貼柔性加熱板/降溫板，通過溫度控制器實現(xiàn)升溫或降溫，達到溫度控制的目的。其中，前者配置較為簡單，但使用時需考慮升/降溫時溫度的滯后效應，后者溫控滯后效應較弱但配置復雜，需要自行制備相應的加熱/降溫板。圖4為筆者使用的溫控儀及壓力傳感器。

2 試驗后處理與結(jié)果分析

2.1 試驗后處理

宏觀微生物加固研究中試樣制備完成后需要脫模取出加固后試樣，并開展一系列單軸、三軸、壓縮、滲透等室內(nèi)試驗評估加固體的工程特性。在微生物加固可視化研究中，礦物的分布特性及生成量可通過圖像識別和處理進行衡量評估，加固過程中滲透系數(shù)的變化亦可由流入口和流出口的壓力差計算得到，而加固體的表面微觀形貌、微觀力學特性、晶體類型等性質(zhì)無法從可視化觀測系統(tǒng)中直接獲得。與宏觀試驗類似，對于表征微反應器中加固體的微細觀特性，需要將其從微反應器中脫模取出。加固體的脫模為微生物加固可視化試驗最主要的后處理步驟。二氧化硅微反應器通過將二氧化硅熔融膠結(jié)，較難取出加固體，而其他通過表面等離子處理膠結(jié)的微反應器均較容易將管道揭開取出加固體。如可將利用PDMS制備的微反應器浸泡在乙醇中，4～5 h后便能將膠合的結(jié)構(gòu)分開，隨后可用精密尖頭鑷子將加固體從管道中取出。當加固體礦物含量較高時，取出的加固體仍能保持完整，可進行后續(xù)微觀強度試驗；若加固體礦物含量較低，則需要在顯微鏡下選出膠結(jié)的顆粒，進行力學試驗。

2.2 試驗結(jié)果分析

微生物加固可視化試驗結(jié)果包括兩部分：一部分是試驗過程中觀測到的加固過程圖像；另一部分則為試驗完成后對取出的加固體開展的一系列微細觀試驗。因此，微生物加固可視化試驗結(jié)果分析主要為加固圖像的處理分析和加固體其他微觀試驗結(jié)果分析。

對于加固過程圖像的分析，首先需要對原始圖像進行處理，通過比較反應前后圖像之間的差異（如圖5所示），采用圖像識別方法對圖像中的礦物進行識別，隨后對礦物的大小、數(shù)量、形狀等參數(shù)進行測量和統(tǒng)計得到試驗原始數(shù)據(jù)。在此基礎上，根據(jù)這些原始數(shù)據(jù)，可分析出不同因素下礦物的顆粒粒徑分布隨時間的演化圖和概率分布圖，以及礦物的統(tǒng)計平均生長速率、分布狀態(tài)等。從而得到礦物加固過程中的生長規(guī)律。

對于取出的加固體，可開展的微細觀試驗包括XRD、拉曼、電鏡、微/納米壓痕、CT等。具體來說，通過電鏡可得到礦物表面的微觀形貌，從而分析礦物在分子尺度的生長規(guī)律；通過XRD可測定加固體的礦物成分，確定微生物加固后生成的具體礦物類型；通過拉曼光譜可分析出不同的晶型，如碳酸鈣礦物中的球霰石、方解石和文石；通過微/納米壓痕可測定礦物、巖土體及礦物和巖土顆粒膠結(jié)處的硬度和模量，并以此為基礎評估不同礦物形貌微觀模量的差別；通過微型拉壓加載設備可測量膠結(jié)體之間的應力、應變和強度，為基于加固體的微觀膠結(jié)的模擬（如離散元模擬）提供相應的物理參數(shù)；此外，還可采用微納CT對其三維結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)分析，研究礦物的沉積模式等。

3 結(jié)論

微生物加固是巖土工程領域的新興加固技術，涉及復雜的生物-物理-化學動態(tài)過程，目前存在較多的問題有待解決，開發(fā)可視化試驗系統(tǒng)可對該動態(tài)過程從微觀角度進行實時研究，對探究加固機理具有重要的意義。通過模擬宏觀試驗方法，研制了微生物加固可視化試驗系統(tǒng)，介紹了系統(tǒng)的主要組成部分，試驗結(jié)果處理和分析方法，得到以下結(jié)論：

1）微生物加固可視化試驗系統(tǒng)主要由4部分構(gòu)成，分別為溶液輸送系統(tǒng)、微反應系統(tǒng)、觀測系統(tǒng)、環(huán)境控制及監(jiān)測系統(tǒng)，其中溶液輸送系統(tǒng)與宏觀試驗中注漿設備對應；微反應系統(tǒng)與制樣模具對應；觀測系統(tǒng)、環(huán)境控制及監(jiān)測系統(tǒng)與室內(nèi)試驗儀器對應。

2）微生物加固可視化系統(tǒng)不僅能夠獲取直接試驗數(shù)據(jù)，還可制備微尺寸加固試樣開展后續(xù)試驗。微生物加固可視化試驗結(jié)果分析包括兩部分，既包括對直接獲取的圖像、壓力值的研究，也包括后續(xù)開展的加固體微觀試驗結(jié)果解析。

3）微生物加固可視化系統(tǒng)可直接獲取微生物加固過程演化圖像和滲透系數(shù)隨時間變化的數(shù)據(jù)；通過對圖像進行處理分析研究顆粒尺度的礦物生長、分布規(guī)律。通過試驗后處理可將加固體從微生物加固可視化試驗系統(tǒng)中取出，開展材料表征、力學性質(zhì)分析等微觀試驗，對微生物加固體的微觀性質(zhì)進行進一步分析。

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（編輯??王秀玲）